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专利名称：一种检测早期癌症的试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及医学及药学领域。更具体地涉及一种检测早期癌症的试剂盒，适用于消化道癌的检测，同时还涉及一种检测的方法。
背景技术：
据统计，我国每年新患癌症的病人约160万人，每年因癌症死亡的人数约130万人。我国大、中城市居民的许多死亡原因中，癌症是第一位死因，在农村的各项死因中，癌症是第二位死因。对中、老年人来说癌症是多发病、常见病。按目前的医疗水平，对早期癌症病人的治疗约有80％-90％以上可以治愈；但是，晚期的癌症病人，在治疗后能生存5年以上的人，就比较少了。早期癌症病人治疗后，不仅提高了生存率，同时也提高了病人的生存质量。癌症病人的死亡率随之也降下来了。早期癌症病人的治疗要比晚期癌症病人的治疗节省许多人力、财力和时间。因此，癌症早期发现即早期诊断就显得尤为重要。
癌症检测主要是检测肿瘤标志物。肿瘤标志物种类很多，目前发现的已有100多种，可分为酶类肿瘤标志物，如ALP、LD等，激素类标志物，如CT、hCG等，胚胎抗原，如AFP、CEA，特种蛋白类抗原，如CK、TPA、TPS，糖蛋白类抗原，如CA125、CA15-3、CA19-9等，血中癌基因蛋白，如ras基因蛋白、myc基因蛋白等。每种标志物都有其检测方法，但绝大多数都是检测血液，因此是一种有损检测方式，而检测尿液中的L-岩藻糖只需以人的尿液作标本，对人无损伤，因此更容易被人们接受。已有的检测L-岩藻糖的方法主要是利用L-岩藻糖脱氢酶催化L-岩藻糖脱氢还原NAD+或NADH，而NADH在340nm光波下有吸光度，根据其吸光度变化来测定L-岩藻糖的浓度(NODA SANGYOKAGAKU KBNKYUSHO专利号JP2084177；TADARA SHUZO COLTD(TAKI)专利号，DE3702159-A1，DE3702159-A，JP62175197A，DE3702159-C，AraKiE，et.al.RinshoByori1992 Aug，40(8)，86874，SaKaiT，et.al，Clinchem，1990 Mar；36(3)474-6)。测定NADH 340nm下的光吸收需紫外光度分析仪或专门的分析仪，而且需要专门的技术人员操作，使用起来不是很方便，检测费用较高，不便于推广。

发明内容
本发明的目的是在于提供一种检测早期癌症的试剂盒，利用L-岩藻糖脱氢还原NAD+生成NADH后还原NBT而生成有色物质而显色，而且在L-岩藻糖正常含量下不显色，在癌变情况下，L-岩藻糖超出正常范围可以显色。检测结果非常直观，肉眼可见，检测效果高，消化道癌阳性率可达85-90％。
本发明的另一个目的在于提供一种早期癌症试剂盒的检测方法，方法易行，普通的医务人员操作方便。
为了达到上述任务，本发明采用以下技术措施试剂盒组成由A-液、B-液、C-液组成。其中A-液由0.1-1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl)缓冲液(pH8.0-8.5)配制而成，每升内含0.663-6.63克氧化型辅酶I(NAD+)、0.1-1.0克氯化硝基四氮唑蓝(NBT)，B-液是0.01-0.1mol/L甲基吩嗪甲基硫酸盐(PMS)水溶液，C-液为L-岩藻糖脱氢酶(50-100U/ml)组成；检测步骤为A、从新鲜猪肝中提取L-岩藻糖脱氢酶新鲜猪肝250克用组织捣碎机匀浆，然后加1L0.25mol/L蔗糖，25000g离心20min，弃沉淀取上清，加450ml饱和硫酸铵，放置15min后25000g离心20min，弃沉淀取上清，加400ml饱和硫酸铵，放置15min后25000g离心20min，弃上清去沉淀，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)透析，取透析液上二乙胺基乙基(DEAE)纤维素柱(DE52)，用含0.05-0.15mol/L氯化钠(NaCl)的0.005mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)梯度洗脱，收集0.1-0.15mol/L氯化钠(NaCl)的洗脱部分经浓缩，测定L-岩藻糖脱氢酶，放置-70℃冰箱备用。
B、采用试剂盒中的A-液、B-液和C-液；C、检测方法取病人尿液50-100μl，加入A-液10-50μl、B-液1-10μl、C-液50-100μl，37C保温10-20min观察反应显色为蓝色或蓝紫色为阳性，阴性对照应为黄色。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果从猪肝中提取L-岩藻糖脱氢酶原料价格非常便宜且容易获得，因而成本低。用尿液作检测标本对病人无损伤，试剂盒使用起来操作非常简单，结果观察不需要任何仪器，肉眼就可以观察，非常直观，易于推广。试剂成本低，价格便宜，适合于作普查或筛查。
