专利名称：有机磷农药仿生识别检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新颖的农药残留快速检测方法和器具，属于食品安全，环境监测、测领域，更确切的说是涉及一种有机磷农药仿生识别检测试剂盒。
背景技术：
农药是当前农业生产中用于防治病，虫，杂草对农作物�：Σ豢扇鄙俚奈镏�。目前，全国农业使用农药为23万吨左右，每公顷使用农药24.2公斤。其中，杀虫杀螨剂占62％；杀菌剂占21％；除草剂占17％；杀鼠剂和植物生长调节剂所占比例很小。至今农药每亩用量约2公斤；其防治面积达23亿亩左右，约占总面积的85％；每年可挽回粮食损失200-300亿公斤。农药对于农业增产可谓功不可没。与此同时，农药的大面积使用也带来了严重的食品安全与环境问题一是农药残留污染环境、污染农产品，影响我国农产品出口，引起人、畜中毒事故；二是有害生物对农药产生抗性，使防治效果下降，不得不加大用量，造成防治难度加大；三是被控制的有害生物再度猖獗和次要对象上升为主要对象。但是就目前形式而言，人类仍然面临饥饿，贫穷的困扰，全面禁止农药的使用是不现实的，为了满足日益增加的粮食需求，在一定时期内农药的使用还将维持在一个较高的水平内，它的地位也是无法取代的。
随着我国加入WTO，国际间农产品贸易往来更加频繁，我国对欧美以及日韩的农产品的出口呈现快速增长的态势。随之而来，欧美，日韩发达国家针对我国农产品的绿色贸易壁垒也日益增加，每年农副产品因农药残留超标而造成的直接经济损失就多达70多亿美元，进出口对农产品中农药残留的检测能力提出了更高要求。目前我国蔬菜，水果和粮食农药超标率平均值分别达到22.15％，18.79％和6.2％，由此导致我国每年农药中毒者达几十万人次，而其中有机磷农药中毒占70％以上。这些都迫使我国发展相关的检测农药残留的技术，以有效控制农业生产中农药的合理使用，并对其残留进行监控，特别是需要发展针对有机磷农药的检测技术。
目前有机磷农药的残留分析方法主要是通过提�。换螅倥湟愿咝б合嗌谆蚱嗌�。这些检测方法费用相对昂贵，样品前处理过程复杂，对仪器设备要求较高，而且需要消耗大量的有机溶剂，还会造成对环境的二次污染。
已有免疫分析是一种快速、灵敏、操作简单的、较为新颖的检测方法，其具有较为低的检测线。但是农药多为小分子化合物，需要通过与大分子蛋白类物质偶连后才可用于免疫动物，刺激动物免疫系统来产生针对小分子农药的抗体。而大多数农药本身不具备直接同蛋白大分子物质偶连的位点，因此需要对农药进行改造，前期研发费用较高。另外蛋白质的低稳定性，也使得免疫分析法在实际检测中难以推广与应用。
而分子印迹技术是近年来集高分子合成、分子设计、分子识别、仿生生物工程等众多学科优势发展起来的一门边缘学科分支。分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，MIPs)既具有与天然抗体同样的识别性能，又具有和高分子同样的高稳定性，因而广泛应用于生物工程、临床医学、环境监测、食品工业等众多领域，已经成为新世纪最有潜力的新材料之一。
荧光分析法是一种较为常见的分析方法，它是利用分子的光致发光现象进行分析的。荧光分析法具有灵敏度高的特点(比紫外、可见分光光度法高2～3个数量级)，可借此实现高灵敏度(低检测线)的试剂盒。
已有技术所制备的试剂盒中，常规无机显色试剂盒灵敏度太低；免疫类试剂盒使用条件苛刻，限制了试剂盒的推广和普及。
发明内容
本发明的目的是提供一种有机磷农药仿生识别检测试剂盒，以弥补现有技术和普通试剂盒的不足。即以分子印迹聚合物对模板分子的特异性吸附实现对有机磷农药的仿生识别，并扩展试剂盒的使用范围；以荧光表达实现高灵敏度分析。
