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专利名称：辅助诊断肺癌淋巴结转移的试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助诊断肺癌淋巴结转移的试剂。
背景技术：
肿瘤已经成为严重威胁人类生存健康的重大疾病之一，其发病率及死亡率均呈逐年上升趋势，而肺癌每年新增病例数及死亡数均居各种恶性肿瘤前列。研究表明，有90 %的肺鳞癌病人死于肿瘤的转移，这在一定程度上是由于肺癌无明确的前哨淋巴结，手术过程中局限于淋巴结清扫范围的限制，可能存在潜在的光镜无法检测的微小转移灶，最终导致淋巴结转移诊断困难进而影响治疗方案的制定及病人的生存率。因此，利用分子标记物辅助临床诊断，无疑对肺癌病人的诊治及生存率的提高有重要意义。高通量技术(如基因芯片技术)的出现，极大的推动了肿瘤分子标记物的筛选。基于这些技术，涌现出一批用于肿瘤诊断及预后预测的分子标记物。但这些方法均基于DNA、 RNA风度的检测。而这些生物大分子均位于中心法则上游，并非功能的直接执行者。且其检测方法在临床诊断中尚未普及，与临床脱节较大，实用性不高。

发明内容
本发明的目的是提供一种辅助诊断肺癌淋巴结转移的试剂。本发明提供了一种试剂，包括如下七种抗体抗MMPl抗体、抗TIMPl抗体、抗 IQGAPl抗体、抗CTSD抗体、抗TPX2抗体、抗uPA抗体和抗FSCNl抗体，所述试剂可用于辅助诊断肺癌淋巴结转移和/或辅助评估肺癌淋巴结转移风险。所述试剂还可包括第八种抗体，即抗plgR/SC抗体。所述试剂具体可由所述抗MMPl抗体、所述抗TIMPl抗体、所述抗IQGAPl抗体、所述抗CTSD抗体、所述抗TPX2抗体、所述抗uPA抗体、所述抗FSCNl抗体和所述抗plgR/SC 抗体组成。每种所述抗体均单独包装。每种所述抗体均可为单克隆抗体或商业途径获得的多克隆抗体。所述抗MMPl抗体具体可为Oncogene生产的产品目录号为MS-802-P的抗体；所述抗TIMPl抗体具体可为Santa Cruz生产的产品目录号为sc_21734的抗体；所述抗IQGAPl 抗体具体可为BD Biosciences生产的产品目录号为610612的抗体；所述抗CTSD抗体具体可为Santa Cruz生产的产品目录号为sc-10725的抗体；所述抗TPX2抗体具体可为 Biolegene生产的产品目录号为628002的抗体；所述抗uPA抗体具体可为Calbiochem生产的产品目录号为1M13L的抗体；所述抗FSCNl抗体具体可为Santa Cruz生产的产品目录号为sc-21743的抗体；所述抗plgR/SC抗体具体可为DAKO生产的产品目录号为A0187的抗体。所述试剂可用于制备辅助诊断肺癌淋巴结转移和/或辅助评估肺癌淋巴结转移风险的试剂盒。本发明还保护包括所述试剂的试剂盒，所述试剂盒可用于辅助诊断肺癌淋巴结转移和/或辅助评估肺癌淋巴结转移风险。对于待测样本(待测患者的组织切片)，可以分别用8个抗体进行免疫组化，得到 8个抗原的评分结果，再根据各个抗原的评分结果进行诊断或评估。本方法的优点在于一次性得到所有抗原的评分结果，节省时间，但部分评分结果没有得到应用。对于待测样本(待测患者的组织切片)，也可以按图1所示的顺序依次用不同抗体进行免疫组化，依次根据抗原的评分结果进行下一步骤，最终得到诊断结果或评估结果。本方法的优点在于只依次采用部分抗体即可得到诊断或评估结果，节省抗体的用量，但所需时间较长。本发明提供的试剂包括用于检测8个蛋白标记物(MMP1，TIMPl, IQGAPl, TPX2， uPA, Cathepsin-D, Fascin及plgR/SC)的8种抗体。应用8种抗体，通过免疫组织化学染色结果，可以辅助诊断肺癌淋巴结转移，有望应用于肺鳞癌淋巴结转移风险评估及预后预测。应用本发明的试剂辅助诊断时，基于临床常规免疫组织化学染色技术，在具有较高的可信性的同时，具有较强的实用性和临床使用价值。应用本发明的试剂盒进行检测，具有如下优点(1)在整个诊断过程中，每个节点处均只对单一蛋白质的免疫组化评分结果进行检验，不同节点(蛋白标记物)间完全独立， 因此回避了不同蛋白质免疫组化评分间不可比的问题；(2)基于手术切除的原发灶肿瘤组织进行染色，及回避了手术中淋巴结清扫范围的问题，又与临床病理科常规的诊断所用材料一致，极大的增加了在临床中的可用性；(3)基于基于生物功能的执行者-蛋白质的表达水平，更为准确。


