专利名称：一种耐贮藏的微粒,特别是一种用于载体结合反应的载体及其生产方法
技术领域：
本发明的目的是一种耐贮藏的微粒，特别是一种用于载体结合反应、检测和(或)分离方法的微粒载体，生产这种耐贮藏微粒的方法，及本发明的微粒的用途。
由固体核芯和多聚物组成的微粒载体已为人知，且已应用于多种目的。尤其是，这种微粒已用作免疫测定标志，用多聚物，如生物多聚物，将固体核与亲和成分相结合。多种微粒物质已得到使用特别是金属微粒溶胶，如有色金属微粒或磁性微粒；非金属微粒，如硒、煤粉、SiO2或陶瓷微粒；血球，甚至还有带着另一种具有不同(结合)特性的多聚物的乳胶微粒。
因此，US 4,230,685描述了特异性粘合剂与磁性微粒结合的改进按此，用丙烯酸酯聚合物(Acrylatpolymer)或多糖涂盖在微粒上，用戊二醛将蛋白A结合在此涂层上。
US 4,452,773描述了磁性-葡聚糖微粒的生产。这类微粒的大小为100-700，尤其是300-400。有大量的微粒是胶态的，有铁磁性，带有葡聚糖的外壳。得到的微粒用高碘酸盐氧化使之功能化。
EP-B-452,342是关于涂有多糖、具有胶体大小的超顺磁微粒。这种微�？捎敫郊拥幕畔嘟岷�。将微粒混合物分选成具有一致磁化水平的一定大小的组分，该组分展现了在磁场中阻滞性(Retardierung)的均一。叙述了按照大小来分离的可能性。优选用多糖或蛋白质涂盖。多糖用高碘酸盐氧化而功能化。此外，可能用溴化氰进行功能化。蛋白外壳与微粒分子的结合可能由侧链氨基或硫氢基完成。
DE-A-4037,724是关于使用直接或间接的标志物进行免疫测定的设计。优选采用直接标志物因为它们不需要另外的步骤来使测试结果可视化。直接标志物的例子如金属溶胶，染料溶胶，乳胶微粒、颜色指示剂、脂质体上的色料及非金属溶胶如碳溶胶。DE-A-4037724的另一方面是关于一种免疫化学活性标志物。煤粉颗粒与一个配基或配基共轭物吸附结合。检测的灵敏度，以人绒毛膜促性腺激素hCG为例为25mIU/ml(IU＝国际单位)。
EP-A-0,410,893描述一种在生物液体中测定和识别针对特异抗原的抗体的方法。列出的不溶性载体微粒包括细胞、凝胶微粒、微胶囊、有机多聚物、无机细微粒、或用牛血清白蛋白或胆固醇精细分散的金属或金属化合物的胶体微粒。
EP-A-0,032,270描述用一种或几种标志化合物定量地或定性地测定一种免疫成分的方法将这些分成直接地或间接地与在亲水染料或色素的水性分散体系中的微粒或者涂盖有这类染料或色素的多聚物核相结合。
EP-0,321,008是关于藉特异结合蛋白与样品中相应的可结合物质间的反应，测定一种或几种成分的方法。这种成分与至少一个的标志成分间的相互反应活性，是靠直接或间接地耦联或吸附标志溶胶微粒而得到的。优选的溶胶微粒为磷、碳和/或硅。将这种微粒表面用含极性基团的大分子包裹可以防止凝集和聚集，这种大分子可以是蛋白、聚乙二醇、多聚糖、聚乙烯醇及其它。适宜的保护蛋白有抗原、抗体和抗-抗体。免疫化学惰性物质如白蛋白、聚乙二醇或其它极性大分子也可使用。检测的灵敏度，以免疫球蛋白G为例，为1.5ng绝对量。
EP-0,298,368是关于使用含胶体铁金属的微粒进行诊断性免疫测定的一种方法。这种微粒带有一种结合物能特异地识别待测物质，检测hCG的灵敏度在mIU/ml范围。
EP-A-0,280,560公开了共价结合于核/外壳多聚物微粒的链球菌A抗原抗体。微粒外壳是由聚(mp-氯甲基苯乙烯)构成的，核芯则是聚(苯乙烯-CO-2-acetoacetoxidethyl methylacrylate)构成的，核内含有油红EGN，以得到一种凝聚试剂。