本发明是根据分子印迹的原理制备对有机磷农药具有仿生识和检测功能的分子探针，分子探针直接涂布在96孔聚苯乙烯酶联板上，并将涂布有分子探针的96孔聚苯乙烯酶联板装配于试剂盒内，制得对有机磷农药仿生识别、检测的试剂盒。当分子探针与有机磷农药相结合，则进行仿生识别。由于对有机磷的特异性吸附，使得稀土金属元素与功能单体的配位发生变化，发出特异性的荧光，进而将结果表达出来，达到对有机磷农药仿生识别检测的目的。因此试剂盒的关键技术是制备各种有机磷农药分子探针。
本发明是将分子印迹技术与荧光分析法相结合，利用分子印迹技术的仿生识别特性，完成对模板分子的主动吸附和仿生识别，其后将分析结果以荧光的形式表达出来，使制得的试剂盒同时赋有灵敏度高、使用范围广、限制条件少的优点。
因此，本发明方法是首先用稀土金属硝酸盐与功能单体制备出配位复合物，然后在配位复合物周围发生分子印迹聚合反应，形成包含模板分子的聚合物分子探针粘稠液，涂布在酶联板上，经模板分子洗脱装于试剂盒即可。
a.制备配位复合物(1)在反应器中将稀土金属氧化物溶于水中，按照反应比例加入浓度为28％～65％的硝酸，得到相应的稀土元素的硝酸盐澄清溶液；(2)模板分子溶于30mL甲醇/水体积比为10/1～1/10的混合溶液中，搅拌至完全溶解后加入稀土金属氧化物三倍量的苯甲酸烯酯类功能单体，待功能单体完全溶解后加入前述硝酸盐溶液，得到溶液A；(3)用1～2mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液A的pH值为8～10，之后搅拌此混合溶液1～72小时，至有絮状物出现；(4)然后将(3)中反应器盖上玻璃盖置于暗室中，过夜结晶；过滤并干燥结晶得到制备分子探针用的配位复合物；b.印迹模板分子(1)将1～5mol％上述配位复合物置于反应器中，加入90～98mol％苯乙烯，待配位复合物完全溶解后，加入引发剂，交联剂，搅拌均匀得到半透明状溶液；(2)密封(1)中反应器，通氮气1～60分钟，去除氧气以及水分，得到待反应溶液B；(3)将上述溶液B置于50～80℃水浴槽中，超声反应1～12小时，得到粘稠液，即为含有对有机磷农药具有仿生识别和检测功能的分子探针粘稠液；(4)将分子探针粘稠液直接涂布在96孔聚苯乙烯酶联板上，在紫外灯下老化1～24小时，待粘稠液硬化变为固态，即得到涂布有对有机磷农药具有仿生识别和检测功能的分子探针的96孔聚苯乙烯酶联板；c.洗脱模板分子(1)将涂布有分子探针的96孔聚苯乙烯酶联板浸泡在水中，振荡、溶胀1～12小时；(2)用甲醇与水混合液振荡洗涤，逐渐增加甲醇含量至2/3，去除未反应的功能单体，得到不含功能单体的酶联板；(3)之后浸泡在0.1～1mol/L的硝酸溶液中1～24小时，洗去未配位的金属离子，干燥后装入试剂盒。
其中上述配位金属为稀土元素，如铕；模板分子为各种需要检测的有机磷农药，如乙基对硫磷、甲基对硫磷、马拉硫磷等；功能单体为苯甲酸烯酯类，如苯甲酸乙烯酯、苯甲酸丙稀酯等；交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、二乙烯基苯(DVB)；引发剂为偶氮化合物类、过氧化物类引发剂。
由此构筑的本发明有机磷农药仿生识别检测试剂盒，结合了分子印迹技术的仿生识别原理和荧光的低检出线性质，具有试剂盒结构简单、操作方便、诊断准确率高、敏感性好、适应性广、成本低的特点，易于推广和普及，适用于食品安全与环境监测、检测等相关领域。
具体实施例方式
实施例1.