检测效果消化道癌(包括胰腺癌、食管癌、胃癌、肠癌和肝癌等)，阳性率可达85-90％。
具体实施例方式
1、L-岩藻糖脱氢酶的分离、提取从新鲜猪肝中提取L-岩藻糖脱氢酶新鲜猪肝250克用组织捣碎机匀浆，然后加1L0.25mol/L蔗糖，25000g离心20min，弃沉淀取上清，加450ml饱和硫酸铵，放置15min后25000g离心20min，弃沉淀取上清，加400ml饱和硫酸铵，放置15min后25000g离心20min，弃上清去沉淀，用0.005M磷酸盐缓冲液(PBS)透析，取透析液上二乙胺基乙基(DEAE)纤维素柱(DE52)，用含0.05-0.15mol/L氯化钠(NaCl)的0.005mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)梯度洗脱，收集0.1-0.15mol/L氯化钠(NaCl)的洗脱部分经浓缩，测定L-岩藻糖脱氢酶，放置-70℃冰箱备用。
2、试剂盒组成A-液由0.1或0.3或0.5或0.7或0.9或1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl)缓冲液(pH为8.0或8.2或8.3或8.5配制而成，每升内含0.663或0.665或0.76或1.8或2.65或3.98或4.56或5.8或6.2或6.45或6.63克氧化型辅酶I(NAD+)、0.1或0.3或0.5或0.7或0.9或1克氯化硝基四氮唑蓝(NBT)；B-液0.01或0.03或0.05或0.08或0.1mol/L甲基吩嗪甲基硫酸盐(PMS)；C-液L-岩藻糖脱氢酶(50或55或60或68或74或88或95或100U/ml)组成；3、检测方法取病人尿液50μl或75μl或100μl，分别加入A-液10μl或25μl或50μl，B-液1μl或5μl或10μl，C-液50μl或100μl，混匀后，37℃保温10-20min，观察反应结果显色为蓝色或蓝紫色为阳性，阴性对照则为黄色。
4、临床样品的检测用构建的试剂盒检测来自湖北省肿瘤医院、武汉大学中南医院、武汉大学人民医院、华中科技大学同济医院的肿瘤病人的尿液样本。共检测消化道癌58侧(肝癌、食管癌、胃癌、肠癌、胰腺癌)、乳腺癌28侧、宮颈癌25侧、肺癌33侧、淋巴癌10侧，检测结果列于表1。
表1、用癌症早期诊断试剂盒检测肿瘤病人尿液标本的检测结果

权利要求
1.一种检测早期癌症的试剂盒，其特征在于试剂盒中的A-液为0.1-1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，pH8.0-8.5，每升内含0.663-6.63克氧化型辅酶I、0.1-1克氯化硝基四氮唑蓝，B-液为0.01-0.1mol/L甲基吩嗪甲基硫酸盐，C-液为L-岩藻糖脱氢酶50-100U/ml。
2.一种用于实现权利要求1所述的检测早期癌症的试剂盒的方法，它包括下列步骤A、从猪肝中提取L-岩藻糖脱氢酶新鲜猪肝250克用组织捣碎机匀浆，然后加1L 0.25M mol/L蔗糖，25000g离心20min，弃沉淀取上清，加450ml饱和硫酸铵，放置15min后25000g离心20min，弃沉淀取上清，加400ml饱和硫酸铵，放置15min后25000g离心20min，弃上清去沉淀，用0.005M磷酸盐缓冲液透析，取透析液上二乙胺基乙基纤维素柱，用含0.05-0.15mol/L氯化钠的0.005mol/L磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集0.1-0.15mol/L氯化钠的洗脱经浓缩，测定L-岩藻糖脱氢酶，放置-70℃冰箱备用；B、采用试剂盒中的溶液；C、检测取病人尿液50-100μl，分别加入A-液10-50μl、B-液1-10μl、C-液50-100μl，混匀后，37℃保温10-20min，观察反应结果显色为蓝色或蓝紫色为阳性，阴性对照则为黄色。
全文摘要
本发明公开了一种检测早期癌症的试剂盒及方法，该试剂盒包括A－液、B－液、C－液，其步骤是首先从猪肝中提取L－岩藻糖脱氢酶，置－70℃冰箱备用；其次是采用试剂盒中的溶液；然后是取病人尿液，分别加入A－液、B－液、C－液，保温，观察反应，检测结果非常直观，肉眼可见，检测效果高，消化道癌阳性率可达85－90％。本发明方法易行，普通的医务人员操作方便。
文档编号G01N1/34GK1773261SQ20051001973
公开日2006年5月17日 申请日期2005年11月3日 优先权日2005年11月3日
发明者吴建国, 邬开朗, 刘芳, 朱应, 祝成亮 申请人:武汉大学