检测肾癌特征蛋白的优化质谱模型及其制备方法和应用的制作方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：：检测肾癌特征蛋白的优化质谱模型及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于质谱检测
技术领域：
，特别涉及对肾癌血液优化的质谱检测方法。一种通过能与蛋白质结合的磁珠基质去捕获生物标志，并用有定量控制的质谱分析来检测肾癌生物标志。在此提及的此项发明涉及蛋白质检测领域，为一种新的非侵入性的体外质谱检测方法。本发明可以应用到已经脱离人体的体液中的肾癌生物标志组合的检测方法或试剂
背景技术：
肾癌的发生是一个多基因突变导致抑癌基因失活、癌基因活化的过程。肿瘤的发生、发展是一个十分复杂和漫长的过程，伴随多基因和蛋白的分子改变。基因组学研究由于自身的限制难以完全阐明基因与蛋白质参与过程及其具体作用。蛋白质组学高灵敏度的分析技术有助于捕获那些在肿瘤演变过程中细微的分子变化，使之成为诊断和监测肿瘤演变的重要线索。目前临床上对恶性肿瘤预后评估主要依赖于临床表现、病理学及传统肿瘤标志(tumormarker),但肿瘤早期复发或转移时常常无明显临床表现，而病理学证据很难得到且重复性差。肾细胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)为常见的泌尿系统恶性肿瘤，多为隐袭发�。俅采虾苣逊⑾衷缙诩膊�。虽然对于肾癌的治疗己经取得了实质性的进展，预防和早期发现仍是降低肾癌死亡率的有效途径和提高患者成活率的关键。但目前的检测方法敏感性和特异性均较低，已成为肾癌早期检测的一个瓶颈。肾癌的高死亡率使得人们不断地寻求一种有效的早期检测方法，临床上仅以一种蛋白作为血清学检测指标在敏感性和特异性上是远远不足的，而影象学检测一旦发现占位病变则已经不是很早期了。能够使疾病在发生的极早期就能够得已发现，并得到控制和治疗，进而大大提高治愈率或明显改善病人的预后和生活质量。近年来随着临床蛋白质组学的开展，使得肾癌的早期发现成为可能。蛋白质的分离技术在蛋白质组学中应用分离技术有两个目的。第一、通过将蛋白质的混合物分离成单一蛋白质或蛋白质小组以简化复杂的蛋白质混合物；第二、通过标记的方法可以比较两个蛋白质的混合物样品中蛋白质的不同表现。其中主要的技术有双向电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)、高效液相层析(high-performanceliquidchromatography,HPIX)、毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)、亲和层析(affinitychoromatography)、蛋白芯片(proteinmicroarray)、磁性微球(magneticbeads,简称磁珠)和免疫组等。特别是蛋白芯片和磁珠两项新的蛋白指纹图谱技术克服了以往技术的缺点，具有高灵敏度、高通量、结果重复性好、可机械化操作和方法灵活等特点。待测样品来源广泛，不需作特殊前处理，可以直接点样检测，如血清、尿液及组织液等；检测快速，一般一例标本的检测时间仅需约5分钟，从标本制备到出结果全过程仅约1小时。蛋白芯片和磁珠两项新的蛋白指纹图谱技术有可能在体液中潜在生物标志(biomarker)检测方面创造革命性突破(许洋，蛋白质指纹图谱技术在实验诊断与临床医学中的研究进展，基础医学与临床，2007,27:134-142)。基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)与蛋白芯片分离技术联合应用即为表面增强激光解析/电离飞行时间质谱(surfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,SELDI-T0F-MS)。2-DE最先被用于临床蛋白组学研究，但其对疏水性、强酸性和强硷性蛋白的分辩率不够，而且不能检测低丰度蛋白，故实用价值受限。近来，蛋白芯片与质谱技术(SELDI-T0F-MS)的结合，已被成功地用于肿瘤研究；但由于磁珠表面的结合面积远远大于蛋白芯片，从而磁珠的灵敏性比蛋白芯片更高(刘建栋等，血液蛋白质组与质谱仪检测流程标准化初探。基础医学与临床，2007,27:193-197)。磁珠具有优于二维电泳、蛋白芯片和其他质谱方法的特点，已被广泛地用于肿瘤生物标志的筛査等研究(屠世良等，癌胚抗原阴性结直肠癌的检测和结直肠癌预后相关生物标志，基础医学与临床，2007)。该技术具有操作简便、无需离心样品、可直接分析原始生物样本(如血清、尿液等)、样本用量小等特点，同时适合多样品平行检测和直接进行蛋白质全景式的搜索和分析，特别是对小分子量蛋白和低丰度蛋白具有较高的捕获效果，可以与其他蛋白质组学方法互补，目前已被广泛地用于肿瘤标志的筛査和临床检测，并均已获得很好的结果。但国内迄今尚无采用磁珠与质谱技术获得检测肾癌血清特征蛋白的报道。