US 4,452,886描述赖氨酸与戊二醛及刚果红聚合成颜色微粒。对hCG的测试灵敏度在1000 IU/ml的范围。
Collins WP在他的“任选的免疫测定”一书(John Wiley & Sons，Chichester，纽约，等)的“分散染料免疫测定(DIA)”一章的48-49页中描述了微粒标志物的优点，并指出基本参数的意义，如微粒大�。植加胄问剑谢芗林械娜芙舛龋禾逦榷ㄐ约敖岷先萘浚┤纾钥固宓慕岷�。他提及的测试的灵敏度在mIU/ml范围。结合物如以冻干状态贮存在-20℃或4℃，其稳定性至少为15个月，水性结合物应在制备后6天内用掉。
JP-A-0686,777是关于用胶囊包起来的调色剂及其生产。
本领域所描述的惰性核芯有着明显的缺点。在核芯发生聚合时，所期望的核芯特性受损太多。当聚合物吸附在核芯上并随之结合共价的或其它结合方式的亲和成分时，核芯的结合力在多数情况下太弱，因而不能在较长的时间内保证其稳定性。此外应用本领域所提供的方法只能结合一种或少数几种活性的及亲和的成份。
构成本发明的基础的技术问题在于提供具有特有的有用特性，特别是标志特性，稳定的微粒。必要时也能将许多种反应成份同时稳定地结合在上面。稳定性应当特别也包括长期贮藏。
本发明提供一种耐贮藏的微粒，特别是一种具有权利要求1的特征的微粒载体用于解决构成本发明基础的问题。从属的权利要求2-18是关于本发明微粒的优选实施方案。权利要求19与相应的从属权利要求20和22是关于本发明的耐贮藏微粒的生产方法。权利要求23-31是关于本发明微粒的用途。
本发明的耐贮藏的微粒被特别指明用于载体结合反应、检测和(或)分离方法。它由至少一个第一成分和一个第二成分组成。这种微�：苁视谧吧弦桓龌钚猿煞郑乇鹗翘匾斓幕钚猿煞�。第二成分是一种可交联的聚合物，它在一定程度上形成一层外壳并(或)将第一成分作为核心，至少部分地，包被和/或包围起来。
第一成分具有至少一个可确定的特性。在第二成分上可安置一些活性成分。耐贮藏微粒的特性取决于它的制造方法，它可用可交联聚合物与第一成分反应而得到，然后形成的产物和交联剂反应，从而使第一成分被安置在耐贮藏的第二成分之内。第一成分耐贮藏地装备于第二成分的特征意味着，甚至贮藏期间，在可能的不利的条件下，第一成分仍然保持在外壳内。这意味着在本发明相关的方法的、以第一成分为荧光染料为特征的实施方案中，染料基本上定量地存在于由第二成分组分构成的外壳内。因而阻止了染料的流失。这意味着，由第二成分构成的外壳，将置入其中的第一成分紧密包围。本发明遵循的、使第一成分耐贮藏地装备于第二成分的条件是，例如，通过设法使交联剂以高度过量加入。典型地是，交联剂以十倍浓度于第二成分的反应基团。优选的是，交联剂中含有的反应基团是10倍至100倍多于第二成分的相应基团，这两种基团相互交联反应。
最好将反应条件调整到使第一成分被第二成分以网状方式包被和/或包围。
本发明的构成载体的第二成分优选是一种具有活性功能基团、或者可活化的功能基团的聚合物它能与交联剂、或活性成分、或同时与二者起反应。根据本发明构成载体第二成分的聚合物也可从几种可交联的聚合物和/或可交联的单体生产出来。因此，聚合物可由蛋白质和/或具有功能基团的聚酰胺生成。原则上，其它聚合物，诸如生物聚合物或单体也是可能的，只要能够实现交联。最好，第二成分可与至少双功能的化合物交联。
优选采用能吸附性地稳定成分1水悬液的聚合物，特别是极性聚合物。
