专利名称：细毡毛忍冬正品药材的鉴定方法
技术领域：
本发明涉及细毡毛忍冬正品药材的鉴定方法。
背景技术：
金银花，是一种常用的中药材，能清热解毒、凉散风热。2005年以前，将忍冬科忍冬、红腺忍冬、山银花和毛花柱忍冬均列为金银花的植物来源，造成了金银花一药多源的局面。但从化学成分分析上，作为主要药用成分的木犀草苷，在忍冬中含量比较高，而山银花中含量很少，两者成分差异较大。因此，2005年以后，《中国药典》规定了，忍冬科忍冬的干燥花蕾或初开的花为正品金银花，将其余品种灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬、黄褐毛忍冬列为山银花植物来源。自此，由于金银花的来源较少，其售价也逐渐上升；而金银花的其他俗用药源，由于产量较高，成本较低，也就出现了以山银花或其他忍冬科植物来替用的现象。
细租毛忍冬Lonicera similes Hemsl,为川产金银花的主流品种,分布广，资源蕴藏量大据调查，成都荷花池中药材专业市场经销的金银花，四川省内中药店及医疗单位使用的金银花多为南江产金银花(细毡毛忍冬)，并销往全国各地。近年来，虽然有不少研究表明，细毡毛忍冬绿药理作用与药典收载金银花品种相当，但目前川银花优势品种细毡毛忍冬仍未入选中国药典，尤其是《中国药典》2010年版，加强了对中药材专属性成分的鉴别及含量测定，而细毡毛忍冬尚缺乏相关的基础研究，这极大的制约了川产金银花资源的利用。为了给细毡毛忍冬的继续使用提供可靠基�。紫刃枰芯肯刚泵潭奈镏食煞趾椭柿恐副辏欢壳跋始韵刚泵潭拇死嘌芯�。
发明内容
本发明的目的在于提供一种专属性较强的细毡毛忍冬正品药材的鉴定方法。本发明提供了细毡毛忍冬正品药材的鉴定方法，取药材，通过高效液相色谱法进行测定，药材中5-羟基-7，3' ,4!-三甲氧基黄酮的含量在O. 3%w/w以上。更进一步地，药材中5-羟基-7，3' ,4'-三甲氧基黄酮的含量在O. 3 I. 2%w/w。进一步优选地，药材中5-羟基-7，3 '，4'-三甲氧基黄酮的含量在O. 36^1. 08%w/w。其中，所述高效液相色谱法的色谱条件如下色谱柱十八烷基键合硅胶柱流动相乙腈0.3-0. 5% 磷酸=(20-24) : (76-80)柱温25-35O检测波长269±2nm。进一步地，所述流动相为乙腈0· 4%磷酸=22:78 ;柱温为30°C ;检测波长269nm。其中，所述高效液相色谱法中，供试品溶液的制备方法如下取细毡毛忍冬，粉碎，以60-80%v/v乙醇回流提取，滤过，量取续滤液，加酸水解后，浓缩至干，残渣加甲醇使溶解，定容，即得供试品溶液。进一步地，所述乙醇的浓度为70%v/v。进一步地，加酸水解步骤中，所用酸为盐酸。进一步优选地，加酸水解的具体操作为加入lmol/L盐酸，盐酸与续滤液的体积比为5 :1，置90°C水浴中加热水解。本发明还提供了细毡毛忍冬药材或提取物的的检测方法，它是采用HPLC进行的，操作步骤如下(I)取细毡毛忍冬，粉碎，以60-80%v/v乙醇回流提�。斯咳⌒艘海铀崴夂螅ㄋ踔粮桑性蛹状际谷芙猓ㄈ荩吹霉┦云啡芤海�(2)以5-羟基-7，3'，4'-三甲氧基黄酮为对照品，制备对照品溶液；·(3)分别将供试品溶液、对照品溶液注入液相色谱仪中，检测，即可，其中，所述高效液相色谱法的色谱条件如下色谱柱十八烷基键合硅胶柱流动相乙腈0.3-0. 5% 磷酸=(20-24) : (76-80)柱温25-35°C检测波长269±2nm。本发明中，首次在细毡毛忍冬中发现了 5-羟基-7，3'，4'-三甲氧基黄酮这一化合物的存在，同时，将该化合物作为鉴定细毡毛忍冬的指标成分，可以将细毡毛忍冬与现行中国药典收载的忍冬类其他品种进行有效区分，其专属性强，为其品质鉴定提供了一种新的方法。
