专利名称：液体诊断药剂的保存方法
技术领域：
本发明涉及液体诊断药剂的保存方法。
在诊断药剂的领域中，逐渐开始不使用冷冻干燥品，而开发出了液体诊断药剂，该液体诊断药剂目前在医疗现场被迅速普及。然而诊断药剂中所含的酶、辅酶、酶的活化剂、基质、指示剂以及生物体由来的成分中存在因液体不稳定而以液体保存困难的物质，其中一部分或全部被配制成冷冻干燥品而保存，该冷冻干燥品在使用前必须要配制成液体。向液体诊断药剂中添加各种金属络合剂、紫外线吸收剂、防腐剂、还原剂、稳定剂等作为改善这些液体不稳定物质的保存稳定性的方法已众所周知，但是试剂中添加的化合物会对目的检测反应带来影响，这是目前存在的问题。作为向溶液中不添加稳定化试剂的稳定化方法，已知有滋补强壮用液体制剂中加入维生素C的稳定化方法(特开平7-223946号公报)。
本发明提供一种对液体诊断药剂的检测反应无影响的可靠且简便的保存方法。
为解决上述问题，本发明人进行了深入的研究，结果发现了液体诊断药剂与脱氧剂共同存在于气密容器中密封保存时，会提高液体诊断药剂的保存稳定性，从而完成了本发明。
即本发明涉及一种液体诊断药剂的保存方法，其特征在于在脱氧剂存在条件下将液体诊断药剂密封于气密容器中。
根据本发明，将液体诊断药剂和脱氧剂密封在气密容器中从而使液体诊断药剂稳定。
在本发明中所用的脱氧剂，只要有吸收氧气的作用即可，并无特殊的限制。可以采用抗氧化剂、还原性物质、金属化合物等。
作为抗氧化剂，可以采用酚类、胺类、羟胺类、醛类、肼类等。
作为酚类可以采用苯酚、萘酚、丁基羟基甲苯、丁羟基茴香醚等一元酚类，邻苯二酚、氢醌等二元酚类，1，2，3-苯三酚、间苯三酚、没食子酸及其盐等三元酚类，木质素、鞣质等多元酚。
作为胺类，可以采用甲胺、乙胺等脂肪族伯胺类，二甲胺、二乙胺等脂肪族仲胺类，三甲胺、三乙胺等脂肪族叔胺类，烯丙基胺、三烯丙基胺等脂肪族不饱和胺类，环丙胺、环己胺等脂环式胺类，苯胺，苯甲胺等芳香族胺类。
作为羟胺类，可以采用羟胺、甲羟胺等。
作为醛类，可以采用甲醛、乙醛等脂肪族饱和醛类，乙二醛，丁二醛等二醛类，丙烯醛、丁烯醛等脂肪族不饱和醛类，苯甲醛、萘甲醛等芳香族醛类，糠醛等杂环式醛类。
作为肼类，可以采用肼、甲肼、二甲肼、苯肼等。
作为还原性物质，可以采用氢化物、低级氧化物、硫化物、磷化物、砷化物、氧化程度低的有机化合物。
作为氢化物，可以采用氢、碘化氢等卤化氢类、硫化氢、氢化铝锂、硼氢化钠等。
作为低级氧化物，可以采用一氧化碳、二氧化硫等。
作为硫化物，可以采用硫化钠、多硫化钠、硫化铵、亚硫酸钠等。
作为磷化物，可以采用黄磷、膦等。
作为砷化物，可以采用砷等。
作为氧化程度低的有机化合物，可以采用抗坏血酸及其盐、异抗坏血酸及其盐、山梨糖、葡萄糖等糖类，甲酸、草酸等，作为盐可以采用钠、钾等金属盐类。
作为金属化合物，可以采用强正电性的金属、低化合价状态的金属盐。
作为强正电性的金属，可以采用锂、钠、钾等碱金属，镁、钙、锌、铁、钛、铬、锡、铝等。
作为低化合价的金属盐，可以采用铁(II)盐、锡(II)盐、钛(III)盐、铬(II)盐等。作为该金属盐，可以采用氮化亚铁、硫化铁等。
这些脱氧剂中，优选采用含有抗坏血酸及其盐、异抗坏血酸及其盐以及铁粉等金属粉的脱氧剂，特别优选含有铁粉的脱氧剂。
作为含有铁粉等金属粉的脱氧材料，下列市售品可以容易地得到，例如三菱气体化学(株)制的エ-ジレス(商品名，注册商标)、フロイント社制的ァンチモ-ルド(商品名，注册商标)等。
对气密容器的形状无特殊限制，作为气密容器的材质，只要是可以限制氧气透过的材料，无论何种材质都可以使用，如金属、玻璃、铝、铝蒸镀膜、树脂等，其中以玻璃和树脂为最好。
作为树脂，可以采用聚乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚氯乙烯、6-尼龙、聚对苯二甲酸乙二醇酯等，但优选氧透过系数低的树脂。作为氧透过系数低的树脂，可以采用氧透过系数小于0.1×10-11cm3(STP)cm-1S-1cm Hg-1的树脂，例如聚乙烯醇、聚丙烯腈、聚偏氯乙烯等。