按本发明安置在微粒的第二成分上的活性成分是(特别是)一些具有对其它物质有亲合特性的分子或分子基团。这特别包括酶以及与酶起作用的底物。这样，底物或酶可以作为活性成分安置在第二成分上。抗体/抗原，生物素/链亲和素有相似的作用。作为特异活性成分与染料稳定结合的生物素具有以下优点即作为共反应物，染料对生物素化的成分或与链亲和素结合的成分普遍可用。这些成分可以具有完全不同的功能，如再与另一成分发生特异反应或者起催化剂作用。此外，RNA或DNA类的核酸也可用作本发明意义上的载体。核酸可以与相应的互补链、或部分互补链按反应条件的严紧性杂交，形成稳定的复合物。这样，就可鉴定一个研究样品中特异的核酸链，并在此基础上进一步处理。此外反应成分的组合物可以安置在第二成分上。然后，依据发明可以得到应用于不同问题的载体。
通过选择交联剂及其浓度并调整特殊的加工条件，可以控制交联反应，使第二成分多少象网络样包被第一成分，其网眼大小的分布范围较窄。
同时，利用交联的工艺条件，可以调整在微粒表面上的游离的结合位点数。此种微粒因为只和至少有两个功能团的交联剂的一个功能团结合，因此其表面对另外的结合，特别是活性成分的结合仍保持游离。产生的结合位点数可以全部应用或在部分饱和后应用其确定的部分。
特别是利用加工条件可以调整外壳的厚度，其均一性还可用分级法提高。一个多步骤的包封方法还可以改进第一成分的包含(EinschlaB)。
按本发明，微粒的第一成分具有至少一个可确定的特性，与之结合的成分2和(或)活性成分并不具有其有关的性质，诸如吸收或发射电磁波、质量、磁性、介电性、放射性、大小和/或密度。
作为确定的特性，按本发明作为载体第一成分的核芯当然可具有药理学-生物学效应和催化效应，或者二者的结合。因此，例如，电磁波的吸收性或发射性可以由各自的生色团或萤光团产生。质量、大小和密度等特性是物理学上互相联系的，并可用，例如，更高比重的微粒作相应的调节。大小的特性有利于凝聚，而质量特性有利于重量分析。凝聚对在溶液或微乳液中成分的特异性沉淀有利。第一成分可以具有放射性标志结构而有放射活性。与之相仿，其它特异的性质也可以连接在第一成分上。第一成分可以是一个包含流体的胶囊，也可以是不能完全被包裹的微粒(例如极小的、或者在溶液中不稳定的微粒)。
在本发明载体的有益设计中，载体是这样的第一和第二成分的相互联接是可分开的。第一和第二成分间的联结是通过将第一成分包裹在第二成分中而实现的。在必要时，可通过除去第二成分来暴露第一成分，以便于用测量技术去检测与核芯相联结的特性。除去第二成分的方法，例如在蛋白的情况下，可用相应的蛋白水解酶。这些酶使外壳降解但保留核芯。后者可以按其待测特性来进一步处理。此外，还可用一种优先溶解核芯的介质使核芯从第一/第二成分的联结中溶解下来，这样，最后留下“空的”外壳；或用一个总溶剂去溶解整个微粒。因此，例如，假如一个可溶于乙醇的染料被第二成分包裹，这就可以用溶剂去处理，再用分光法测量所得到的乙醇溶液。如果条件是标准的，而且必要时是刻度的，相应的褪色程度可被用作定量测定的量。
除了各个耐贮藏微粒载体外，通过实施应用方法而得到其他表现形式也具有重要意义。耐贮藏微粒载体大多数呈群体分布形式。为应用本发明的微粒，载体的群体最好具有较窄的大小分布。
特别优选的是载体微粒群体具有的外壳大小、核芯大小、以及外壳/核芯大小的分布都在一个窄范围内。对核芯，特别是对整个微粒的其它特性，也希望有一均一分布，如颜色、强度或者可磁化性。
对本发明微粒作为载体的实际应用中，在第二成分上安置高浓度的活性成分是有益的。由此可以对免疫测定中相应互补结构达到相当高的结合常数，尽管个别活性成分和它的相应互补结构可能只具有一个一般的结合常数。然而由于存在多个结合位点，结合效力(亲和力)得到增加。
