专利名称：双光子吸收二吡咯亚甲基二氟化硼染料及其应用的制作方法
技术领域：
本发明的领域本发明涉及二吡咯亚甲基二氟化硼染料和这些染料在双光子激发下的应用。另外本发明涉及二吡咯亚甲基二氟化硼染料和其轭合物在基于双光子激发的生物分析中的应用。
本发明的背景本文所用的说明本发明的背景的出版物和其它材料，和尤其是，用于提供关于实践的补充细节的事例在此作为参考并入。
二吡咯亚甲基二氟化硼染料二吡咯亚甲基二氟化硼染料已首次由Treibs和Kreuzer在Liebigs Ann.Chem.718(1968)208和由Wories H.J.等人在Recl.Trav.Chim.Pays-Bas 104(1985)288中描述。自此二吡咯亚甲基二氟化硼染料已找到各种用途。二吡咯亚甲基二氟化硼染料在光谱的可见区域具有强荧光。二吡咯亚甲基二氟化硼染料具有以下的综合性能高量子效率，尖锐的吸收和发射带和高吸收系数。各种各样的二吡咯亚甲基二氟化硼染料目前是市售的(Haugland R.P.，荧光探头和研究化学品手册，第六版，分子探头，Eugene，OR，1996)。这些染料的不同衍生物的合成和荧光性能已在出版物和专利中描述。
US 4,916,711，US 5,189,029，US 5,446,157和EP 0 361936(Morgan和Boyer)描述了二吡咯亚甲基二氟化硼染料在光致荧光的治疗(PDT)中和在产生激光时的应用。根据Morgan和Boyer的描述，二吡咯亚甲基二氟化硼染料具有低三线态-三线态吸收以及低激光作用阈值，能够产生强度高于使用常规激光染料时的激光束。另外这些染料的高光稳定性导致染料材料减少降解。
荧光染料广泛用作示踪剂，通过荧光显微镜检查用于生物结构的定域，通过荧光免疫分析用于分析物的定量，用于细胞的流动血细胞计数分析和用于许多其它场合。
通常这些荧光染料通过共价键连接到生物分子上。为了该连接(标记)，这些染料需要一种官能团，它可与生物分子中的另一官能团反应。常用的反应性官能团包括反应性羧酸酯，酸酐，肼和异硫氰酸盐。US 4,774,339描述了二吡咯亚甲基二氟化硼染料作为荧光标签的用途。根据US 4,774,339，二吡咯亚甲基二氟化硼染料的荧光性能对溶剂或pH不敏感。这些染料还具有窄的吸收和发射带宽度，高量子产率和高光稳定性。
二吡咯亚甲基二氟化硼染料的基本发色团(I)具有吸收和发射最大值约500nm。
二吡咯亚甲基二氟化硼染料的基本发色团二吡咯亚甲基二氟化硼染料的吸收和发射波长通�？赏ü谋浞⑸诺娜〈谋�。π-电子共轭的延长导致发射和吸收带移向较长的波长。π-电子共轭的延长也影响光稳定性，溶解度和荧光量子产率。US 5,274,113，US 5,451,663和WO 93/09185描述了具有吸收最大值525nm-650nm的二吡咯亚甲基二氟化硼标记试剂。吸收和发射波长的这种位移已通过将不饱和有机基团加入发色团而实现。这些专利描述了芳基，杂芳基和链烯基取代基用于延长π-电子共轭路径的用途。
US 5,248,782描述杂芳基取代的二吡咯亚甲基二氟化硼染料和US 5,187,288描述具有吸收最大值550nm-670nm的乙烯基取代的二吡咯亚甲基二氟化硼染料。吸收和发射波长的位移在大多数情况下伴随增加吸收系数和光稳定性。π-电子共轭路径的延长另外由Chen J.等人描述于J.Org.Chem.，65(2000)2900。Chen J.等人描述了具有吸收最大值620-660nm和荧光发射630-680nm的芳基取代的二吡咯亚甲基二氟化硼染料。US 5,433,896描述了包含稠合芳基取代基的二吡咯亚甲基二氟化硼染料。这些二苯并吡咯亚甲基二氟化硼染料具有吸收和发射最大值600nm-740nm。这些染料的摩尔吸收系数最通常超过100 000cm-1M-1。
Wories H.J.等人在Recl.Trav.Chim.Pays-Bas 104(1985)28中描述了一种用于将磺酸基团引入二吡咯亚甲基二氟化硼染料和因此增加这些染料的亲水性的方法。他们报道了具有吸收最大值495nm-491nm，和发射最大值515-510nm的单-和二磺化二吡咯亚甲基二氟化硼染料。
二吡咯亚甲基二氟化硼染料已作为荧光标签用于各种场合。这些染料的合成和多用途已在以上提及的出版物和专利中报道。但这些染料大多数具有固有憎水性，这限制了它们用于生物分子的荧光标记。对于包含芳基取代基的二吡咯亚甲基二氟化硼染料，情况尤其如此。
二吡咯亚甲基二氟化硼染料不仅可用作荧光标记，而且可用作激光染料和在光致荧光的治疗中用作探头用于治疗瘤。这些染料还可用于微颗粒的染色(US 5,723,218)和用作光学记录介质(US6,060,606)。
双光子激发在1931年，Maria Gppert-Mayer(Ann.Phys.9(1931)273)推断，分子可同时吸收两个光子。该现象长期保持没有实际用途，直至可得到强激光源。双光子激发这样产生通过聚焦强光源，单位量和单位时间的光子的密度变得足够高使得双光子同时被吸收到同一的发色团中。吸收的能量是双光子的能量的总和。双光子激发的可能性取决于光子密度的二次幂。双光子的吸收因此是一个二级的非线性过程。一个发色团对两个光子的同时吸收得到处于激发态的发色团。该激发态可通过发射能量高于照射激光光子的光子而松弛。在本文中包括双光子激发和随后辐射松弛的过程称作双光子荧光。双光子荧光具有通常类似于同一发色团的单光子激发荧光的光谱性能(Xu C.和WebbW.W.，J.Opt.Soc.Am.B，13(1996)481)。可用两个同时吸收的光子激发和激发态松弛伴随荧光发射的分子在本文中称作双光子荧光染料。
双光子激发的一个主要特征在于，激发仅在焦点的明显受限的3维(3D)附近进行。该特点来自所产生的荧光发射的高3D空间定域。由于激发的非线性性质，在样品周围和在光学元件中在焦点之外产生最小的本底荧光。双光子激发的另一主要特征在于，照射和发射在基本上不同的波长范围内进行。该性能导致泄露到检测通道中的散射的照射光可容易通过使用低通滤波器而减弱(减弱至少10个数量级)。因为激发量非常�。庾蛹し⒆钍视糜诠鄄煨⊙妨亢徒峁�。
双光子激发的固有性能(低本底和小激发量)表明，双光子激发最适用于需要由少量物质进行荧光检测的场合。实际上双光子激发量是几个毫微微升的量或甚至更低，取决于体系的光学参数。在这种小激发量下，仅少数荧光分子在任何给定时间点上存在。涉及双光子激发技术的固有特点之一是荧光团的低吸收横截面。另一特点是，双光子激发通常进行使用脉冲激光进行，使用常规激光的脉冲间的时间长于荧光团的寿命时间，导致降低的激发速率。这些特点以及小激发量导致较低的信号水平。另一问题涉及可造成意外作用的强照射强度。这些作用可分成两种不同的类型累计多脉冲作用(能量的积聚)和单脉冲作用(二级或更高级的直接非线性吸收)。累计多脉冲作用在使用具有高重复率的脉冲激光(具有重复率约100MHz数量级的亚微微秒脉冲激光)时尤其相关。在这种高重复率下，能量有可能集聚成染料分子的长寿命三线态。三线态通常是非辐射的和因此能量至这些状态的集聚降低了双光子荧光产率。双光子激发效率(Ex2ph)与激光的峰功率(Pp)和脉冲持续时间(τ脉冲)成比例(Ex2ph∝Pp2*τ脉冲)。据此，使用具有高峰功率的脉冲激光和中等重复率(具有kHz重复率的微微秒至纳秒脉冲激光)导致高双光子激发效率。高双光子激发效率在本文中是指，几乎所有的染料分子在激光束的焦点被单个激光脉冲激发。
图1表示相对于照射强度染料分子的双光子激发。在理想情况下，发射对照射强度的曲线与双光子激发对照射强度的曲线重合。通常当照射强度明显低于达到饱和水平所需的强度时情况如此(A，图1)和双光子激发荧光因此遵循照射强度的二次依赖性。在饱和水平(C，图1)或饱和水平附近(B，图1)(在使用高双光子激发效率激光以使双光子激发荧光最大化时)，单脉冲作用变得尤其相关。在这种情况下，激发态吸收和激励发射可降低双光子荧光产率和造成偏离发射相对于照射强度的二次依赖性。根据样品，这些作用的出现可限制最大可用照射强度。
Ehrlich J.E.等人Opt.Lett.22(1997)1843，Baur J.W.等人，Chem.Mater.11(1999)2899和Kim O.-K.等人Chem.Mater.12(2000)284报道，双光子吸收系数可随着测量条件如激光束的强度水平和脉冲持续时间而明显变化。已经指出，如果非常强激光照射用于测量双光子吸收横截面或双光子荧光产率，一些线性过程可发挥作用。这些现象如激发态吸收已被认为是一些荧光团在双光子激发下猝灭的一个原因(Fischer A.等人，Appl.Opt.34(1995)1989)。