以乙基对硫磷为模板分子，制备对乙基对硫磷具有仿生识别和检测功能的分子探针，并制备相对应的试剂盒。
a.制备配位复合物(1)反应器中将0.2mmol Eu2O3溶于水中，加入反应比例的65％硝酸，得到澄清的硝酸铕溶液；(2)选取模板分子为乙基对硫磷0.2mmol溶于30mL甲醇/水体积比为1/1的混合溶液中，搅拌至完全溶解后加入反应比例的功能单体苯甲酸乙烯酯0.6mmol，功能单体完全溶解后加入前述硝酸铕溶液，得到溶液A；(3)用2mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液A至pH值为9，之后搅拌4小时，溶液变为微黄色，并有絮状物出现；(4)将(3)中反应器盖上玻璃盖置于暗室中，过夜结晶；过滤并干燥结晶得到制备分子探针用的黄色配位复合物；b.印迹模板分子(1)在反应器中将所制得的配位复合物溶解在1.5mL苯乙烯中，待完全溶解后依次加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)2.5mg，交联剂二乙烯基苯(DVB)40μL，摇匀得到黄色半透明状溶液；(2)封闭(1)中反应器，通氮气10分钟去除氧气以及水分，得到待反应溶液B；(3)将溶液B的反应器置于60℃水浴中，超声反应4小时，得到一黄色粘稠液，即为含有对有机磷农药具有仿生识别和检测功能的分子探针的粘稠液；(4)将分子探针粘稠液直接涂布在96孔聚苯乙烯酶联板上，在紫外灯下老化2小时；得到涂布有对有机磷农药具有仿生识别和检测功能的分子探针的96孔聚苯乙烯酶联板，酶联板表面为黄色；c.模板分子洗脱(1)将涂布有分子探针的96孔聚苯乙烯酶联板浸泡在水中，振荡溶胀2小时；(2)用甲醇与水混合液洗涤、震荡，逐渐增加甲醇含量至2/3，去除未反应的功能单体，至酶联板表面变为白色；(3)之后浸泡在1mol/L的硝酸溶液中，震荡2小时，洗去未配位的金属离子，干燥后装入试剂盒。
所制得的有机磷农药仿生识别检测试剂盒，是以乙基对硫磷为模板分子制备对乙基对硫磷具有仿生识别和检测功能的分子探针，本试剂盒对乙基对硫磷的检出限为1ppb(1ng/L)。
实施例2.
以甲基对硫磷为模板分子，制备对甲基对硫磷具有仿生识别和检测功能的分子探针，并制备相对应的试剂盒。
a.制备配位复合物(1)在反应器中将0.2mmol Eu2O3溶于水中，加入反应比例的28％硝酸，得到澄清的硝酸铕溶液；(2)模板分子甲基对硫磷0.2mmol溶于30mL甲醇/水体积比为5/1的混合溶液中，搅拌至完全溶解后加入功能单体苯甲酸丙烯酯0.6mmol，功能单体完全溶解后加入前述硝酸铕溶液，得到溶液A；(3)1mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液A的pH值至10，得到澄清溶液；搅拌混合溶液60小时，至溶液变为微黄色，并有絮状物出现；(4)将(3)中反应器盖上玻璃盖置于暗室中，过夜结晶；过滤并干燥结晶得到制备分子探针用的黄色配位复合物；b.印迹模板分子(1)在反应器中将所制得的配位复合物溶解在1.5mL苯乙烯中，待完全溶解后依次加入引发剂过氧化二苯甲酰(BPO)6mg，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)40μL，摇匀得到黄色半透明状溶液；(2)封闭(1)中反应器，通氮气60分钟除氧气以及水分，得到待反应的溶液B；(3)上述溶液B的反应器于60℃水浴超声10小时，得到一黄色粘稠溶液，即为含有对有机磷农药具有仿生识别和检测功能的分子探针的粘稠液；(4)将分子探针粘稠液直接涂布在96孔聚苯乙烯酶联板上，在紫外灯下老化12小时；得到涂布有对有机磷农药具有仿生识别和检测功能的分子探针的96孔聚苯乙烯酶联板，酶联板表面为黄色；c.