发明内容本发明的目的是为克服对目前肾癌血清检测技术的不足之处，建立一种检测肾癌特征蛋白的优化质谱模型及其制备方法和应用，该模型为早期检测提供了新的途径和方法，并为进一步发现新的肿瘤生物标志提供了基础。本发明提出的检测肾癌血清蛋白质的质谱模型，其特征在于从血清中筛选出7个上调蛋白和3个下调蛋白作为特征蛋白；选取上述10个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M，建立了肾癌患者与正常人、肾良性疾病、肾癌淋巴结转移及肾癌远端转移患者两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱模型(图3-5)，所说的特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值M分别为m/z:3931，M《15.71;m/z=5356，M^7.31;m/z=5474，M《4.83;m/z=3935，M《7.76;m/z=3190，M》7.21;m/z=4021，M29;m/z=11685，M》22.51;m/z=15076，M>20.71;分子量(m/z)误差〈0.01%，临界峰值均值M的CV<510%。本发明提出上述的检测肾癌血清蛋白质谱模型的制备方法，包括以下步骤1)4'C条件下2小时内收集经病理明确诊断的肾癌患者血清及经体检确定为正常健康者的血清作为两组血清标本，进行一80。C低温冷冻备用；2)采用WCX磁珠对所述肾癌患者及正常人的两组血清标本的蛋白进行吸附；3)用激光解吸/电离飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行管分析阵列，或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)对结合在弱阴离子表面的WCX磁珠上的两组血清蛋白进行读取，设定最高检测分子量为50kDa，优化分子量范围100015000Da，最佳聚集中心8000Da，数据采集参数范围2080，激光强度150-180，检测敏感度为7-8，收集总数为130次，由此获得两组蛋白质谱图谱；4)在每次实验数据收集前，用All-in-one标准蛋白及质谱的标准化质控0型血清校正仪器，用2746土1Da、5909土1Da、6634土1Da标准峰为质谱内标定性(分子量)质控标准，使分子量误差<0.01%，从而获得的精确的蛋白质谱图谱；5)定量性质谱调控每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da等强度调至50%信号强度的最大值，使临界峰值均值M的CV〈510%，并收集精确的质谱图谱数据；6)对所得数据进行Mann-Whitney〃检验统计学处理，根据肾癌患者和正常人血清之间蛋白峰值的差异(共得到209个蛋白峰，认定P值小于10—5时具有统计学意义)，CV<510%;初步分析筛选出肾癌患者与正常人群有10个差异多肽蛋白，不同峰的分子量、临界峰值均值M及特征蛋白的表达变化见表一表一肾癌患者特征蛋白的表达变化蛋白分子量(m/z)肾癌患者蛋白临界峰值均值特征蛋白的表达变化M±SD31907.21±3.2240213.29±2.2353567.31±6.1359895.56±4.231147012.23±10.221168522.51±13.501507620.71±18.31393115.71±7.7539357.76±3.8754744.83±3.50表一中向上箭头"t"为在肾癌患者血清中高表达的上调特征蛋白；向下箭头"I"为在肾癌患者血清中低表达的下调特征蛋白；将上述IO个差异蛋白作为肾癌质谱检验模型的特征蛋白；6)由于多个特征蛋白组合起来才可将肾癌与正常人等完全分开，故选取上述IO个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M，建立了肾癌患者与正常人、肾良性疾病、肾癌淋巴结转移及肾癌远端转移患者两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱模型(图3-5)，所说的特