图I 5_轻基 _7，3' ,4'-三甲氧基黄酮(5-hydroxyl-7, 3’，4’-trimethoxyflavone)氢谱2 5_轻基 _7，3' ,4'-三甲氧基黄酮(5_hydroxy 1-7，3’，4’-trimethoxyflavone)碳谱3流动相为甲醇-0. 1%磷酸(70:30)时的液相图谱图4流动相为甲醇-四氢呋喃-水(13:4:11)时的液相图谱图5流动相为乙腈-0. 4%磷酸(22:78)时的液相图谱
具体实施例方式实施例I 5-羟基-7，3'，4'-三甲氧基黄酮的分离鉴定实验所用的细毡毛忍冬药材采购于四川省南江县，经成都中医药大学马逾英教授鉴定，为忍冬科植物细租毛忍冬Lonicera similis Hemsl。(I)称取细毡毛忍冬Lonicera similes Hemsl 的干燥花蕾 I. 9Kg，用 90%、80%、70%的乙醇回流提�。锪媳任狪 : 8，过滤，减压回收乙醇，得浸膏。经测定，该提取物中含有总黄酮3. 39%ο(2)取上述浸膏，加水配制上柱液，上柱液浓度以生药计为0. 10g/ml，上大孔吸附树脂柱，依次用水、浓度为10%、20%、40%、60%、80%、95%V/V的乙醇洗脱，收集95%乙醇部位；
(3)取所得乙醇部位，回收溶剂后，上硅胶柱层析(200-300目，350g，柱体积925ml)，用环己烷-乙酸乙酯=20 Γθ 1，乙酸乙酯-甲醇=5 Γθ I系统进行梯度洗脱，每流份150ml，收集洗脱液，薄层监测，合并相同流份，取39 59份，回收溶剂后，用甲醇复溶，再上S印hadexLH-20凝胶柱，用甲醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，重结晶，即得5-羟基-7，3' ,4'-三甲氧基黄酮(35mg)，转移率为O. 17%，经HPLC测定，纯度为99. 5%。梯度洗脱的条件为己烧-乙酸乙酯=20 : I (997. 5ml),环己烧-乙酸乙酯=10 : I (990ml),环己烷-乙酸乙酯=8 I (3050ml)，环己烷-乙酸乙酯=6 I (970ml)，环己烷-乙酸乙酯=5 : I (1901ml),环己烧-乙酸乙酯=4:1 (1855ml),环己烧-乙酸乙酯=3:1 (3755ml),环己烷-乙酸乙酯=2:1 (1550ml)，环己烷-乙酸乙酯=1:1 (1960ml)，乙酸乙酯(1500ml)，乙酸乙酯-甲醇=5 :1 (2035ml)，乙酸乙酯-甲醇=3:1 (1430ml)，乙酸乙酯-甲醇=2 :1 (1335ml)，乙酸乙酯-甲醇=1:1 (1500ml)，甲醇(1500ml)。
化合物鉴定所得化合物为黄色粉末，mpl67^169°C。TLC紫外灯下显色，喷AlCl3有黄色荧光，盐酸-镁粉反应为阳性，三氯化铁反应为阳性。由此初步判断为黄酮类或黄酮醇类化合物。ESI-MS m/z:329[M+H]+。1H-NMR(C5D5N, 400ΜΗζ) δ :7.07 (1H, s, H_3)，6. 60 (1H, s, H_6)，6. 73 (1H, s, H_8)，7.57 (1H, s, H-2' )，7. 06 (1H, d, J=8. 6Hz, H_5’), 7. 66 (1H, d, J=8. 6Hz, H_6' )，13. 60 (1H, s, 5-0H)，3. 82 (3H, s, -OCH3)，3. 79 (3H, s, -OCH3)，3. 72 (3H, s, -OCH3)。13C-NMR (C5D5N, 100MHz) δ 164. 4 (C_2, s)，104. 9 (C_3, d)，182. 9 (C_4, s)，162. 7 (C-5, s)，98. 8 (C-6, d)，166. 0 (C_7, s)，93. I (C_8, d)，158. 2 (C_9, s)，106. 0 (C-10, s)，123. 2(C-Γ，s)，110. 0 (C-2，，d)，149. 6 (C_3，，s)，153. 2 (C_4，，s)，112. 20 (C_5，，d)，120. 7 (C-6’，d)，56. 5 (-OCH3)，56. 4 (-OCH3)，56. 2 (-OCH3)。以上数据与文献基本一致，故确定为5-羟基_7，3' ,41 -三甲氧基黄酮。