Xu C.和Webb W.W.，J.Opt.Soc.Am.B，13(1996)481报道了各种荧光染料的双光子吸收横截面，包括Wories H.J.等人，Recl.Trav.Chim.Pays-Bas 104(1985)288所述的二吡咯亚甲基二氟化硼染料。Xu和Webb研究的这种二吡咯亚甲基二氟化硼染料具有在495nm处的单光子最大吸收和在515nm处的最大发射。双光子激发光谱记录在690和1050nm之间。在该研究中，光源是具有标称脉冲长度80毫微微秒的Ti蓝宝石激光器。根据Xu和Webb，二吡咯亚甲基二氟化硼染料的双光子吸收横截面大约比若丹明B低一个数量级。Xu和Webb没有报道对若丹明B在高强度激光照射下的猝灭的任何观察或发射相对于照射强度的二次依赖性的任何偏差。但若丹明B的猝灭较早由Fischer A.等人报道于Appl.Opt.34(1995)1989。根据Fischer等人，双光子激发中的猝灭作用导致双光子显微镜检查中的较差的三维分辨率。
双光子激发荧光的生物分析应用荧光已在生物分析领域中找到各种用途。使用荧光作为检测方法的免疫分析，DNA-杂化分析和受体结合分析之类的应用已在前30年中被介绍。这些分析在确定样品中的分析物量时利用特定生物亲和性反应。分析物的量可通过监控取决于结合分析物的量的荧光信号而确定。这些分析也可基于通过特定结合反应检测荧光性能的变化。荧光性能的这种变化可以是荧光强度的变化，发射波长的变化，衰变时间的变化或荧光偏振的变化。
免疫分析已广泛用于临床诊断以确定某些疾病或生理状态。免疫分析可分成两种不同类型的分析，竞争和非竞争分析。在竞争方法中，标记抗原(第二生物特异试剂)与分析物竞争地结合到有限量的抗体(第一生物特异试剂)上。分析物的浓度可由连接到抗体上的标记抗原的比例或由标记抗原的游离级分的比例而确定。在非竞争方法(免疫测量方法)中，分析物连接到过量的结合抗体(第一生物特异试剂)上。过量的标记抗体(第二生物特异试剂)结合到分析物的另一位置上。分析物的量可根据结合到分析物上的标记抗体的分数而确定。该分析方法也可分成多相和均相(无分离)方法。结合和游离级分的分离在多相分析中是必需的但在均相分析中不是[Miyai K.，免疫分析的原理和实践，(编者Price C.P.和Newman D.J.)Stockton Press，NewYork 1991，246和Hemmil I.A.，荧光在免疫分析中的应用，(编者Winefordner J.D.)John Wiley & Sons，New York 1991]。
相关于双光子激发的分析应用的早期报道之一由Sepaniak等人公开于Anal.Chem.，49(1977)1554.他们讨论了使用双光子荧光激发用于HPLC检测的可能性。该体系表现出低本底和简便性。
双光子荧光激发在激光扫描显微镜检查中的实用性首次由Denk等人在科学，248(1990)73中证实。他们使用一种模式固定的染料激光器提供重复率80MHz的毫微微脉冲流。Ti蓝宝石激光器的出现便于在标准激光扫描荧光显微镜中实现双光子激发。双光子荧光激发已在过去的十年中得到深入讨论。已出版许多涉及双光子激发荧光-成像技术的研究论文。这种发展还带来了双光子激光扫描显微镜体系的工业生产。
Lakowicz等人，J Biomolec.Screening 4(1999)355已经表明，结合到DNA上的DAPI(4，6-二脒基(diaminidino)-2-苯基吲哚)和钙-依赖性荧光团的时间依赖性强度衰变可用双光子荧光激发测定。Lakowicz等人报道了多光子激发在高产量筛分场合中的应用。他们已经表明，荧光素的双光子诱导荧光能够可靠地在高密度多穴板中测定。
描述于文献的双光子激发荧光的大多数生物分析应用涉及双光子成像显微镜检查(Denk W.等人US 5,034,613，Denk W.等人，科学248(1990)73。双光子荧光激发在激光扫描显微镜检查中的应用提供固有3D空间分辨率而没有使用在共焦显微镜检查中必需的针孔。利用一种简单的光学设计，双光子激发显微镜检查提供与普通单光子激发共焦显微镜检查相当的3D空间分辨率。双光子激发技术的缺点是需要能够产生具有高重复频率的强超短脉冲的昂贵的激光器。
费用较少的激光技术的最新发展对于双光子荧光激发技术在常规生物分析场合中的应用是非常令人鼓舞的(Hnninen P.等人，Nat.Biotechnol.18(2000)548；Soini J.T.等人Single Mol.1(2000)203；WO 98/25143和WO 99/63344)。根据WO 98/25143和WO99/63344，替代昂贵的模式固定激光器，无源Q-切换二极管-泵激微芯片激光器可用于双光子激发。这些激光器是整体的，小的，简单的和低成本的。WO 98/25143和WO 99/63344描述了双光子激发在生物分析方法中的应用。该生物分析方法可用于在溶液或在生物悬浮液中的分析物和它采用微颗粒作为其上连接有第一生物特异试剂的生物亲和性结合固体相。该生物分析方法利用一种标以双光子荧光染料的第二生物特异试剂。根据WO 98/25143和WO 99/63344，将微颗粒与反应量的分析物和第二生物特异试剂接触并使用基于双光子激发的荧光检测，这样成为一种无分离分析方法。结合到第一生物特异试剂和结合到微颗粒上的分析物的量通过源自标记第二生物特异试剂的双光子激发荧光信号而检测。标记第二生物特异试剂可键接到分析物(非竞争，免疫测量方法)或结合到第一生物特异试剂(竞争方法)上。第一和第二生物特异试剂是生物活性分子，如半抗原，生物活性配体，药物，肽，低聚核苷酸，核苷酸，核酸，多肽，蛋白质，抗体，或抗体的片断。根据WO98/25143和WO 99/63344，将具有高双光子激发效率的激光聚焦到反应悬浮液中和双光子激发荧光由单个微颗粒当它们漂浮通过焦点区的激光束时测定。另外微颗�？捎糜爰す馐黄鸫吹墓庋и褰亓粢欢斡饧觳馐奔�。微颗粒至激光束的焦点的束缚作用是基于由照射激光产生到微颗粒上的光学压力。根据WO 98/25143，光学束缚增加了颗粒在激光束焦点的持续时间和减少测量的死时间。根据WO 98/25143，光学束缚需要较高激光器平均功率和照射强度。在这种情况下激光器的平均功率决定了束缚效率。微芯片激光器的重复率是较低的和因此需要使用高脉冲能量和因此高峰功率的照射激光，这样得到足以用于光学束缚的激光器平均功率。高峰功率，和具有高双光子激发效率的激光器的使用可导致双光子激发荧光产率的下降，而且还在无分离分析中由于单脉冲作用而降低信号-本底比率。但实际上通常适当地使用一种具有尽可能高双光子激发效率的激光器以使荧光信号最大化。
本发明的目的和概述本发明的目的是提供一种用于测量来自生物流体或悬浮液的分析物的改进的无分离生物分析方法。
本发明涉及一种由包含微颗粒作为生物亲和性结合固体相，用双光子荧光染料标记的第二生物特异试剂的生物流体或悬浮液测量分析物的无分离生物分析方法，包括将激光聚焦到反应悬浮液中，当单个微颗粒无规漂浮或被激发激光的辐射压力引导通过焦点区的激光束时由其测量双光子激发荧光。双光子荧光染料具有结构(II) 至少一个基团R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7是取代的或未取代的苯基，噻吩基，吡咯基，呋喃基，噁唑基，异噁唑基，氧杂二唑基，咪唑基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，苯并咪唑基，苯并呋喃基，吲哚基，共轭乙烯基，二烯基或三烯基基团，和至少一个基团R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到一种可用于选择共价键接到其它分子上的化学反应性基团，和至少一个基团R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到一种水增溶基团，和剩余的基团R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7分别独立地选自氢，卤素，烷基，氰基，羧基，分别可视需要被取代；或基团R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7是取代的或未取代的烷基基团，R4是氢，或取代的或未取代的烷基，和至少一个基团R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到一种可用于选择共价键接到其它分子上的化学反应性基团和至少一个基团R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到一种水增溶基团。