图1为52例肺鳞癌患者应用实施例2的试剂辅助诊断淋巴结转移的流程图；图中圆形表示用于分组的蛋白分子标记物，其内部包括蛋白质名称及根据该蛋白进行判别分组时两组间差异的显著性；圆形下部为进行判断的免疫组化评分；满足该评判标准的病例依连线方向进入下面相应蛋白表达水平的检验；图中最底部为分组的“终点”;HR表示淋巴结转移，LR则表示淋巴结未转移。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、试剂的开发过程训练集(training set)包含255例肺癌病例。首先构建了一套肺癌组织微阵列， 利用其中包含肺鳞癌的组织芯片，完成了共计23个候选肺癌相关标志蛋白的免疫组织化学染色及结果分析。在此基础上，采用广义线性回归模型(Generalized Linear Model, GLM)针对上述23个候选标志蛋白在319例肺鳞癌原发瘤组织中的表达状况与淋巴结转移的关系进行了研究。结果显示，在23个蛋白中共有9个表达水平与淋巴结转移显著相关 (P < 0. 05)。其中 TIMPl、MMPl、TPX2、Aurora-A、uPA、0steopontin 和 CattKipsin-D 与淋巴结转移呈正相关关系——它们在原发瘤中表达越强，发生肿瘤淋巴结转移的风险越高；而 nm23-Hl与14_3_3的表达则与淋巴结转移负相关。根据上述广义线性回归模型的计算结果，将23个蛋白的免疫组化评分“重编码”。 即，所有GLM模型认为与淋巴结转移具有负相关关系的蛋白，将其免疫组织化学评分值乘以“_1”成为负值；而与淋巴结转移具有正相关关系的蛋白其免疫组化评分保持不变。如此 “重编码”的免疫组化评分作为“input”用于下一步数学模型的构建。这样“重编码”后的数据其符号直接反映了蛋白质表达与淋巴结转移(或淋巴结转移风险)的关系，有助于后期构建决策树模型进行诊断(或风险预测)。考虑到不同蛋白质的细胞定位不同(部分蛋白定位于细胞核，另部分蛋白定位于细胞浆中)，染色所用抗体的效价及染色效果也大不相同，因此不同蛋白免疫组化评分结果不具有可比性。同时，现有的基于生物芯片的分子标记物研究中所采用的数据预处理及统计学方法，如支持向量机(Supported Vector Machine, SVM)、K近邻法(K Nearest Neighborhood, KNN)等均要求所处理的不同基因/探针间可比。因此对不同蛋白质的免疫组织化学染色评分数据使用这些常见的分子分型方法将直接导致错误的结果。针对这样一组数据的特点，在方法学上选择采用“递归分割决策树”(Recursive Partitioning Decision Tree)算法建立肺癌淋巴结转移诊断模型(或预测模型)。在该方法建立的决策树模型中，每例病例的免疫组化评分信息自决策树上端(根部)进入模型，在每个节点处对其标明的单一蛋白标记物的免疫组化评分进行检验，并根据决策标准选择进入下一级检验过程并继续根据决策标准进行判断，直至到达该树状模型最下端的“终点”，并得到基于该模型的淋巴结转移诊断结果(或风险预测结果)。将利用上述递归分割树模型判别的淋巴结转移诊断结果与肺癌病例手术后的组织病理学诊断结果进行比较，发现其在“训练集”中正确率为78. 0%，敏感性与特异性分别为 83. 0%与 70. 3%。实施例2、试剂的组成试剂由独立包装的八种抗体组成；八种抗体均为购买得到，具体如下抗MMPl抗体0ncogene生产，产品目录号为MS-802-P，使用浓度为1 300。抗TIMPl抗体Santa Cruz生产，产品目录号为sc-21734，使用浓度为1 50。抗IQGAPl抗体BD Biosciences生产，产品目录号为610612，使用浓度为 1 100。抗CTSD抗体Santa Cruz生产，产品目录号为sc-10725，使用浓度为1 100。抗TPX2抗体Biolegene生产，产品目录号为拟8002，使用浓度为1 500。抗uPA抗体Calbiochem生产，产品目录号为1M13L，使用浓度为1 100。抗plgR/SC抗体DAKO生产，产品目录号为A0187，使用浓度为1 300。抗FSCNl抗体=Santa Cruz生产，产品目录号为sc-21743，使用浓度为1 100。