模板分子洗脱(1)将涂布有分子探针的96孔聚苯乙烯酶联板浸泡在水中，振荡溶胀12小时；(2)用甲醇与水混合液洗涤、震荡，逐渐增加甲醇含量至2/3，去除未反应的功能单体，至酶联板表面变为白色；(3)之后浸泡在0.1mol/L的硝酸溶液中24小时，洗去未配位的金属离子，干燥后装入试剂盒。
所制得的有机磷农药仿生识别检测试剂盒，是以甲基对硫磷为模板分子制备对甲基对硫磷具有仿生识别和检测功能的分子探针，本试剂盒对甲基对硫磷的检出限为1ppb(1ng/L)。
实施例3.
以马拉硫磷为模板分子，制备对马拉硫磷具有仿生识别和检测功能的分子探针，并制备相对应的试剂盒。
a.制备配位复合物(1)反应器中将0.2mmol Eu2O3溶于水中，加入反应比例的35％硝酸，得到澄清的硝酸铕溶液；(2)选取模板分子为马拉硫磷0.2mmol溶于30mL甲醇/水体积比为1/1的混合溶液中，搅拌至完全溶解后加入反应比例的功能单体苯甲酸乙烯酯0.6mmol，功能单体完全溶解后加入前述硝酸铕溶液，得到溶液A；(3)用1mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液A的pH值为8.5，之后搅拌24小时，溶液变为微黄绿色，并有絮状物出现；(4)将(3)中反应器盖上玻璃盖置于暗室中，过夜结晶；过滤并干燥结晶得到制备分子探针用的黄绿色配位复合物；b.印迹模板分子(1)在反应器中将所制得的配位复合物溶解在1.5mL苯乙烯中，待完全溶解后依次加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)2.5mg，交联剂二乙烯基苯(DVB)40μL，摇匀得到半透明状黄绿色溶液；(2)封闭(1)中反应器，通氮气10分钟去除氧气以及水分，得到待反应溶液B；(3)将溶液B的反应器置于50℃水浴中，超声反应10小时，得到一黄绿色粘稠液，即为含有对有机磷农药具有仿生识别和检测功能的分子探针的粘稠液；(4)将分子探针粘稠液直接涂布在96孔聚苯乙烯酶联板上，在紫外灯下老化5小时；得到涂布有对有机磷农药具有仿生识别和检测功能的分子探针的96孔聚苯乙烯酶联板，酶联板表面为黄绿色；c.模板分子洗脱(1)将涂布有分子探针的96孔聚苯乙烯酶联板浸泡在水中，振荡溶胀10小时；(2)用甲醇与水混合液洗涤、震荡，逐渐增加甲醇含量至2/3，去除未反应的功能单体，至酶联板表面变为白色；(3)之后浸泡在0.5mol/L的硝酸溶液中，震荡5小时，洗去未配位的金属离子，干燥后装入试剂盒。
所制得的有机磷农药仿生识别检测试剂盒，是以马拉硫磷为模板分子制备对马拉硫磷具有仿生识别和检测功能的分子探针，本试剂盒对马拉硫磷的检出限为1ppb(1ng/L)。
权利要求
1.一种有机磷农药仿生识别检测试剂盒，由盒体内96孔聚苯乙烯酶联板、相应的检测有机磷农药用的分子探针、标准浓度的有机磷农药溶液构成，其特征在于所述的分子探针是利用分子印迹方法制备的对有机磷农药具有仿生识别和检测功能的分子探针。