附图的简要描述图1是双光子激发对照射强度的曲线图。
图2a表示烷基取代的二吡咯亚甲基二氟化硼染料。
图2b和2c表示杂芳基取代的二吡咯亚甲基二氟化硼染料。
图2d表示芳基取代的二吡咯亚甲基二氟化硼染料。
图2e和2f表示苯基乙烯基取代的二吡咯亚甲基二二氟化硼染料。
图2g和2h表示具有不同反应性基团的噻吩基取代的二吡咯亚甲基二氟化硼染料。
图3表示连接剂化合物。
图4是在免疫分析中双光子荧光信号对分析物(AFP)浓度的曲线图。
图5是用于双光子荧光测量的仪器光学方案。
本发明的详细描述用于本申请的术语可定义如下●双光子荧光包括双光子被同时吸收到同一发色团中和随后辐射松弛该激发态的过程。
●双光子荧光染料可用两个被同时吸收的光子激发和激发态松弛伴随有荧光发射的分子。
●累计多脉冲作用由激发能量聚集至长寿命三线态所带来的作用。如果使用具有重复率约100MHz的亚微微秒激光用于双光子激发，该作用造成荧光产率的下降。该作用造成在达到染料的饱和水平之前双光子荧光对照射强度的二次依赖性偏离。
●单脉冲作用由第二或更高级的直接非线性吸收所带来的作用。如果使用具有高脉冲峰功率(Pp)和kHz重复率的微微秒-纳秒标称脉冲长度(τ脉冲)的激光用于双光子激发，该作用造成荧光产率的下降。该作用造成在达到染料的饱和水平之前双光子荧光对照射强度的二次依赖性偏离。
●双光子激发效率每单位时间的激发数。双光子激发效率(Ex2ph，)与激光的峰功率(Pp)和脉冲持续时间(τ脉冲)成比例(Ex2ph∝Pp2*τ脉冲)。
●具有高双光子激发效率的激光能够激发双光子荧光染料接近饱和水平(B，图1)的激光。
●信号-本底比率由颗粒表面上的染料得到的信号和由溶液中的染料得到的信号之间的比率。
●照射强度激光脉冲峰功率/束横截面面积单位。
●平均功率1秒内发射的激光束能量。
●微颗�？捎米骰坊蛏锘返墓烫逑嘣靥宓那蛐位蚍乔蛐喂烫逦�。微颗粒一般被认为是0.01-100μm直径和可由聚合物，玻璃，硅石或其它材料组成。
本发明涉及具有高双光子激发荧光产率和甚至在高强度激光照射下通过单脉冲作用而具有特别低猝灭的双光子吸收荧光团。
本发明提供了可用于无分离生物分析方法的双光子荧光染料，该方法基于使用具有高双光子激发效率的激光。已发现二吡咯亚甲基二氟化硼染料和所述染料的轭合物作为本发明的主题提供了特别高的双光子激发荧光产率。双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料和所述染料的轭合物作为本发明的主题理想地适用于微颗粒基生物分析体系，因为二吡咯亚甲基二氟化硼染料和所述染料的轭合物通过单脉冲作用甚至在光学束缚微颗粒所需的激光器的高平均功率下也具有特别低的猝灭。本发明介绍了尤其适用于标记生物分子的新型双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料。这些双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料是亲水性质的和可溶于水溶液。这些染料在水溶液中的溶解度使得它们理想地适用于生物分析方法。
图1是双光子激发对照射强度的曲线图。在低照射强度(A)下，激发遵循照射强度的二次依赖性。为了使双光子激发荧光最大化，染料应该被激发至接近饱和水平(B)。在饱和水平(C)下，几乎所有的染料分子被激发。图2a给出了作为化合物1-3描述于实施例1-3的烷基取代的二吡咯亚甲基二氟化硼染料。图2b和2c给出了作为化合物4-9描述于实施例4-9的杂芳基取代的二吡咯亚甲基二氟化硼染料。X+是阳离子抗衡离子。图2d给出了作为化合物10和11描述于实施例10和11的苯基取代的二吡咯亚甲基二氟化硼染料。X+是阳离子抗衡离子。图2e和2f给出了作为化合物12和13描述于实施例12和13的苯基乙烯基取代的二吡咯亚甲基二氟化硼染料。X+是阳离子抗衡离子。图2g和2h给出了作为化合物14-17描述于实施例14-17的具有氨基-，芳基氨基-，马来酰亚胺-和异硫氰酸盐反应性基团的噻吩基取代的二吡咯亚甲基二氟化硼染料。X+是阳离子抗衡离子。图3给出了用于增加染料在水溶液中的溶解度的连接剂化合物18.X+是阳离子抗衡离子。图4是在例如描述于实施例21的基于双光子荧光的免疫分析中双光子荧光信号对分析物(AFP)浓度的曲线图。AFP浓度0ng/ml由于用于图4的对数刻度而表示为浓度0.1ng/ml。图5是用于双光子荧光测量的仪器的光学方案。无源Q-切换Nd:YAG微芯片激光器1用作双光子激发荧光的照射源。激光的波长是1064nm，脉冲持续时间是1ns和重复率是20kHz。自然发散的激光束用分色镜2通过光学扫描器单元3导向物镜4的入口孔。在入口孔处的照射是高斯填充约70％的全孔。物镜随后聚焦照射光至具有薄光学底(厚度0.2mm)的特殊比色杯5中。到达样品的平均光学输出功率是50mW。焦点区的大小是约1毫微微升。540-700nm的双光子激发荧光信号由物镜4的全孔收集和通过分色镜2和该带通过滤光片6导向光电倍增管7。在颗粒测量的情况下，测定双光子激发荧光和微颗�：笊⑸�(反射)激光。分色镜2和2％光束分裂窗孔8使后散射光偏斜至针孔9，使散射信号的检测共焦。用于散射信号的检测器是近红外GaAs针(pin)光电二极管10。颗粒通过使用三维束扫描器3而被连续跟踪。xy-扫描器是光机械的和尽可能靠近物镜的入口孔。由于物镜入口孔的部分照射，光束在xy-扫描器的全偏离角下的偏离不会使光束被孔边缘明显切割。如果后散射信号的幅度超过预设的阈值水平，它表示微颗粒出现在焦点区附近且关掉x-和y-扫描器镜。通过照射激光束而产生的光学压力束缚颗粒和将它引导通过激光束焦点的中心。荧光信号在颗粒处于焦点，即后散射信号超过预设阈值时测定。除了xy-扫描，进一步的z-扫描运动通过在轴方向上慢慢移动物镜而进行。该运动的幅度是150μm和运动在颗粒测量时不停止。尽管慢z-扫描，颗粒通过光学束缚力而保持在焦点中。
与具有高双光子激发效率的激光器结合使用的双光子荧光染料必须选择以使得荧光团通过单脉冲作用具有最小猝灭。这样能够激发接近饱和水平的荧光团群和因此使双光子荧光信号最大化。对荧光染料的合适的选择还能够在基于双光子激发的生物分析中利用微颗粒的光学束缚和使用微颗粒作为固体载体，描述于WO 98/25143和WO99/63344。如果使用高重复率激光，单线态-三线态交叉的出现也成为用于选择合适的荧光团的一个重要的参数。对于具有低单线态-三线态交叉率的荧光团，可避免能量至非辐射三线态的聚集。双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料作为本发明的主题满足这两个基本要求。另外，双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料的吸收和发射带的位置可通过对基本发色团的合适的取代而调整。该性能对于调整适用于一种特殊激光的发色团的性能是特别重要的。二吡咯亚甲基二氟化硼染料的荧光量子产率一般超过70％。如果使用具有高双光子激发效率的激光器作为照射源，高量子产率与单脉冲作用下的低猝灭速率一起提供高双光子激发荧光。根据本发明的二吡咯亚甲基二氟化硼染料的双光子激发荧光产率惊人地高。不同于以前发表的数据[Xu C.和Webb W.W.，J.Opt.Soc.Am.B，13(1996)481]，我们已经发现，二吡咯亚甲基二氟化硼染料的双光子激发荧光产率甚至高于若丹明B的双光子激发荧光产率。另外，双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料通过单脉冲作用的最小猝灭使得能够利用具有高双光子激发效率的激光器作为照射源而没有明显损失该体系的3D空间分辨率。双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料也可通过合适的侧链取代而改性以用于水溶液和用于有机介质。
本发明涉及描述于Hnninen P.等人，Nat.Biotechnol.18(2000)548；Soini J.T.等人Single Mol.1(2000)203；WO 98/25143和WO99/63344的生物分析方法。本发明提供的双光子荧光染料在与描述于Hnninen P.等人，Nat.Biotechnol.18(2000)548；Soini J.T.等人Single Mol.1(2000)203；WO 98/25143和WO 99/63344的生物分析方法结合时提供高分析性能。双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料和所述染料的轭合物作为本发明的主题可用于基于使用与高双光子激发效率的激光器的无分离生物分析方法而没有信号-本底比率的任何明显下降。