该试剂应用于检测如下八种抗原(蛋白标记物)胞浆抗原MMP1，TIMPl,IQGAP1, uPA, CTSD (Cathepsin-D), FSCNl (Fascin)和 plgR/SC ；细胞核抗原TPX2。MMPl (中文名称为基质金属蛋白酶1，英文名称为matrix metallop印tidase 1， Swiss-Prot ACCESSION NO. P03956)。TIMPl (中文名称为金属蛋白酶组织抑制剂1，英文名称为 tissue inhibitor of metalloproteinase 1，Swiss-Prot ACCESSION NO. P01033)。 IQGAP1(中文名称为含IQ基序的GTP酶激活蛋白1，英文名称为IQ motif containing GTPase activating protein 1, Swiss-Prot ACCESSION NO. P46940)。uPA(中文名称为尿 #61^^ ^ ]^ , :^ plasminogen activator, urokinase, Swiss-Prot ACCESSION NO. P00749)。CTSD (中文名称为组织蛋白酶D，英文名称为cath印sin D, Swiss-Prot ACCESSION NO. P07339)。FSCNl (中文名称为 fascin 同系物 1，英文名称为 fascin homolog 1, Swiss-Prot ACCESSION NO. Q16658)。plgR/SC(中文名称为多聚免疫球蛋白受体分泌片段，英文名禾尔为polymeric immunoglobulin receptor/secretory component, Swiss-Prot ACCESSION NO. P01833)。TPX2 (中文名称为微管相关蛋白同系物， 英文名称为 microtubule-associated，homolog, Swiss-Prot ACCESSION NO. Q9ULW0)。实施例3、试剂的应用52例肺鳞癌患者(知情同意的志愿者)，其中M例为发生淋巴结转移的患者，观例为未发生淋巴结转移的患者。用实施例2的试剂对52例肺鳞癌患者进行免疫组化(每个患者分别用试剂中的八种抗体进行免疫组化，免疫组化的实验材料为患者手术切除的原发灶肿瘤组织的切片)。根据免疫组化结果对于各个抗原进行评分。胞浆抗原的免疫组化评分标准细胞染色强度定性积分+细胞染色面积定量积分=评分结果；细胞染色强度定性积分为不染色=0，轻度染色=1，中度染色=2，强染色=3 ；细胞染色面积定量积分为无细胞染色= 0，< 25%细胞染色=1，25% 50%细胞染色=2，> 50%细胞染色=3。细胞核抗原的免疫组化评分标准明显细胞核着色为阳性，记数阳性细胞数的百分比，无着色定为O ；阳性细胞数彡10%定为1 ；11% -30%定为2 ；31% -50%定为3 ；> 50%定为4。根据评分结果对各个患者进行淋巴结转移辅助诊断，诊断标准如下MMPl评分结果大于1，IQGAPl评分结果大于1的为淋巴结转移患者；MMPl评分结果大于1，IQGAPl评分结果小于等于1，FSCNl评分结果小于等于_2的为淋巴结转移患者； MMPl评分结果大于1，IQGAPl评分结果小于等于1，FSCNl评分结果大于_2的为淋巴结转移患者；MMPl评分结果小于等于1，TIMPl评分结果大于1，TPX2评分结果小于等于1的为淋巴结未转移患者；MMPl评分结果小于等于1，TIMPl评分结果大于1，TPX2评分结果大于 1的为淋巴结转移患者；MMPl评分结果小于等于1，TIMPl评分结果小于等于1，CTSD评分结果小于等于O的为淋巴结未转移患者；MMPl评分结果小于等于1，TIMP1评分结果小于等于1，CTSD评分结果大于0，uPA评分结果小于等于0，plgR/SC评分结果小于等于_2的为淋巴结未转移患者；MMPl评分结果小于等于1，TIMPl评分结果小于等于1，CTSD评分结果大于0，uPA评分结果小于等于0，plgR/SC评分结果大于-2的为淋巴结未转移患者；MMPl 评分结果小于等于1，TIMPl评分结果小于等于1，CTSD评分结果大于0，uPA评分结果大于 0，TPX2大于2的为淋巴结转移患者；MMPl评分结果小于等于1，TIMPl评分结果小于等于 1，CTSD评分结果大于0，uPA评分结果大于0，TPX2评分结果小于等于2，FSCNl评分结果小于等于-2的为淋巴结未转移患者；MMPl评分结果小于等于1，TIMPl评分结果小于等于 LCTSD评分结果大于0，uPA评分结果大于0，TPX2评分结果小于等于2，FSCNl评分结果大于-2的为淋巴结转移患者。52例肺鳞癌患者的具体结果见表1。