按本发明，载体生产方法包括的步骤中，第一成分与可交联的聚合物至少反应一次。然后，此聚合物可以被物理吸附在第一成分的表面上。可交联的聚合物随着下一步的加工步骤形成第二成分。这是用交联剂处理完成的。作为交联剂可以有，特别是双功能分子，诸如戊二醛、二羧酸、丙烯酸盐、异丁烯酸盐。然后具有烯基(olefinische)的交联剂可通过例如光反应或其它自由基链式反应而活化。功能分子能使聚合物交联，特别是经过缩合反应或加成反应。
也可能处理前的第一成分和/或中间产物以及第二成分和/或微�？梢愿荽笮『�/或其它特性进行分离以达到使大小或其它特性尽可能的均一。最好将第一成分与聚合物处理2-3次，特别优选按大小进行分离。
此方法特别有利，因为它可以均化第一成分并调整其在悬液中起始时的浓度，而与反应无关。根据所用的第一成分，可以采用使悬液均化和稳定的标准方法。优选用第二成分来稳定悬液，如果这是一种在第一成分上的有足够好吸附性的极性化合物。选择第一和第二成分的浓度比例，使得通过吸附，外壳能达到合适的厚度。在多步骤方法中优选薄的外壳。其它参数，如时间和温度同样可用来影响吸附。此后，中间产物可以再均化。为了使外壳，特别是在靠近第一成分的内部区域内有好的交联，交联成分以几个量级的过量加入。此外，交联成分的效应可受其它参数影响，特别是接触时间和由单侧结合的交联分子在表面上形成的活性基团的数量，后者可通过随后的部分封闭而减少。
本发明的载体优选用于测定技术，诸如免疫测定，固相测定和/或色谱测定。此外，它们可用作有效物质亲合性运输的运载工具，如果，比方说，药理学活性物质作为第一成分被包裹在第二成分中。作为亲合运输，意味着，例如，可用位于第二成分上的抗体来运输药理学活性物质，并特异地结合于一个特殊靶结构。
具有放射性核芯的微粒也可以有益地应用，因为它们藉亲合运输在使用局部发挥作用或浓缩，因此可用低的总放射活度剂量，系统的负担可保持在窄的限度中。
本发明的耐贮藏微粒载体用作一个化学反应的催化剂也是有利的。因此，为了将载体结合的催化剂(生物催化剂)与反应混合物迅速混合，可采用一种磁性核芯，藉其重量随后可进行迅速的分离。
本发明可进一步用以下的例子来说明。
例1一种具有高载量链亲和素(作为对生物素化成分特异反应的成分)的苏丹IV染料微粒的制备。
1.胶溶10.0g苏丹IV加入100ml含2％BSA(牛血清白蛋白)的PBS缓冲液(磷酸缓冲溶液)(2μm过滤除茵)中，高速搅拌成均一的悬浮液。然后，悬浮液进行粗过滤(BioRad滤纸，543型)。
将悬液分配在2个离心管中，在预冷至4℃的离心机中离心，1000rpm(转/分)，2000rpm，3000rpm各5分钟。然后进行第2次过滤。
2.交联与活化50％戊二醛水溶液50ml，放置到室温(通风橱内)，用约11ml的0.3M Na2HPO4缓冲液调pH值至7.3(用pH计校验)。然后加入25mlPBS缓冲液及5ml以1∶1混合的PBS缓冲液和双蒸水(在反应溶液中有约1.5M的戊二醛或2.8M的醛基，约1.5×10-4M的BSA，按每个BSA具有300氨基酸计则有约4.5×10-2M活性氨基酸，这样对于每个氨基，相应有60个醛基)。全部溶液(pH 7.3)过滤除菌(0.2μm)。
对每份20ml戊二醛缓冲溶液，在涡流混合下(vortex)各加入20ml胶溶的苏丹IV悬液(4个平行制备)，室温下振摇4小时。
在离心管中对40ml活化的悬液各加入2.2ml 2％BSA溶液(0.2μm过滤)，使之稳定。然后以2500rpm离心5分钟，粗滤。