作为氧透过系数低的袋状气密容器特别优选采用聚偏氯乙烯膜拉伸尼龙/聚乙烯二层膜的袋〔商品名“飞龙”(注册商标)サランラツフ贩卖(株)〕等。
液体诊断药剂与脱氧剂在气密容器中密封保存时，对密封方法无特定限制。
作为较好的密封保存方法，可以采用以下这种方法，将液体诊断药剂或脱氧剂中至少一种用由氧气容易透过但溶液不易透过的材料制成的隔离容器覆盖，然后用气密容器密封。通过用隔离容器覆盖，不论气密容器状态如何都可以使液体诊断药剂和脱氧剂实质上处于不相混合的状态，并可以防止脱氧剂混入液体诊断药剂。
隔离容器的形状无特定限制。作为隔离容器的材质，只要是可以保存溶液且可透过氧气即可，并无特定限制，但以树脂为最好。作为树脂，可以采用氧透过系数为0.1×10-11cm3(STP)cm-1s-1cm Hg-1以上的树脂，例如聚二甲基硅氧烷、聚(4-甲基-1-戊烯)、天然橡胶、乙基纤维素、聚(2，6-二甲基氧化亚苯基)、聚四氟乙烯，低密度聚乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸脂、丁基橡胶、酯酸纤维素、聚丙烯、高密度聚乙烯、聚氯乙烯、6-尼龙、聚对苯二甲酸乙二醇酯。
作为具体的密封方法，例如有用上述的隔离容器覆盖脱氧剂，之后与液体诊断药剂一起放入上述的气密容器中的方法，或用上述的隔离容器覆盖液体诊断药剂，之后与脱氧剂一起放入上述的气密容器中的方法，或将脱氧剂及液体诊断药剂都用隔离容器覆盖后再放入气密容器内密封的方法。
关于脱氧剂的用量，要考虑脱氧剂的氧吸收能力和气密容器中的空气体积，特别是要考虑氧气量之后作决定。对于气密容器中实际上为1个容量的氧气，脱氧剂的氧吸收能力是1个容量以上，优选2个容量以上。因此，最好将气密容器以及隔离容器中的空气量限制在最低限，根据需要还可用氮气等置换空气。
本发明中采用的液体诊断药剂的组成虽无特别限定，但最好含有酶或指示剂，根据需要优选含有酶的反应基质、辅酶、赋活剂、防腐剂、表面活性剂、生物体由来成分、缓冲液等。
作为酶，可以采用氧化还原酶、转移酶、水解酶、脱离酶、异构化酶、合成酶等。
作为氧化还原酶，可以采用以CH-OH为供体的酶、以醛或氧基为供体的酶、以CH-CH为供体的酶、以CH-NH2为供体的酶、以CH-NH为供体的酶、作用于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下简称为NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤核苷酸磷酸(以下简称为NADPH)的酶、以含氮化合物为供体的酶、以二酚类或其相关化合物为供体的酶、以过氧化氢为受体的酶、摄入分子状氧作用于一对供体的酶、以超氧化物为受体起作用的酶等。
作为以CH-OH为供体的酶，可以采用醇脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、丙三醇脱氢酶、丙三醇-3-磷酸脱氢酶、3α-羟基类固醇脱氢酶、7α-羟基类固醇脱氢酶、12α-羟基类固醇脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、吡喃糖氧化酶、丙三醇氧化酶、醇氧化酶、胆碱氧化酶、半乳糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、胆甾醇氧化酶、L-α-甘油磷酸氧化酶，乳酸氧化酶、D-乳酸脱氢酶、马来酸脱氢酶、磷酸葡萄糖酸脱氢酶、果糖脱氢酶、D-3-羟基丁酸脱氢酶、甘露醇脱氢酶等。
作为以醛或氧基为供体的酶，可以采用丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、黄嘌呤氧化酶、丙酮酸脱氢酶、甲醛脱氢酶等。
作为以CH-CH为供体的酶，可以采用酰基-CoA氧化酶、胆红素氧化酶等。
作为以CH-NH2为供体的酶，可以采用谷氨酸合成酶、丙氨酸脱氢酶、酷胺氧化酶、胺氧化酶、丁二胺氧化酶、谷氨酸脱氢酶、酷胺酸脱氢酶、L-氨基酸氧化酶等。
作为以CH-NH为供体的酶，可以采用肌氨酸氧化酶、肌氨酸脱氢酶等。