根据本发明，第二生物特异试剂被标以双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料。第二生物特异试剂是生物活性分子，如半抗原，生物活性配体，药物，肽，低聚核苷酸，核苷酸，核酸，多肽，蛋白质，抗体，或抗体的片断。标以双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料的第二生物特异试剂可结合到分析物(非竞争分析)或结合到第一生物特异试剂(竞争结合分析)上。连接到微颗粒的第一生物特异试剂上的分析物的量通过源自标以双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料的第二生物特异试剂的双光子激发荧光信号检测。
增加颗粒在激光束焦点的持续时间和减少测量的死时间的光学束缚(描述于WO 98/25143)需要较高的激光平均功率。具有低脉冲频率的高平均功率导致高脉冲能量，这可导致荧光通过单脉冲作用而猝灭。根据本发明，双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料理想地适用于基于生物分析体系的微颗粒。这些染料甚至在微颗粒光学束缚所需的高激光平均功率下也通过单脉冲作用而具有特别低的猝灭。
双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料和所述染料的轭合物作为本发明的主题也可用于基于监控未连接生物特异试剂的双光子激发荧光的无分离生物分析方法。第一生物特异试剂连接到微颗粒上或在比色杯的壁上。标以双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料的第二生物特异试剂可结合到分析物(非竞争分析)或结合到第一生物特异试剂(竞争连结分析)上。通过第一生物特异试剂连接到微颗粒上或比色杯的壁上的分析物的量根据源自标以双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料的未连接第二生物特异试剂的双光子激发荧光信号而确定。
双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料作为本发明的目标具有以下的一般结构(II)。
在该结构中，R1，R2，R3，R4，R5，R6和R7选自单独或组合形式的取代基氢，卤素，烷基，环烷基，链烯基，芳基链烯基，芳基，烷基芳基，杂芳基，酰基，烷氧基，氰基，羧基，氨基，羟基，烷氧基羰基，硝基，烷基氨基，二烷基氨基和磺基。另外，发色团上的取代基可进一步改性以提供化学反应性官能团。可用于选择共价键接到其它分子上的化学活性基团包括但不限于羧酸的衍生物，羧酸反应性酯，羧酸酸酐，马来酰亚胺，磺酰氯，磺酰基氟，肼，胺，醇，酰基叠氮化物，异氰酸酯，醛，卤代乙酰胺，三嗪或异硫氰酸盐。
如果调节适用于一种特殊激光的基本发色团的性能，可用于将吸收和发射移动至较长的波长的取代基是特别重要的。例如，在用Nd:YAG激光在波长1064nm下的双光子激发中，荧光发射带应该超过532nm(两个1064nm光子的能量的总和)。将二吡咯亚甲基二氟化硼基本发色团的吸收和发射带移向较长的波长的一种便利方法是延长π-电子共轭。这可例如通过将不饱和有机基团加入基本发色团而进行。据此，本发明的优选的化合物具有一种结构，其中至少一种取代基R1，R2，R3，R4，R5，R6和R7选自苯基，噻吩基，吡咯基，呋喃基，噁唑基，异噁唑基，氧杂二唑基，咪唑基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，苯并咪唑基，苯并呋喃基，吲哚基，共轭乙烯基，二烯基，三烯基，和视需要被一种或几种取代基取代的任何前述基团。任选的取代基优选选自卤素，羟基，烷氧基，氰基，硝基，羧基，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，磺基和可包含杂原子，取代的杂原子或含侧链杂原子的优选包含1-10个碳的直链或支化烷基。剩余的取代基R1，R2，R3，R4，R5，R6和R7分别独立地选自氢，卤素，烷氧基，氰基，羧基烷氧基羰基，硝基，烷基氨基，二烷基氨基，磺基和可包含杂原子，取代的杂原子或含侧链杂原子的优选包含1-10个碳的直链或支化烷基。最优选的化合物是其中R1是取代的或未取代的苯基，噻吩基，吡咯基或苯基乙烯基；R2，R3和R4是氢；R5，R6和R7分别独立地是氢，烷基或取代的烷基的那些。
根据本发明的优选的化合物也可具有一种结构，其中至少一种取代基R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7是-YZ，其中-Y-是连接剂单元和Z是可用于将发色团共价偶联到其它分子，如生物分子上的化学反应性基团。连接剂单元-Y-是共价键或C1-C20直链或支化亚烷基，亚芳基，亚烷芳基，亚芳烷基基团或这些的组合。连接剂单元-Y-也可包含杂原子，取代的杂原子或含杂原子的侧链，或环状残基。连接剂单元-Y-也可包含聚合物的残基，优选聚合物如多肽，多糖，聚核苷酸，聚醚或其它的残基或由它们组成。剩余的取代基R1，R2，R3，R4，R5，R6和R7分别独立地选自取代基如氢，卤素，烷基，环烷基，链烯基，链烯基芳基，芳基，芳基烷基，杂芳基，酰基，烷氧基，氰基，羧基，氨基，羟基，烷氧基羰基，硝基，烷基氨基，二烷基氨基和磺基，和视需要被取代。
优选的取代基定义如上。
二吡咯亚甲基二氟化硼染料一般可溶于有机溶剂。
尤其具有芳基取代基的二吡咯亚甲基二氟化硼染料是憎水性质的和不溶于水溶液。但水溶性通常是生物分析场合所需要的。荧光标记对水溶液的亲水性和溶解度在减少未特定粘结，保持标记在标记生物分子中的光物理性能和保留标记生物分子的生物性能方面通常是必要的。
水溶性可通过将合适的水增溶基团加入基本发色团而得到。水增溶基团优选包含磺酸或羧酸的铵或碱金属盐，铵或羟基基团。水溶性也可通过将肽或碳水化合物部分加入染料而得到。
据此，本发明的优选的化合物具有一种结构，其中吸收和发射带被适当调节，该化合物包含可用于将该化合物共价偶联到其它分子上的反应性侧链和该化合物还包含能增加在水溶液中的溶解度的基团。据此，本发明的优选的化合物具有这样的结构，其中至少一个基团R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7是取代的或未取代的苯基，噻吩基，吡咯基，呋喃基，噁唑基，异噁唑基，氧杂二唑基，咪唑基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，苯并咪唑基，苯并呋喃基，苯基乙烯基或吲哚基；和至少一个基团R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到可用于选择共价键接到其它分子上和/或用于进一步化学改性的化学反应性基团；和至少一个基团R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到水增溶基团。据此，最优选的化合物具有这样的结构，其中R1是取代的或未取代的苯基，噻吩基，吡咯基或苯基乙烯基，R2，R3，R4和R5分别独立地是氢或烷基，R6或R7是取代基，最优选具有式 其中X+是阳离子，和剩余的取代基R6或R7是氢或烷基。本发明的优选的化合物也可具有这样的结构，其中基团R1，R2，R3，R5，R6和R7是取代的或未取代的烷基，R4是氢或取代的或未取代的烷基；和至少一个基团R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到可用于选择共价键接到其它分子上和/或用于进一步化学改性的化学反应性基团；和至少一个基团R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到水增溶基团。优选的取代基定义如上。是水溶性的和因此尤其适用于标记生物分子的双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料的例子在实施例3和8-17中给出。这些双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料是水溶性的和它们甚至在用高双光子激发效率激光照射时也通过单脉冲作用而具有特别低的猝灭。