3.柱纯化(凝胶过滤)CL 4B Sepharose(Parmacia)柱经过再生并在室温下用PBS缓冲液平衡至少1小时，然后加上圆形滤膜，将上层缓冲液吸走或排出。将160ml稳定化了的悬液上柱，柱体加盖。渗入后(约25分钟)用PBS缓冲液淋洗柱体边缘，开泵。
为分部收集，准备带刻度的12ml锥形管以收集下列体积1-10号管，及23-30号管，每管4ml；11号及22号管4.5ml；12号及21号管5ml；13号及20号管5.5ml；14-19号管6ml。
当红色溶剂前沾出现在出口处时，收集各部分，凝胶过滤历时30分。
从收集的各部分各取5μl，用5ml PBS缓冲液稀释(1∶1000)，涡流混合(Vortex)用肉眼观看颜色深度。按颜色深度判断各部分样品，可得一个颜色最深的宽的中心峰区域，在它之前或之后的部分色度明显下降。采用140ml左右的宽峰区域。将这些部分收集在一起，分配到3个50ml试管中，2500rpm离心5分钟，然后粗滤。
(必要时，为得到较厚或较牢固的外壳，步骤2及3可重复一次或数次。)4.与特异反应成分链亲和素的结合100mg链亲和素溶于6ml PBS缓冲液中。为检查其质量，用280nm下的光密度测定蛋白浓度，并与生产厂的说明书比较。将链亲和素溶液装入6mm的透析管，在4℃下对1升PBS缓冲液透析过夜。溶液转入试管，用4ml PBS缓冲液再淋洗一下透析袋。再次用OD280鉴定蛋白浓度。将链亲和素溶液离心，4000rpm 5分钟，将上清部分再测一次OD280后用于结合反应。
已包被有与活性醛基交联的BSA的苏丹IV染料粗滤液，同时4份，与链亲和素上清液结合。方法如下在50ml试管中各加入约3ml链亲和素溶液(蛋白浓度为11mg/ml)，在涡流混合下加入30ml悬液(即每33ml悬液中含33mg链亲和素)。溶液在室温下振摇过夜，次日晨离心2500rpm 5分钟，然后粗滤。悬液总体积约为130ml。
5.CL-68 Sepharose柱纯化及颜色测定按3的方法制备及平衡柱。130ml悬液的渗入约25分钟，凝胶过滤约30分。分部收集管的准备同3。各部分或按3的方法稀释，或只凭肉眼观察。当需要高的颜色质量时，将各部分以1∶50稀释后按DE-A1-19500862例1的适当方法进行测定。在具有单克隆鼠抗人IgG抗体的凝胶床柱上，加入250μl 1∶5000稀释的原含84 IU/ml人抗破伤风IgG的采集血清(灵敏度1.7 mIU/ml，绝对量约0.4 mIU)，然后加入250μl浓度为5μg/ml的生物素化的破伤风类毒素。在加入250μl 1∶50稀释的结合链亲和素的染料悬液后可见到明显的颜色。具有高吸收的中心收集钯团包含一个约100ml的宽峰区。在要求较低时左右两个肩区约30ml也分别收集。经涡流混合(Vortex)及凝胶过滤，两部分收集物在4℃保存(必要时过夜)，直到完成稳定化。
6.稳定含20％BSA的PBS缓冲液用0.2μm过滤除菌。取50ml的试管用BSA溶液涮过，加20％BSA溶液22ml，在涡流混合下(Vortex)加入18ml的粗滤悬液。然后，悬液再次进行粗滤。
7.贮存用0.09％叠氮钠稳定的悬液在密封的50ml试管内，在4℃下，至少能保持12个月的稳定，并具有稳定的吸收值。
8.特性与平均大小约为50nm的苏丹IV微粒相比，经过一次包被，大小约为51至200nm，二次涂复后的大小为300-400nm。
例2使用例1的本发明的耐贮藏的微粒载体物质进行免疫测定。
对破伤风疫苗接种状态的半定量和定量测定，即对血中抗破伤风IgG浓度的测定。