作为作用于NADH或NADPH的酶，可以采用谷胱甘肽还原酶、心肌黄酶、NADH-黄素单核苷酸(以下简称为FMN)氧化还原酶、NADPH-FMN氧化还原酶等。
作为以含氮化合物为供体的酶，可以采用尿酸酶等。
作为以二酚类及其相关化合物为供体的酶，可以采用抗坏血酸氧化酶等。
作为以过氧化氢为受体的酶，可以采用过氧化物酶、谷胱甘肽氧化酶等。
作为摄入分子状氧作用于一对供体的酶，可以采用虫萤光素酶、对羟基苯甲酸羟化酶等。
作为作用于以超氧化物为受体的酶，可以采用超氧化物歧化酶等。
作为转移酶，可以采用酰基转移酶、糖苷转移酶、含磷基转移酶等。
作为酰基转移酶，可以采用γ-谷氨酰转移酶、磷酸转乙酰酶、转谷氨酰胺酶等。
作为糖苷转移酶，可以采用嘌呤核苷酸磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶，麦芽糖磷酸化酶等。
作为转移含磷基的酶，可以采用肌酸激酶、肌激酶、己糖激酶、葡糖磷酸变位酶、丙酮酸激酶、丙三醇激酶、醋酸激酶、磷酸果糖激酶、磷酸甘油醛激酶，多核苷酸磷酸化酶、磷脂酶A2等。
作为水解酶，可以采用作用于酯键的酶、作用于糖苷化合物的酶、作用于肽键的酶、作用于肽以外的C-N键的酶等。
作为作用于酯键的酶，可以采用溶血磷脂酶、胆甾醇脂酶、磷脂酶C、磷脂酶D、神经磷脂酶、碱性磷酸酶、脂蛋白脂肪酶等。
作为作用于糖苷化合物的酶，可以采用葡糖淀粉酶、α-糖苷酶、β-糖苷酶、β-半乳糖苷酶、神经氨酸苷酶、蔗糖酶等。
作为作用于肽键的酶，可以采用羧肽酶、嘌呤亚氨基肽酶、焦谷氨酰肽酶等。
作为作用于肽以外的C-N键的酶，可以采用脲酶、肌酸酰胺水解酶、肌酸亚胺脱水酶、肌酸脱水酶、肌酸酐酶等。
作为脱离酶，可以采用作用于碳-碳键的酶、作用于碳-氧键的酶等。
作为作用于碳-碳键的酶，可以采用N-乙酰神经氨酸醛缩酶、草酰乙酸脱羧酶等。
作为作用于碳-氧键的酶，可以采用烯醇酶、顺马头酸酶等。
作为异构化酶，可以采用消旋酶和异构酶、分子内氧化还原酶等。
作为消旋酶和异构酶，可以采用变旋酶等。
作为分子内氧化还原酶，可以采用磷酸葡糖异构酶等。
作为合成酶，可以采用生成碳-硫键的酶、生成碳-氮键的酶。
作为生成碳-硫键的酶，可以采用酰基-CoA合成酶等。
作为生成碳-氮键的酶，可以采用尿酰胺分解酶等。
作为指示剂，可以采用显色试剂、显色性酶基质、发光试剂、萤光试剂、巯基化合物等。
作为显色试剂，可以采用由于氧化而发色的试剂。作为与4-氨基安替比林反应的试剂，可以采用酚衍生物、苯胺衍生物、甲苯胺衍生物等〔生化学和新的诊断试剂的开发，CMC株式会社(1984)〕。另外，作为过氧化物酶和过氧化氢测定用色原体，例如有二〔3-二(4-氯苯基)甲基-4-二甲基-氨基苯基〕胺等白靛酚类衍生物，N-(羧甲基胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯基胺钠盐，10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-二(二甲胺基)吩噻嗪(以下简称为CCAP)、4，4’-二(二甲胺基)-二苯基胺、10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-二(二甲胺基)-10H-吩噻嗪等无色美蓝类衍生物，三苯甲烷等隐色色素等。
显色性酶基质是指被酶分解后显示显色性的化合物。例如有被酶分解后呈黄色的硝基苯酚类的化合物等，可以采用被β-D-半乳糖苷酶等作用的显色性酶基质2-硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷、被淀粉酶等作用的显色性酶基质2-氯-4-硝基苯基-α-D-麦芽三糖苷等。
作为发光试剂，可以采用在临床诊断药剂领域中广泛使用的鲁米诺、异鲁米诺、光泽精、吖啶翁酯、虫萤光素、AMPPD(トロピツクス社商标)、AMPGD(トロピツクス社商标)等化合物及其衍生物〔生物发光和化学发光、今井一洋编，P82-89(1989)，广川书店，ベ-リンガ-マンハイム社商品目录(1992，1993)〕。