权利要求
1.细毡毛忍冬正品药材的鉴定方法，其特征在于取药材，通过高效液相色谱法进行测定，药材中5-羟基-7，3' ,4!-三甲氧基黄酮的含量在O. 3%w/w以上。
2.根据权利要求I所述的鉴定方法，其特征在于药材中5-羟基_7，3'，4'-三甲氧基黄酮的含量在O. 3^1. 2%w/w。
3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于药材中5-羟基-7，3'，4'-三甲氧基黄酮的含量在O. 36 I. 08%w/w。
4.根据权利要求I所述的鉴定方法，其特征在于所述高效液相色谱法的色谱条件如下 色谱柱十八烷基键合硅胶柱 流动相乙腈0. 3-0. 5% 磷酸=(20-24) : (76-80) 柱温25-35 °C 检测波长269±2nm。
5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于所述流动相为乙腈0.4%磷酸=22:78 ;柱温为300C ;检测波长269nm。
6.根据权利要求I所述的鉴定方法，其特征在于所述高效液相色谱法中，供试品溶液的制备方法如下 取细毡毛忍冬，粉碎，以60-80%v/v乙醇回流提�。斯咳⌒艘海铀崴夂螅ㄋ踔粮桑性蛹状际谷芙猓ㄈ荩吹霉┦云啡芤�。
7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于所述乙醇的浓度为70%v/v。
8.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于加酸水解步骤中，所用酸为盐酸。
9.根据权利要求6或8所述的鉴定方法，其特征在于加酸水解的具体操作为加入lmol/L盐酸，盐酸与续滤液的体积比为5 :1，置90°C水浴中加热水解。
10.细毡毛忍冬药材或提取物的检测方法，其特征在于它是采用HPLC进行的，操作步骤如下 (1)取细毡毛忍冬，粉碎，以60-80%v/v乙醇回流提�。斯咳⌒艘海铀崴夂螅ㄋ踔粮桑性蛹状际谷芙猓ㄈ荩吹霉┦云啡芤海� (2)以5-羟基_7，3'，4'-三甲氧基黄酮为对照品，制备对照品溶液； (3)分别将供试品溶液、对照品溶液注入液相色谱仪中，检测，即可，其中，所述高效液相色谱法的色谱条件如下 色谱柱十八烷基键合硅胶柱 流动相乙腈0. 3-0. 5% 磷酸=(20-24) : (76-80) 柱温25-35 °C 检测波长269±2nm。
全文摘要
本发明公开了细毡毛忍冬正品药材的鉴定方法取药材，通过高效液相色谱法进行测定，药材中5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量在0.3%w/w以上。本发明还提供了细毡毛忍冬药材或提取物的检测方法。本发明中，首次在细毡毛忍冬中发现了5-羟基-7,3′,4′-三甲氧基黄酮这一化合物的存在，同时，将该化合物作为鉴定细毡毛忍冬的指标成分，可以将细毡毛忍冬与现行中国药典收载的其他忍冬类药材进行有效区分，为其品质鉴定提供了一种新的方法。
文档编号G01N30/02GK102879502SQ201210418049
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月26日 优先权日2011年11月3日
发明者马逾英, 郑光雅, 卢晓琳, 穆向荣 申请人:成都中医药大学
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