a)半定量测试为了使半定量测定得到直观可见的结果，采用了同时进行多个测定具有三个区域的反应柱，按DE-AI-19500862。
反应柱的底部反应区(参比区)装有蛋白G，并结合有一定量的抗破伤风人IgG，相当于加样毛细管中血量所含的足够接种量(IU)。为此，将采集的血清作相应的稀释，包括破伤风特异免疫球蛋白在内的总人IgG在流动中与此反应区中蛋白G结合(蛋白G与CNBr活化的琼脂糖相结合，见DE-A-19500862，例2)。
中部的阴性对照区含有CNBr活化的Sepharose 4B，具有共价结合的BSA。
顶部反应区(测试区)只含结合有CNBr活化的琼脂糖的蛋白G。
用毛细管将一定量的血液加到柱上，用洗涤缓冲液洗后，将250μl的5μg/ml生物素化的破伤风类毒素(生物素化水平50)上样，再洗一次后，将以洗液1∶20稀释的链亲和素染料乳液上柱再洗一次。
样品中的总人IgG在流动中结合在测试载体床内。在测试区和参比区中，前者在流动中，后者原先就结合了一定量的抗破伤风人IgG及相应的生物素化破伤风毒素。非特异结合的蛋白被缓冲液洗去。此后，染料乳液在测试区和参比区流动时，那里就结合上了相当于破伤风类毒素量的链亲和素染料。此时，非特异结合的蛋白也被洗液洗去。在阴性对照区，没有东西被结合。
半定量的判定采用肉眼比较颜色。如若测试区的颜色等于或超过参比区的颜色，说明接种是充分的。如比它弱，则需要接种；越是紧迫需要接种，则颜色差别越明显。(按照医学或世界卫生组织(WHO)的资料，对参比区可作细的刻度，如，尚有二年保护力，5年保护力，建议接种，强烈建议接种。另一种方法是以相应的标志判定在测试区中颜色渗入的深度。这样，参比区可以省去，或用作保护。)b)定量测试为此目的只需一个测试区，不过，为了可靠，也可加入阳性和阴性的对照区。
在此区中载有鼠抗人IgG，如DEA-19500862例2所示。应用顺序和反应如文献a)所述。在酒清溶液洗脱后采用520nm或492nm光度吸收进行测定。
用酒清洗脱是必要的，因为染料标志物藉大量的结合位点与凝胶床附着得非常牢固，它不能象其它标志物那样靠pH变动或被并存的分子取代(即使部分地也不行)，在此情况下只能通过溶解。
对于抗破伤风人IgG的两种测试灵敏度都在mIU/ml范围。本测试方法在不作最佳化改进的情况下，可以定性地(目测)或定量地测定10pg以下量的IgG，如在柱内浓集，还可以测得更低(pg/ml范围)。现行的质量控制能保持乳液稳定性至少达12个月。
例3活性染料微粒的合成在20ml浓度为1-50mg/ml溶于pH 6-8.5的0.01-0.2M磷酸缓冲液的BSA溶液中加入0.1至2g碳。混合物用磁力搅拌器或涡流混合直至蛋白质被充分吸附(胶溶)。将得到的悬液以6000×g离心5至10分。
大小为50-350nm的已吸附BSA的碳颗粒在下一步用戊二醛活化。戊二醛浓度在1-25％范围内，活化时间20至120分。
活化的悬液离心3-4次，用凝胶过滤纯化，凝胶材料为6B，4B，2B，CL-6B，CL-4B，CL-2B，Sephacryl S300，或其它凝胶(Toyoperl，Ultragel等)，由此，对球状蛋白的排阻限度不得低于1×106道尔顿。使用此方法可以得到黑色染料微粒。制备其它染料微粒的方法与此相似，代替碳的是如红色用苏丹II，暗红色用苏丹III，灰色用苏丹黑，紫色用四唑二甲紫，暗紫用新四唑二甲�。忌盟倪蚨撰±肌Ｕ庑┙岷衔镌谛褐械氖褂门ǘ仍嘉�0.08％，取决于干重。通过与反分析物如蛋白A，链亲和素或抗体联结生成染料标记。
例4用蛋白A碳结合物在无孔隙固相上，对抗-HIV抗体进行血清学测定。