作为萤光试剂，可以采用香豆素、萤光素、试卤灵、氨基吖啶酮、芘、二苯基己三烯、硝基茋等化合物及这些的衍生物〔和光纯药工业(株)商品目录(1989)〕。
巯基化合物是具有SH基的化合物组。可以采用尤其在临床诊断药剂的领域中非常有用的半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、二硫苏糖醇、巯基乙醇、谷胱甘肽、辅酶A(CoA)、乙酰CoA等化合物及这些的衍生物〔生物化学实验法10，SH基的定量法、松本博、国则登代著、学会出版中心(1978)〕。
作为辅酶，可以采用氧化型或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氧化型或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、FMN、黄素腺嘌呤二核苷酸、硫胺素二磷酸、磷酸吡哆醛、硫辛酸、叶酸、腺甘三磷酸、腺苷二磷酸、腺苷一磷酸等。
作为酶的活化剂，可以采用金属离子、氮离子、铵离子、磷酸离子、硫酸离子、碳酸离子等。
作为基质，可以采用上面提及的酶所作用的基质。
作为生物体由来的成分，可以采用尿酸、胆红素、血红蛋白、白蛋白、球蛋白、激素等。
作为缓冲液，可以采用乳酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、琥珀酸缓冲液，苯二甲酸缓冲液，磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、二乙醇胺缓冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥酸缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液、咪唑乙酸缓冲液等。
液体诊断药剂中可以含有酶、指示剂、辅酶、酶的活化剂、基质、生物体由来成分及缓冲液等多种成分。
下面以试验例说明本发明的效果。
试验例1向含0.1％的特里顿(Triton) X-100的100mM缓冲液(pH6.6)中加入显色试剂CCAP使其溶解成浓度为0.1mg/ml，配制成液体指示剂。将这个液体指示剂100ml注入容量为100ml的聚氯乙烯制成的容器里，用螺丝口盖封好，在30℃及以下各种条件下保存。
保存条件(1)直接用聚氯乙烯制的容器。
保存条件(2)将聚氯乙烯制的容器放入聚乙烯制的袋(140×200mm)中密封。
保存条件(3)将聚氯乙烯制的容器和脱氧剂〔エ-ジレス(注册商标)S-200(具有200ml的氧吸收能力)、三菱气体化学(株)〕放入聚乙烯制的袋(140×200mm)中密封。
保存条件(4)将聚氯乙烯制的容器和脱氧剂(エ-ジレス S-200)装入聚偏氯乙烯膜拉伸尼龙/聚乙烯制的袋〔飞龙(注册商标)KN-204(140×200mm)、サランラツプ贩卖(株)〕中密封。
在以上保存条件下保存1周或2周后，用分光光度计在波长为666nm处测定该溶液的吸光度，结果如表1所示。通过使用脱氧剂并在气密容器中密封保存，就可以抑制指示试剂溶液的氧化，从而达到稳定化的目的。
表1保存条件 吸光度(mABS)1周后2周后保存条件(1) 896 2965保存条件(2) 902 2899保存条件(3) 235 521保存条件(4) 111 205试验例2
用氮置换100mM磷酸缓冲液(pH6.6)，将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶解成浓度为2.0U/ml，制成酶溶液。将这个酶液100ml装入容量为100ml的聚氯乙烯制的容器中用螺丝口盖封好，在30℃及试验例1中所示保存条件下保存。在上面提及的条件下保存1周或2周后，测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的剩余酶活性，结果如表2所示。通过使用脱氧剂并在气密容器中密封保存就可以抑制酶的失活，从而达到稳定化的目的。