表152例肺鳞癌患者的具体结果(LR代表未转移，HR代表转移)
权利要求
1.辅助诊断肺癌淋巴结转移的试剂，包括如下七种抗体抗MMPl抗体、抗TIMPl抗体、 抗IQGAPl抗体、抗CTSD抗体、抗TPX2抗体、抗uPA抗体和抗FSCm抗体。
2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于所述试剂还包括抗plgR/SC抗体。
3.如权利要求2所述的试剂，其特征在于所述试剂由所述抗MMPl抗体、所述抗TIMPl 抗体、所述抗IQGAPl抗体、所述抗CTSD抗体、所述抗TPX2抗体、所述抗uPA抗体、所述抗 FSCNl抗体和所述抗plgR/SC抗体组成。
4.如权利要求1至3中任一所述的试剂，其特征在于每种所述抗体均单独包装；每种所述抗体均为单克隆抗体或商业途径获得的多克隆抗体。
5.如权利要求1至4中任一所述的试剂，其特征在于所述抗MMPl抗体为Oncogene生产的产品目录号为MS-802-P的抗体；所述抗TIMPl抗体为Santa Cruz生产的产品目录号为sc-21734的抗体；所述抗IQGAPl抗体为BD Biosciences生产的产品目录号为610612的抗体；所述抗CTSD抗体为Santa Cruz生产的产品目录号为sc-10725的抗体；所述抗TPX2 抗体为Biolegene生产的产品目录号为628002的抗体；所述抗uPA抗体为Calbiochem生产的产品目录号为1M13L的抗体；所述抗FSCNl抗体为Santa Cruz生产的产品目录号为 sc-21743的抗体；所述抗plgR/SC抗体为DAKO生产的产品目录号为A0187的抗体。
6.权利要求1至5中任一所述试剂在制备辅助诊断肺癌淋巴结转移的试剂盒中的应用。
7.辅助诊断肺癌淋巴结转移的试剂盒，包括权利要求1至5中任一所述的试剂。
8.辅助评估肺癌淋巴结转移风险的试剂，包括如下七种抗体抗MMPl抗体、抗TIMPl 抗体、抗IQGAPl抗体、抗CTSD抗体、抗TPX2抗体、抗uPA抗体和抗FSCNl抗体。
9.如权利要求8所述的试剂，其特征在于所述试剂还包括抗plgR/SC抗体。
10.如权利要求8或9所述的试剂，其特征在于所述试剂由所述抗MMPl抗体、所述抗 TIMPl抗体、所述抗IQGAPl抗体、所述抗CTSD抗体、所述抗TPX2抗体、所述抗uPA抗体、所述抗FSCNl抗体和所述抗plgR/SC抗体组成；所述抗MMPl抗体为Oncogene生产的产品目录号为MS-802-P的抗体；所述抗TIMPl抗体为Santa Cruz生产的产品目录号为sc-21734 的抗体；所述抗IQGAPl抗体为BD Biosciences生产的产品目录号为610612的抗体；所述抗CTSD抗体为Santa Cruz生产的产品目录号为sc-10725的抗体；所述抗TPX2抗体为 Biolegene生产的产品目录号为628002的抗体；所述抗uPA抗体为Calbiochem生产的产品目录号为1M13L的抗体；所述抗FSCNl抗体为Santa Cruz生产的产品目录号为sc-21743 的抗体；所述抗PlgR/SC抗体为DAKO生产的产品目录号为A0187的抗体。
全文摘要
本发明公开了一种辅助诊断肺癌淋巴结转移的试剂。本发明提供的试剂包括用于检测8个蛋白标记物(MMP1，TIMP1，IQGAP1，TPX2，uPA，Cathepsin-D，Fascin及pIgR/SC)的8种抗体。应用8种抗体，通过免疫组织化学染色结果，可以辅助诊断肺癌淋巴结转移，有望应用于肺鳞癌淋巴结转移风险评估及预后预测。应用本发明的试剂辅助诊断时，基于临床常规免疫组织化学染色技术，在具有较高的可信性的同时，具有较强的实用性和临床使用价值。
文档编号G01N33/577GK102445543SQ201010299919
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月8日 优先权日2010年10月8日
发明者刘宇, 李琳, 林冬梅, 程书钧, 肖汀, 谭金晶, 高燕宁 申请人:中国医学科学院肿瘤研究所