按照本发明的双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料可与生物特异分子偶联得到双光子荧光轭合物。该生物特异分子是生物活性分子，如半抗原，生物活性配体，药物，肽，低聚核苷酸，核苷酸，核酸，多肽，蛋白质，抗体，或抗体的片断。双光子荧光轭合物可用于生物分析体系，其中特定信号通过所述轭合物的双光子激发荧光而得到。按照本发明的双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料和轭合物也可用于细胞和组织的染色。
以下非限定性实施例用于进一步说明本发明。在以下实施例中，所提及的化合物(化合物1-18)公开于图2a-2h和3。
实施例13，3′，5，5′-四甲基-4，4′-羧基乙基-2，2′-二吡咯基亚甲基溴化氢(1)2-乙氧基羰基-3，5-二甲基-4-甲氧基羰基乙基吡咯(1.0g，3.35mmol)溶解在甲酸(3ml)中和加入氢溴酸(48％，3ml)。反应混合物在100℃下搅拌2.5h。在混合物冷却至室温之后，它在室温下放置过夜。产物由反应混合物结晶成小的，橙色，针状晶体。过滤反应混合物并将结晶产物用水洗涤。
产物(化合物1)在真空干燥器中干燥。产量是677mg(84％)。附加量(43mg)的产物由滤液在+4℃下放置2天之后得到。总产量是720mg(86％)。
2-乙氧基羰基-3，5-二甲基-4-甲氧基羰基乙基吡咯如Bul lock E.等人，J.Chem.Soc.(1958)1430所述而制备。
实施例24，4-二氟-1，3，5，7-四甲基-4-硼杂-3a，4a二氮杂-s-indacene-2，6-二丙酸(2)二吡咯基亚甲基溴化氢(化合物1)(500mg，1.17mmol)悬浮在氯仿(20ml)中和加入三乙胺(4.3ml，31mmol)。起始二吡咯基亚甲基溴化氢在三乙基胺加入(4.3ml，31mmol)之后立即溶解。加入三氟化硼乙醚合物(5ml，31mmol)。反应混合物在室温下搅拌2.5h。反应混合物用氯仿(50ml)稀释，用稀HCl(5％，30ml)和水(30ml)洗涤。
加入少量(5％)乙醇以进行有效萃取。
氯仿相在旋转蒸发器中蒸发至干燥和产物(化合物2)由乙醇/水(7天，在+4℃)沉淀得到棕色-橙色粉末。在产物(化合物2)在真空干燥器中干燥之后，产量是420mg(92％)。
1HNMR(JEOL JNM-LA400，DMSO-d6，400MHz，δppm)2.19(s，6H，2x-CH3)，2.29(t，4H，2x-CH2-)，2.38(s，6H，2x-CH3)，2.57(t，4H，2x-CH2)，7.53(s，1H，Ar-CH＝).
实施例34，4-二氟-1，3，5，7-四甲基-6-羧基乙基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亚胺基酯(3)4，4′-二氟-1，3，5，7-四甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2，6-二丙酸(化合物2)(102mg，0.26mmol)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(2.5ml，干)中。加入N-羟基琥珀酰亚胺(90mg，0.78mmol)和N，N′-二环己基碳二亚胺(54mg，0.26mmol)。反应混合物在室温下搅拌24h。N，N-二甲基甲酰胺蒸发(5mbar，40-50℃)和产物用柱色谱法使用硅石作为固定相和二氯甲烷∶丙酮∶乙酸(100∶8∶1，v∶v∶v)作为洗脱剂进行纯化。包含所需单-琥珀酰亚胺基酯(化合物3)的级分合并和蒸发至干燥。将残余物溶解到少量二氯甲烷中。加入石油醚(bp40-60℃)以沉淀该产物。将溶液过滤并得到作为橙色固体的沉淀产物(化合物3)。产量50mg(39％)。
1HNMR(JEOL JNM-LA400，DMSO-d6，400MHz，δppm)2.21(s，3H，CH3)，2.22(s，3H，CH3)，2.36(t，2H，-CH2-)，2.40(s，3H，CH3)，2.41(s，3H，CH3)，2.59(t，2H，-CH2-)，2.72(t，2H，-CH2-)，2.80(s，4H，2x-CH2-)，2.85(t，2H，-CH2-)，7.60(s，1H，Ar-CH＝)UV-VIS(Ocean Optics SD2000，MeOH)λmax＝523nm(ε＝91 000).
实施例44，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸甲基酯(4)。
2-甲酰基-5-(2-噻吩基)吡咯(150mg，0.84mmol)和2，4-二甲基-3-羧基乙基吡咯(140mg，0.84mmol)溶解在二氯甲烷∶甲醇(10∶1，30ml)中。加入磷酰氯(77μl，0.84mmol)并将溶液在室温下搅拌18h。反应混合物蒸发至干燥并将残余物溶解在二氯甲烷(150ml)中。加入N-乙基-N，N-二异丙基胺(1.44ml，8.4mmol)和三氟化硼乙醚合物(1.06ml，8.4mmol)。强橙色荧光在加入三氟化硼乙醚合物之后立即观察到。反应混合物用水洗涤，用硫酸钠干燥并蒸发至干。粗产物用柱色谱法使用硅石作为固定相和二氯甲烷作为洗脱剂进行纯化。汇集包含所需产物的级分并蒸发至干，得到304mg(93％)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸甲基酯(化合物4)。
1HNMR(Bruker AM200，CDCl3，200MHz，δppm)2.21(s，3H，Ar-CH3)，2.47(t，2H，-CH2-)，2.59(s，3H，Ar-CH3)，2.74(t，2H，-CH2-)，3.68(s，3H，-COOCH3)，6.70(d，1H，ArH)，6.91(d，1H，ArH)，7.05(s，1H，Ar-CH＝)，7.15(d，1H，ArH)，7.40(d，1H，ArH)，8.04(d，1H，ArH).FAB-MSMH+389.UV-VIS(Ocean OpticsSD2000，MeOH)λmax＝560nm(ε＝82 000).
2-(2-噻吩基)吡咯根据Kruse C.G.等人，杂环26(1985)3141制备和根据Bul lock E.等人J.Chem.Soc.(1963)2326甲酰基化得到2-甲酰基-5-(2-噻吩基)吡咯。
2，4-二甲基-3-羧基乙基吡咯制备如下2-乙氧基羰基-3，5-二甲基-4-甲氧基羰基乙基吡咯(1.5g，5.9mmol)和氢氧化钾(6.6g)溶解在亚乙基二醇(50ml)中。反应混合物在氮气氛下回流(190℃)3h。加入水(10ml)并将混合物另外回流2h。冷却的反应混合物用水(200ml)稀释，用浓盐酸酸化和用二乙醚萃取。汇集有机提取物，用硫酸钠干燥和蒸发至干。产物用柱色谱法使用硅石作为固定相和二氯甲烷∶甲醇(10∶1，v∶v)作为洗脱剂进行纯化。汇集包含产物的级分并蒸发至干，得到720mg(72％)2，4-二甲基-3-羧基乙基吡咯。
实施例54，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸(5)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸甲基酯(化合物4)(107mg，0.27mmol)溶解在四氢呋喃∶水(3∶2，50ml)中。加入磷酸(85％，3ml)并将混合物回流5天。反应混合物用水稀释并将产物用二氯甲烷萃取。有机相用硫酸钠干燥并蒸发至干。粗产物用柱色谱法使用硅石作为固定相和二氯甲烷∶甲醇(10∶1)作为洗脱剂进行纯化。汇集包含所需产物的级分并蒸发至干。产物由二氯甲烷∶石油醚结晶，得到68mg(66％)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸(化合物5)。
1HNMR(Bruker AM200，DMSO-d6，200MHz，δppm)2.22(s，3H，Ar-CH3)，2.40(t，2H，-CH2-)，2.51(s，3H，Ar-CH3)，2.63(t，2H，-CH2-)，6.80(d，1H，ArH)，7.11(d，1H，ArH)，7.19(dd，1H，ArH)，7.69(s，1H，Ar-CH＝)，7.73(d，1H，ArH)，7.88(d，1H，ArH).