2.如权利要求1所述的有机磷农药仿生识别检测试剂盒，其特征在于所述的分子探针的制备方法，包括以下步骤a.制备配位复合物(1)在反应器中将稀土金属氧化物溶于水中，按照反应比例加入浓度为28％～65％的硝酸，得到相应的稀土元素的硝酸盐澄清溶液；(2)模板分子溶于30mL甲醇/水体积比为10/1～1/10的混合溶液中，搅拌至完全溶解后加入稀土金属氧化物三倍量的苯甲酸烯酯类功能单体，待功能单体完全溶解后加入前述硝酸盐溶液，得到溶液A；(3)用1～2mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液A的pH值为8～10，之后搅拌此混合溶液1～72小时，至有絮状物出现；(4)然后将(3)中反应器盖上玻璃盖置于暗室中，过夜结晶；过滤并干燥结晶得到制备分子探针用的配位复合物；b.印迹模板分子(1)将1～5mol％上述配位复合物置于反应器中，加入90～98mol％苯乙烯，待配位复合物完全溶解后，加入引发剂，交联剂，搅拌均匀得到半透明状溶液；(2)密封(1)中反应器，通氮气1～60分钟，去除氧气以及水分，得到待反应溶液B；(3)述溶液B置于50～80℃水浴槽中，超声反应1～12小时，得到粘稠液，即为含有对有机磷农药具有仿生识别和检测功能的分子探针粘稠液；(4)将分子探针粘稠液直接涂布在96孔聚苯乙烯酶联板上，在紫外灯下老化1～24小时，待粘稠液硬化变为固态，即得到涂布有对有机磷农药具有仿生识别和检测功能的分子探针的96孔聚苯乙烯酶联板；c.洗脱模板分子(1)将涂布有分子探针的96孔聚苯乙烯酶联板浸泡在水中，振荡、溶胀1～12小时；(2)用甲醇与水混合液振荡洗涤，逐渐增加甲醇含量至2/3，去除未反应的功能单体，得到不含功能单体的酶联板；(3)之后浸泡在0.1～1mol/L的硝酸溶液中1～24小时，洗去未配位的金属离子，干燥后装入试剂盒。
3.如权利要求2所述的有机磷农药仿生识别检测试剂盒制备方法，其特征是所述的稀土金属为铕。
4.如权利要求2所述的有机磷农药仿生识别检测试剂盒制备方法，其特征是所述的功能单体为苯甲酸乙烯酯、苯甲酸丙稀酯。
5.如权利要求2所述的有机磷农药仿生识别检测试剂盒制备方法，其特征是所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯。
6.如权利要求2所述的有机磷农药仿生识别检测试剂盒制备方法，其特征是所述的引发剂为偶氮化合物类、过氧化物类引发剂。
全文摘要
本发明涉及一种有机磷农药仿生识别检测试剂盒。试剂盒由盒体内96孔聚苯乙烯酶联板、相应有机磷农药的仿生识别分子探针、标准浓度的有机磷溶液构成。其特征是在96孔聚苯乙烯酶联板上涂布有对有机磷农药具有仿生识别和检测功能的分子探针。制备方法是首先用稀土金属硝酸盐与功能单体制备出配位复合物，然后使配位复合物发生分子印迹聚合反应，形成包含模板分子的分子探针粘稠液，涂布在酶联板上，经模板分子洗脱装于试剂盒即可。本发明充分利用了分子印迹技术，并与其后的荧光分析相结合，大大提高了对有机磷农药的检出能力，该试剂盒结构简单、操作方便、诊断准确率高、敏感性好、适应性广、成本低，易于推广和普及。
文档编号G01N21/76GK1773287SQ20051001806
公开日2006年5月17日 申请日期2005年9月30日 优先权日2005年9月30日
发明者杨黄浩, 周文辉, 尹晓斐 申请人:国家海洋局第一海洋研究所
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