采用吸附有HIV-1和HIV-2合成肽的聚苯乙烯-酶联免疫吸附测定板作为固相。然后加入系列稀释的兔抗HIV血清。孵育15分经一步纯化，加入蛋白A-碳结合物，再经一步纯化，15分后可读取反应所得的斑点。
与此平行，用购买的蛋白A金胶体(微粒大小40nm)和蛋白A-POD进行相似的实验。用肉眼观察作比较，这两种标志物的灵敏度为1/1280稀释，碳结合物为1/20480。
例5用碳结合物以薄层色谱测定HCG一条2×16mm的硝酸纤维素粘合在透明的0.5mm PVC上。纤维素条的一端粘合一片1×1cm的色谱纸作为吸引材料。硝酸纤维素的中央用Hamilton注射器加上抗HCG抗体(1mg/ml磷酸缓冲溶液)。30分钟后用1％酪蛋白溶液(含吐温的磷酸缓冲液)封闭(1小时)，然后纯化，干燥。
HCG标准物先用磷酸/吐温缓冲液稀释一次，然后再用健康人的尿稀释一次，加吐温20至0.1。将50μl碳与抗HCG的结合物加入50μl此标准溶液中。纤维素条的游离端浸入在此溶液中，结果可用目测，在2至3分钟后可见一条黑线。50mIU/ml的灵敏度对于一周的妊娠测试是足够的。
权利要求
1.包含至少一种第一和至少一种第二成分的耐贮藏微粒，其中，—所述的至少包含有一种可交联聚合物的第二成分作为外壳，至少是部分地，包被或包围作为核芯的第一成分，以及—该第一成分至少有一种可确定的特性，可用以下方法获得—通过将第一成分与一个可交联聚合物反应，然后使所形成的产品与一个交联剂反应，使该第一成分耐贮藏地保持在该第二成分中。
2.权利要求1的微粒，其特征在于该微粒是一种用于载体结合反应、检测和/或分离方法的耐贮藏微粒，载体适宜于装备有至少一种反应成分，特别是特异的反应成分。
3.权利要求1和/或2的微粒，其特征在于该第一成分是由第二成分以网状包被或包围的。
4.根据权利要求1-3中至少一项的微粒，其特征在于该第二成分是至少一种聚合物，其具有活性的或者可活化的功能基团。
5.权利要求3的微粒，其特征是至少一种聚合物是由一个或数个可交联聚合物和/或可交联单体制备成的。
6.根据权利要求1-5中至少一项的微粒，其特征在于该聚合物是由至少一种聚酰胺，优选蛋白质，或至少另一种具有功能基团的生物聚合物制备的。
7.根据权利要求1-6之一的微粒，其特征在于该第二成分是至少可与双功能的化合物交联的。
8.根据权利要求7的微粒，其特征在于，结合在表面上的双功能化合物还具有至少一个反应基团，这些反应基团可全部或部分地被饱和，及/或可全部或部分地，最好是一个特定部分，用于与反应组分或第二成分的另一层共价结合。
9.根据权利要求2-8中至少一项的载体，其特征在于反应组分是一个具有对其它物质有亲合特性的分子或分子基团。
10.据权利要求7的微粒，其特征在于至少一个反应成分是一种酶、与酶起作用的底物、抗体、抗原、生物素或链亲和素、可与另一种核酸杂交的RNA或DNA类型的核酸。
11.根据权利要求1-10中至少一项的微粒，其特征在于该第二成分以分子网形式包被该第一成分，分子网的网眼大小分布在一狭窄范围内。
12.根据权利要求1-11中至少一项的微粒，其特征在于所述第一成分的可确定的特性是选自以下一组特性中的至少一个，包括电磁波吸收性和发射性、质量、磁性、介电性、放射性、大小、密度、以及药理学的、生物学的、和/或催化的效应。
13.根据权利要求1-12中至少一项的微粒，其特征在于第一和第二成分间是可以分开地互相联结的。
14.根据权利要求1-13中至少一项的微粒，其特征在于载体是以一群体形式出现，这些群体可在包裹后依微粒大�。�/或在包裹前、中和/或后，按第一成分的可确定的特性进行至少一次分级。