实施例64，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亚胺基酯(6)。
4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸(化合物5)(57mg，0.15mmol)溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中。加入N，N′-二环己基碳二亚胺(47mg，0.23mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(52mg，0.45mmol)并将混合物在室温下搅拌20h。反应混合物用二氯甲烷稀释并将沉淀的N，N′-二环己基脲过滤出来。滤液蒸发至干并将产物用柱色谱法使用硅石作为固定相和二氯甲烷∶丙酮∶乙酸(100∶8∶1，v∶v∶v)作为洗脱剂进行纯化。将包含产物的级分合并并蒸发至干。
产物在真空干燥器中进-步干燥，得到35mg(75％)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亚胺基酯(化合物6)。
1HNMR(Bruker AM200，CDCl3，200MHz，δppm)2.23(s，3H，Ar-CH3)，2.61(s，3H，Ar-CH3)，2.74-2.82(2t，4H，2x-CH2-)，2.86(s，4H，-CH2-)6.72(d，1H，ArH)，6.93(d，1H，ArH)，7.08(s，1H，Ar-CH＝)，7.15(dd，1H，ArH)，7.41(d，1H，ArH)，8.06(d，1H，ArH)实施例74，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-衍生物(7)。
4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亚胺基酯(化合物6)(35mg，0.074mmol)和Glu-Tau-连接剂(化合物18)(19mg，0.074mmol)溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺(1ml)中。加入无水三乙基胺(31μl，0.22mmol)并将反应混合物在室温下搅拌30min。反应混合物在减压下蒸发至干。粗产物无需进一步纯化就使用。
MS(质谱)(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基质，负模式)计算609(M-1)，结果609(M-1)实施例84，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4 a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亚胺衍生物(8)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸(化合物7)的Glu-Tau-衍生物(0.074mmol)溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺(2ml)中。加入N，N′-二环己基碳二亚胺(46mg，0.22mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(26mg，0.22mmol)并将混合物在室温下搅拌48h。将沉淀的N，N′-二环己基脲过滤出来并将滤液蒸发至干。产物在真空干燥器中进一步干燥且无需进一步纯化就使用。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基质，负模式)计算706(M-1)，结果706(M-1)实施例94，4-二氟-5-(2-吡咯基)-1，3-二甲基-4硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亚胺衍生物(9)4，4-二氟-5-(2-吡咯基)-1，3-二甲基-4硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亚胺衍生物(化合物9)使用描述于实施例7和8的相同方法使用4，4-二氟-5-(吡咯基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亚胺基酯作为起始化合物制成。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基质，负模式)计算689(M-1)，结果689(M-1)实施例104，4-二氟-5-苯基-1，3-二甲基4-硼杂3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亚胺衍生物(10)4，4-二氟-5-苯基-1，3-二甲基-4-硼杂3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亚胺衍生物(化合物10)使用描述于实施例7和8的相同方法使用4，4-二氟-5-苯基-1，3-二甲基4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亚胺基酯作为起始化合物制成。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基质，负模式)计算700(M-1)，结果700(M-1)实施例114，4-二氟-5-(4-甲氧基苯基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亚胺衍生物(11)4，4-二氟-5-(4-甲氧基苯基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亚胺衍生物(化合物11)使用描述于实施例7和8的相同方法使用4，4-二氟-5(4-甲氧基苯基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亚胺基酯作为起始化合物制成。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基质，负模式)计算730(M-1)，结果730(M-1)实施例124，4-二氟-5-苯乙烯基-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亚胺衍生物(12)4，4-二氟-5-苯乙烯基-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亚胺衍生物(化合物12)使用描述于实施例7和8的相同方法使用4，4-二氟-5-苯乙烯基-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亚胺基酯作为起始化合物制成。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基质，负模式)计算726(M-1)，结果726(M-1)实施例134，4-二氟-5-(4-甲氧基苯乙烯基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亚胺衍生物(13)4，4-二氟-5-(4-甲氧基苯乙烯基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亚胺衍生物(化合物13)使用描述于实施例7和8的相同方法使用4，4-二氟-5-(4-甲氧基苯乙烯基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸琥珀酰亚胺基酯作为起始化合物制成。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基质，负模式)计算756(M-1)，结果756(M-1)实施例14
4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-氨基衍生物(14)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亚胺衍生物(化合物8)(0.062mmol)溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中。加入三乙基胺(26μl，0.185mmol)和乙二胺(42μl，0.62mmol)，并将混合物在室温下搅拌30min。反应混合物蒸发至干并将产物从二氯甲烷-四氯化碳中沉淀。产物(化合物14)在真空干燥器中进一步干燥且无需进一步纯化就使用。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基质，负模式)计算651(M-1)，结果651(M-1)实施例154，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-芳基氨基衍生物(15)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-琥珀酰亚胺衍生物(化合物8)(0.074mmol)溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中。加入三乙基胺(31μ1，0.22mmol)和4-(2-氨基乙基)苯胺(15mg，0.11mmol)并将混合物在室温下搅拌3h。反应混合物蒸发至干并将产物从二氯甲烷/四氯化碳中沉淀。产物(化合物15)在真空干燥器中进一步干燥且无需进一步纯化就使用。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基质，负模式)计算727(M-1)，结果727(M-1)实施例164，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-异硫代氰酸根合衍生物(16)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-芳基氨基衍生物(化合物15)(0.048mmol)溶解在丙酮(9ml)和NaHCO3(9ml，水溶液，饱和)的混合物中。