表2保存条件 酶活性(U/ml)1周后 2周后保存条件(1)0.70.3保存条件(2)0.80.3保存条件(3)1.10.9保存条件(4)1.51.2以下说明本发明的实施例。
实施例1将按试验例1配制的液体指示剂在试验例1的保存条件(3)下保存2周，向其中加入过氧化物酶溶解成10U/ml及过氧化氢溶解成300μM/L，在37℃下反应5分钟，然后用分光光度计在666nm波长处测定吸光度的变化量。而在参比池中使用添加过氧化氢的保存溶液。
其结果显示吸光度变化量是352mABS，与使用刚刚配制好的液体指示剂同样测定时得到的吸光度变化量361mABS几乎完全相同。
另一方面，使用由试验例1配制的液体指示剂在试验例1的保存条件(1)下保存2周后的液体指示剂进行同样的试验，吸光度的变化量变为-14mABS，根本无法测定。
实施例2将由试验例1配制的液体指示试剂在试验例1的保存条件(4)下保存2周后，再用此种液体指示剂与实施例1同样进行试验，得到了吸光度的变化量为360mABS，与使用刚刚配制好的液体指示剂同样地进行测定得到的吸光度的变化量361mABS几乎完全相同。
另一方面，将由试验例1配制的液体指示剂在试验例1的保存条件(2)下保存2周，并用此种液体指示剂进行同样的试验，吸光度的变化量变成-1mABS，根本无法测定。
实施例3配制含有下列成分的肌酸激酶测定用试剂。
试剂1液咪唑乙酸缓冲液(pH6.6) 115mMEDTA2.3mM醋酸镁 11.5mMN-乙酰半胱氨酸 23mM二硫苏糖醇 10mMADP 2.3mMAMP 5.8mMAP5A11.5μM羧基甲氧基胺盐酸盐 10mM葡萄糖 23mMNADP2.3mM己糖激酶或葡萄糖激酶3.45U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 1.725U/ml白蛋白 0.1mg/ml试剂2液肌酸磷酸345mM将这两个试剂各100ml在试验例1所示的保存条件(3)下保存，用上面提及的保存试剂通过常法对标准血清中的肌酸激酶定量。
结果是，如果以采用刚刚配制好的上述试剂测定的定量值作为100％，则可以得到下列各定量值，保存1周的试剂为99.6％，保存2周的试剂为92.6％，保存3周的试剂为88.5％，保存4周的试剂为80.2％。
另一方面，在如试验例1所示的保存条件(1)下保存时，可以得到下列各定量值，保存1周的试剂为99.8％，保存2周的试剂为87.3％，保存3周的试剂为72.5％，保存4周的试剂为62.0％，可以看出活性的定量值迅速降低。
实施例4将实施例3中配制的肌酸激酶测定用试剂100ml在试验例1中所示保存条件(4)下保存。使用上述的保存试剂利用常法对标准血清中的肌酸激酶定量。
结果是，如果以采用刚刚配制好的上述的试剂液测定的定量值作为100％，则可以得到以下各定量值，保存1周的试剂为100.2％，保存2周的试剂为98.8％，保存3周的试剂为97.3％，保存4周的试剂为96.2％。
另一方面，在试验例1所示的保存条件(2)下保存时，可以得到下列各定量值，保存1周的试剂为100.1％，保存2周的试剂为88.8％，保存3周的试剂为77.3％，保存4周的试剂为60.5％。活性的定量值迅速降低。
利用本发明的保存方法可以稳定地保存液体诊断药剂。
权利要求
1.一种液体诊断药剂的保存方法，其特征在于，在脱氧剂存在条件下将液体诊断药剂用气密容器密封保存。
2.权利要求1中记载的保存方法，将液体诊断药剂或脱氧剂中的至少一种用由易透过氧气且不易透过溶液的材料制成的隔离容器覆盖。
3.权利要求1或2中记载的保存方法，其中液体诊断药剂是含有酶或指示剂的液体诊断药剂。
全文摘要
本发明涉及液体诊断药剂的保存方法，其特征在于在脱氧剂存在条件下将液体诊断药剂在气密容器中密封保存。
文档编号G01N33/50GK1156113SQ9612180
公开日1997年8月6日 申请日期1996年11月25日 优先权日1996年1月26日
发明者青山典仁, 神原美奈子, 三池彰 申请人:协和梅迪克斯株式会社
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