15.据权利要求14的微粒，其特征在于所述微粒以一群体形式出现，其大小和/或可确定特性，特别是大小和/或颜色，分布在一窄范围内。
16.据权利要求14和/或15的微粒，其特征在于所述微粒其第一成分的可确定特性，特别是大小和/或颜色分布在一窄的范围内。
17.据权利要求2-16中至少一项的微粒，其特征在于，所述的载体有高额(eine hohe Belegung)的第二成分，后者至少具有一个反应成分，特别是特异的反应成分。
18.根据权利要求l-17之一的微粒，其特征在于，所述的反应成分是经过隔离物与外壳和核芯结合的。
19.由至少一个第一成分和至少一个第二成分构成的微粒的生产方法，其中该第一成分用至少一个作为第二成分的可交联聚合物处理至少一次，各个产物和/或终产物与至少一个具有至少双功能的化合物交联。
20.据权利要求19的方法，其特征在于在所述的方法中未处理的第一成分、中间产物和/或微粒，至少有一次分级是按大小和/或另一种可确定的特性进行的。
21.据权利要求19和/或20的方法，其中至少双功能的化合物是选自一组化合物中的一个例如二醛，特别是戊二醛，二羧酸，丙烯酸盐，或丁二烯化合物；而可交联聚合物是用缩合、加成或取代作用交联的。
22.据权利要求19-21中至少一项的方法，其特征在于对聚合物和/或交联剂的处理和/或分级进行两次或数次。
23.据权利要求2-18中至少一项的微粒在测定技术中的应用，特别是定性的、半定量的和定量的柱固相免疫测定。
24.据权利要求23的微粒的应用，其特征在于可确定的特性是用手工或肉眼藉参比区和浓集区进行定性或半定量评定的。
25.据权利要求23的微粒的应用，其特征在于可确定特性是由技术测量定量地评价的，必要时将第二成分溶解和/或将整个微粒溶于另一溶剂，或在不同条件下，诸如不同pH和/或不同盐浓度下进行。
26.根据权利要求23-25中至少一项的微粒的应用，其特征在于，采用了至少两个可确定的特性，例如利用磁性改进混合，和/或其后将固相从液相分离，和/或吸收性(Absorption)定量。
27.根据权利要求1-5中至少一项的微粒，用于药理学和/或生物学活性物质的应用，其特征为，至少将第二成分溶解和拆分。
28.据权利要求27的微粒的应用，其特征在于，第二成分大小的窄的分布决定溶解所需时间，和/或第一成分的至少一种可确定特性的窄的分布决定其效应在窄范围内。
29.据权利要求27或28的微粒的用途，作为活性物质亲合运输的运载工具。
30.根据权利要求2-15中至少一项的微粒，用作化学和/或生化反应中的催化剂的应用。
31.根据权利要求30的微粒的应用，其特征在于，使用至少两个可确定的特性，例如用于快速混合的磁性，和用于快速分离的重量。
全文摘要
由至少一种第一和至少一种第二成分构成的耐贮藏微粒,其中:－至少一种可交联聚合物作为外壳的第二成分,至少部分地包被和/或包围作为核芯的该第一成分,以及－该第一成分具有至少一种可确定的特性,可藉以下方法获得,－将该第一成分与可交联聚合物反应,随后将形成的产物与一交联剂反应使得具有耐贮藏性的第一成分留在第二成分内。
文档编号G01N33/58GK1207810SQ96199745
公开日1999年2月10日 申请日期1996年11月22日 优先权日1995年11月22日
发明者D·普拉克斯纳, E·格罗马科维斯凯尔, C·艾尔哈德特 申请人:阿比翁参股及管理股份有限公司
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