加入硫光气(183μl，2.4mmol)并将混合物在室温下搅拌1.5h。反应混合物用水(50ml)和二氯甲烷(50ml)稀释。水相用二氯甲烷(40ml)洗涤两次。含水相的产物用苯酚(2*20ml)萃取。含苯酚相的产物用水(40ml)洗涤和用二乙基醚(200ml)稀释。苯酚/二乙基醚相用水(4*30ml)萃取并将合并的水相用二乙基醚(30ml)洗涤两次。含水相的产物蒸发至干和产物从二氯甲烷-四氯化碳中沉淀。产物(化合物16)在真空干燥器中进一步干燥和储存。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基质，负模式)计算769(M-1)，结果769(M-1)实施例174，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-马来酰亚胺衍生物(17)4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-1，3-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-indacene-2-丙酸的Glu-Tau-氨基衍生物(化合物14)(0.015mmol)溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺(3ml)中。加入三乙基胺(2.1μl，0.015mmol)和N-琥珀酰亚胺基4-马来亚氨基丁酸酯(3.2mg，0.020mmol)并将混合物在室温下搅拌2h。反应混合物蒸发至干并将产物从二氯甲烷/四氯化碳中沉淀。产物(化合物17)在真空干燥器中进一步干燥和储存。
MS(Voyager DE-PRO，MALDI TOF，PerSeptive Biosystems，α-氰基-4-肉桂酸基质，负模式)计算816(M-1)，结果816(M-1)实施例18Glu-Tau连接剂(18)谷氨酸衍生物，BOC-Glu(OtBu)-OSu(Nova Biochem，500mg，1.25mmol)溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中。向三乙胺(1.20ml，8.75mmol)在水(10ml)中的溶液溶解牛磺酸(782mg，6.25mmol)。将牛磺酸溶液加入BOC-Glu(OtBu)-Osu的溶液和反应混合物在室温下搅拌30min。加入乙醇并将沉淀的牛磺酸过滤出来和将滤液蒸发至干。残余物溶解在三氟乙酸(2ml)中和在室温下搅拌2h。反应混合物蒸发至干并将残余物溶解在二氯乙烷甲醇中。产物(化合物18)通过甲醇在旋转蒸发器中的缓慢蒸发而沉淀为白色固体。所需Glu-Tau连接剂(化合物18)以64％产率(204mg)得到。
MS(ZABSpec-oaTOF，Fisons仪器，甘油基质)计算255(M+1)，结果255(M+1)。
实施例19使用具有高双光子激发效率的激光器测量所选双光子荧光染料的双光子荧光产率双光子荧光产率使用图5示意给出的实验装置测定。若丹明B(Eastman Kodak)由于其表征良好的荧光性能而选择为参比。名为BODIPY 530/550，BODIPY 558/568和BODIPY 564/576的三种二吡咯亚甲基二氟化硼染料以及R-藻红素(R-PE)购自Molecular Probes。所有的有机染料溶解在N，N-二甲基甲酰胺中和用无水乙醇稀释至浓度100nM。原料溶液R-PE用磷酸盐缓冲盐水(50/150mM，pH7.4)稀释。结果汇总于表1。结果被标准化为若丹明B(100)的信号。从表1可以看出，二吡咯亚甲基二氟化硼染料的荧光产率与若丹明B的荧光产率处于相同的数量级。二吡咯亚甲基二氟化硼染料的高荧光产率使得它们成为若丹明型染料的一种有吸引力的替代物。R-藻红素具有本文所述染料中的最高荧光产率。但R-PE的实用性由于大尺寸而受到限制。R-PE的选择活化的复杂性也限制其作为标记的应用。
表1所选双光子荧光染料的双光子荧光产率荧光染料 标准化双光子荧光产率[a.u.]二吡咯亚甲基二氟化硼染料化合物3 18化合物8 219BODIPY 530/550 66BODIPY 558/568 101BODIPY 564/576 128若丹明B 100R-PE 618实施例20
鼠IgG抗AFP用双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料3标记向1.5mg(9.3nmol)鼠IgG抗AFP(克隆A)在400μl磷酸盐缓冲盐水(10/150mM，pH7.4)中加入在无水N，N-二甲基甲酰胺(25μl，c＝7.5mM)中的20倍过量的化合物3。加入40μl NaHCO3(1M，aq)并将混合物在室温下保温2h。产物用NAP-5凝胶过滤柱(Amersham PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)使用磷酸盐缓冲盐水(50/150，10mMNaN3，pH7.4)作为洗脱剂纯化。收集快速移动橙色级分并用分光光度法测定标记度。得到5个荧光团/蛋白质的标记度。
实施例21R-PE，Alexa 532(Molecular Probes)和二吡咯亚甲基二氟化硼染料(3)在微颗粒基免疫分析中的比较模型分析是一种无分离免疫测量分析，采用3.1μm氨基-改性的聚苯乙烯微颗粒(氨基改性的微球PAOSN，Bangs Laboratories，Inc.，Fishers，IN，U.S.A.)作为固相。鼠单克隆抗AFP IgG Fab的片段(克隆B)通过使用杂双官能ε-马来亚氨基己酰氧基琥珀酰亚胺连接剂而共价偶联到微颗粒上。抗AFP涂覆微颗粒的原料悬浮液用TRIS pH8.0分析缓冲剂稀释至颗粒浓度为0.05％。鼠单克隆IgG抗AFP(克隆A)被标以二吡咯亚甲基二氟化硼染料(化合物3)，Alexa 532(MolecularProbes，Eugene，Oregon)或标以R-PE(Molecular Probes，Eugene，Oregon)和用作示踪剂。示踪剂用分析缓冲剂稀释至最终浓度1.58nM(化合物3)，1.45nM(Alexa 532)和0.78nM(R-PE，MolecularProbes)。将5μl微颗粒悬浮液和10μl示踪剂与10μlα-1-胎儿球蛋白标准(X0900，Dako A/S，Denmark)混合在一起。反应混合物是在37℃保温2小时和在同一反应比色杯中使用图5示意给出的实验装置测定。结果汇总于表2和图4。
示踪剂浓度根据每种示踪剂独立地优化。二吡咯亚甲基二氟化硼示踪剂得到最低的本底信号，即使它的使用浓度高于R-PE或Alexa532示踪剂。分析本底信号在分析灵敏度方面是重要的。本底信号的最基本来源是标记抗体(示踪剂)在反应悬浮液中的游离级分。三种不同的示踪剂的本底水平在表2和在图4中给出。这些结果清楚地表明，最佳的信号-本底比率在用二吡咯亚甲基二氟化硼标记示踪剂时得到。另外，如果将分析结果与溶液测量的结果(实施例19，表1)比较，可以看出R-PE和化合物3之间的双光子荧光信号比率已明显改变。
在溶液测量(表1)中，R-PE化合物3的信号比率是34(618/18＝34)，对R-PE有利，而在颗粒测量(表2)中该比率是仅3.2(25.6/8＝3.2)，对R-PE有利。
表2在无分离AFP免疫分析中由微颗粒的表面测定的双光子荧光(TPF)信号。零AFP浓度的信号主要源自溶液中的游离示踪剂(＝本底信号)AFP浓度 TPF信号TPF信号 TPF信号[ng/ml] (R-PE示踪剂) (Alexa 532示踪剂) (化合物3示踪剂)01.80 0.720.5012.75 1.350.7123.10 1.401.0054.20 2.401.5010 6.90 3.502.0050 25.6 12.08.00200 61.0 20.018.0500 64.0 22.038.0实施例22单脉冲作用的测量难以直接测量通过单脉冲作用而产生的猝灭。但它可间接地通过测定染料溶液中的轴向分辨率而测定。深度组分(z-响应)最容易改变分辨率。z-响应通过使用描述于图5的仪器测定。图5冲的样品比色杯被替换为一对显微镜载片。染料溶液放在这两个显微镜载片之间。随着染料溶液样品慢慢移向焦点，记录升高的信号的斜率。最大信号出现在焦点区完全覆盖样品时。记录各种染料的20％-80％荧光强度距离并在表3中给出。二吡咯亚甲基二氟化硼染料的20％-80％荧光强度距离值小于R-藻红素或若丹明B的同一值。因此，二吡咯亚甲基二氟化硼染料在使用具有高双光子激发效率的激光器的双光子激发体系中提供比若丹明或R-PE更好的空间分辨率和更好的信号-本底比率。该结果与描述于实施例21的微颗粒测量的结果非常一致。
表3所选双光子荧光染料的双光子20％-80％荧光强度距离值。
荧光染料 20％-80％荧光强度距离值[a.u.]二吡咯亚甲基二氟化硼染料化合物3 11.5化合物8 12.6BODIPY 530/550 12.2BODIPY 558/568 13.7BODIPY 564/576 14.1若丹明B 16.5R-PE 21.5实施例23低聚核苷酸用化合物6和用化合物8标记向5′-氨基改性的低聚核苷酸(17 bases(盐基)，28μg，5nmol)在碳酸盐缓冲剂(200μl，100mM，pH8.5)中的溶液加入在无水DMF(50μl)中的40倍过量的标记试剂(化合物6或8)。反应混合物在22℃下保温20h。标记低聚核苷酸通过使用反相HPLC(RP-18柱)和梯度洗脱技术纯化。溶剂是A在三乙基乙酸铵缓冲剂(50mM，pH7)中的2％乙腈和B在三乙基乙酸铵缓冲剂(50mM，pH7)中的70％乙腈。梯度从5％溶剂B开始和溶剂B的量在25分钟内线性地升至40％。染料-低聚核苷酸轭合物(标以化合物6或化合物8)在18-22分钟内被洗脱，而未标记低聚核苷酸在10分钟的时间点被洗脱。未键接标记试剂通过增加溶剂B的量至100％从柱中去除。
标记低聚核苷酸的浓度用分光光度法测定。得到标记产率25％(化合物6)和20％(化合物8)。标记低聚核苷酸被稀释至等摩尔浓度和荧光产率通过单和双光子激发技术测定。结果，标以化合物8的低聚核苷酸的荧光产率与标以化合物6的低聚核苷酸相比结果高一个数量级。相同的结果通过单-和双光子激发技术得到。标以化合物8的低聚核苷酸的较高荧光产率可解释为标记化合物的亲水性增加以及标记和低聚核苷酸之间距离增加。
实施例24鼠IgG抗AFP用荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料(6和8)标记。
向0.2mg(1.25nmol)鼠IgG抗AFP(克隆A)在40μl磷酸盐缓冲盐水(10/150mM，pH7.4)中的溶液加入在无水N，N-二甲基甲酰胺中的5倍过量(6.25nmol)的化合物6或化合物8。加入4μl NaHCO3(1M，aq)并将混合物在室温下保温3h。产物用NAP-5凝胶过滤柱(AmershamPharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)使用磷酸盐缓冲盐水(50/150，10mM NaN3，pH7.4)作为洗脱剂纯化。收集快速移动着色级分。用分光光度法测定这些蛋白质轭合物(化合物6和8)的标记度。得到2.3(化合物6)和2.5(化合物8)荧光团/蛋白质的标记度。
实施例25标以化合物6和化合物8的抗体示踪剂在微颗粒基免疫分析中的比较AFP分析通过使用3.2μm羧基改性的聚苯乙烯微颗粒(羧基改性的微球PC05N，Bangs Laboratories，Inc.，Fishers，IN，U.S.A.)作为固相而进行。鼠单克隆抗AFP IgG(克隆B)通过使用EDAC(1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺)偶联方法(TechNote#205，BangsLaboratories，Inc.，Fishers，IN，U.S.A.)共价偶联到微颗粒上。抗AFP涂覆微颗粒的原料悬浮液用TRIS pH8.0分析缓冲剂稀释至颗粒浓度1.5·107颗粒/ml。鼠单克隆IgG抗AFP(克隆A)被标以二吡咯亚甲基二氟化硼染料(化合物6或8)和用作示踪剂。示踪剂用分析缓冲剂稀释至浓度16nM。将5μl微颗粒悬浮液和5μl示踪剂与10μlα-1-胎儿球蛋白标准物(X0900，Dako A/S，Denmark)混合在一起。反应混合物在37℃下保温2小时和在同一反应比色杯中使用图5示意给出的实验装置中测定。结果汇总于表4和5。
表4使用标以化合物6的示踪剂的AFP免疫分析。所有的浓度点由6个平行样品测定。
2PF-信号AFP浓度(6个平行测量 标准偏差变异系数信号-本底[ng/ml]的平均值) SD (％)CV (S-S0)0 6.03 9.03149.66 0.000.13.02 0.6722.26 -3.011 6.63 5.1477.46 0.605 12.74 3.2825.71 6.7110 18.18 3.6319.96 12.1520 45.01 7.8317.40 38.98100141.46 23.13 16.35 135.43400249.48 27.66 11.09 243.451000 260.98 31.94 12.24 254.95分析的灵敏度通常通过计算平行样品在零分析物浓度下的信号的标准偏差(SD)而确定。给出的信号大于3SD(在零分析物浓度的标准偏差乘以因子3)的分析物的最低浓度一般用于确定分析的灵敏度。
分析的灵敏度受到例如描述于实施例21的本底信号(信号-本底比率)和受到测量的重复能力的极大影响。
表5使用标以化合物8的示踪剂的AFP免疫分析。所有的浓度点由6个平行样品测定。
2PF-信号AFP浓度(6个平行测量标准偏差变异系数 信号-本底[ng/ml]的平均值) SD (％)CV(S-S0)0 5.110.28 5.46 0.000.15.880.26 4.47 0.771 7.050.35 5.00 1.945 13.36 0.79 5.95 8.2510 20.65 1.52 7.38 15.5420 39.37 3.80 9.66 34.26100140.33 20.2514.43135.23400274.69 16.796.11 269.581000 333.22 12.453.74 328.12在表4和5中给出的结果清楚地表明，标以亲水二吡咯亚甲基二氟化硼染料(化合物8)的示踪剂提供更灵敏的分析。两种示踪剂之间在3SD值上的差异惊人地大，超过一个数量级(3SD化合物8＝0.84对3SD化合物6＝27)。这意味着，标以亲水二吡咯亚甲基二氟化硼染料(化合物8)的示踪剂提供比标以憎水二吡咯亚甲基二氟化硼染料(化合物6)的示踪剂好一个数量级的分析灵敏度。平均上，这两种示踪剂得到的响应取决于分析物浓度，而标以亲水二吡咯亚甲基二氟化硼染料(化合物8)的示踪剂具有稍高的信号水平。另外，标以亲水二吡咯亚甲基二氟化硼染料(化合物8)的示踪剂与标以憎水染料(化合物6)的示踪剂相比在整个分析范围内提供明显较小的信号变异(变异系数)。
可以理解，本发明方法可以各种实施方案的形式来体现，其中仅少数实施方案在本文中公开。对本领域专家显然的是，存在其它不背离本发明主旨的实施方案。因此，所述实施方案是说明性的和不应构成限制性的。
权利要求
1.一种由包含微颗粒作为生物亲和性结合固相，标以双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料的生物特异第二试剂的生物流体或悬浮液测量分析物的无分离生物分析方法，包括将激光聚焦到反应悬浮液中，当单个微颗粒无规漂浮或被激发激光的辐射压力引导通过焦点区的激光束时由其测量双光子激发荧光，特征在于所述双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料具有结构(II)， 其中至少一个基团R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7是取代的或未取代的苯基，噻吩基，吡咯基，呋喃基，噁唑基，异噁唑基，氧杂二唑基，咪唑基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，苯并咪唑基，苯并呋喃基，吲哚基，共轭乙烯基，二烯基或三烯基；和至少一个基团R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到可用于选择共价键接到其它分子上的化学反应性基团；和至少一个基团R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到水增溶基团；和剩余的基团R1，R2，R3，R4，R5，R6和R7分别独立地选自氢，卤素，烷基，氰基，和羧基，分别可任选地被取代。
2.一种由包含微颗粒作为生物亲和性结合固相，标以双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料的生物特异第二试剂的生物流体或悬浮液测量分析物的无分离生物分析方法，包括将激光聚焦到反应悬浮液中，当单个微颗粒无规漂浮或被激发激光的辐射压力引导通过焦点区的激光束时由其测量双光子激发荧光，特征在于所述双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料具有结构(II)， 其中基团R1，R2，R3，R5，R6和R7是取代的或未取代的烷基；R4是氢，或取代的或未取代的烷基；和至少一个基团R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到可用于选择共价键接到其它分子上的化学反应性基团；和至少一个基团R1，R2，R3，R4，R5，R6或R7被取代得到水增溶基团。
3.根据权利要求1或2的分析方法，特征在于化学反应性基团是羧酸，羧酸反应性酯，羧酸酐，马来酰亚胺，磺酰氯，磺酰基氟，肼，胺，醇，酰基叠氮化物，异氰酸酯，醛，卤代乙酰胺，三嗪或异硫氰酸盐。
4.根据权利要求3的分析方法，特征在于所述化学反应性基团是琥珀酰亚胺基酯。
5.根据任何前述权利要求的分析方法，特征在于水增溶基团是磺酸或羧酸的铵或碱金属盐，铵或羟基。
6.根据权利要求1的分析方法，特征在于R1是取代的或未取代的2-噻吩基，2-吡咯基，苯基或苯基乙烯基和至少一个基团R2，R3，R4，R5，R6或R7是 其中X+是阳离子；和剩余的基团R2，R3，R4，R5，R6或R7分别独立地是氢或烷基。
7.根据任何前述权利要求的分析方法，特征在于所述生物特异第二试剂是选自半抗原，生物活性配体，药物，肽，低聚核苷酸，核苷酸，核酸，多肽，蛋白质，抗体和抗体的片段的生物活性分子。
8.根据任何前述权利要求的分析方法，特征在于所述分析物是选自半抗原，生物活性配体，药物，肽，低聚核苷酸，核苷酸，核酸，多肽，蛋白质，抗体，和抗体的片断的生物活性分子。
全文摘要
本发明涉及一种由包含微颗粒作为生物亲和性结合固相，标以双光子荧光染料的生物特异第二试剂的生物流体或悬浮液测量分析物的无分离生物分析方法，包括将激光聚焦到反应悬浮液中，当单个微颗粒无规漂浮或被激发激光的辐射压力引导通过焦点区的激光束时由其测量双光子激发荧光，其中使用一种双光子荧光二吡咯亚甲基二氟化硼染料。该染料具有结构(II)；和至少一个基团R
文档编号G01N33/58GK1526071SQ02813441
公开日2004年9月1日 申请日期2002年7月1日 优先权日2001年7月2日
发明者N·梅尔托拉, A·索伊尼, N 梅尔托拉, 聊 申请人:北极医疗诊断有限公司
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