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值M分别为m/z=3931，M《15.71;m/z=5356，M》7.31;m/z=5474，M《4.83;m/z=3935，M《7.76;ra/z=3190，M》7.21;m/z=4021，M29;m/z=11685，M》22.51;m/z=15076，M》20.71;其中肾癌患者与正常人鉴别的质谱模型A由m/z=3931，M《15.71;m/z=5356，M》7.31绘制而成，肾癌患者与肾良性疾病鉴别的质谱模型B由m/z=5474，M《4.83;m/z=3935，M《7.76绘制而成，肾癌患者与肾癌淋巴结转移及肾癌远端转移鉴别的质谱模型C由m/z=3190，M》7.21;m/z=4021，M29;m/z=11685，M>22.51;m/z=15076，M》20.71绘制而成；分子量(m/z)误差〈0.01%，临界峰值均值M的CV<510%。利用该质谱模型，只要将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与本发明质谱模型逐一进行对比分析，就可用于肾癌检验。利用该质谱模型A-C(图3-5)，将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与本发明的质谱模型逐一进行对比分析，经临床试用及双盲测试，其鉴别肾癌患者与正常人的敏感性为91%，特异性为89%;肾癌与肾良性疾病患者敏感性90%,特异性92%，肾癌患者与肾癌淋巴结转移敏感性85%，特异性89%;肾癌患者与肾癌远端转移敏感性85%，特异性92%。利用C8及C18疏水基质磁珠的实验结果与上述WCX阴离子基质磁珠的实验结果一致。本发明采用上述质谱模型可用于肾癌早期检测、筛查和复发、转移的评估。本发明的特点及效果本发明与其他肾癌的检测方法比较，具有以下优点第一、本发明采用肾癌患者与正常人具有差异的多个特征蛋白组合起来进行对肾癌血清的检测，提供的质谱模型是肾癌早期检测和筛查的新方法和新途径，并为进一步发现新的肾癌生物标志提供了基�。坏诙�、与以往的血清学检测方法比较具有较高的敏感性和特异性，是一种在蛋白组学水平上的检测，对肾癌的早期检测提供了新标准；第三、本发明由于磁珠表面的结合面积远远大于蛋白芯片，从而磁珠的灵敏性比蛋白芯片更高而具有了更高的灵敏度，从而优化了质谱模型；第四、本发明首创采用了定量性质谱调控，CV〈510%，使磁珠的临界峰值均值M比蛋白芯片更可靠及精确；第五、本发明首创采用了用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中用于质谱内标定性的2746土1Da、5909土1Da、6634土1Da标准峰(分子量)质控标准，使分子量误差〈0.01%,从而获得的精确的蛋白质谱图谱；第六、本发明质谱模型的构建方法设计精确及合理可行，为降低我国肾癌的病死率、提高肾癌的临床治愈提供了一种新的筛査和复发、转移的评估方法；第七、利用本发明用双盲法分析了180份血清标本，其鉴别肾癌患者与正常人的敏感性为91%，特异性为89%;肾癌与肾良性疾病患者敏感性90%，特异性92%，肾癌患者与肾癌淋巴结转移敏感性85%，特异性89%;肾癌患者与肾癌远端转移敏感性85%，特异性92%。因此本发明可实现对肾癌进行早期预警、早期发现。说明书附1肾癌及正常人血清多肽质谱图谱图2肾癌及正常人血清蛋白质谱图谱图3肾癌患者与正常人鉴别的质谱模型图4肾癌患者与肾良性疾病鉴别的质谱模型图5肾癌患者与肾癌淋巴结转移及肾癌远端转移鉴别的质谱模型图中m/z表示特异蛋白的质荷比，M代表该特异蛋白的临界峰值均值具体实施方式本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。实施例1正常与肾癌患者的区分及质谱的试剂盒制备(1)实验方法64例肾细胞癌患者(其中I期14例、1I期29例、III期14例、IV期7例，年龄3277岁，中位年龄48岁)和26例肾良性疾病患者(年龄3671岁，中位年龄45岁)的术前血清。90名对照血清来自健康志愿者(年龄2569岁，中位年龄45岁)，来源于肝功能、肾功能等检査均正常的体检人群。受检者空腹采集静脉血lmL，采集后立即于4。C冰箱静置2小时，4'C4000r/min离心10分钟分离血清，将血清于4。C12000r/min再次离心5分钟，去除所有残留细胞碎片和不溶物，在冰上将血清分装为100叱/管，共5管，保存于-8(TC冰箱。避免反复冻融。磁珠操作步骤血清样品处理从_8(TC冰箱中取出血清，于4°C，10000rpm离心5min。取1(^L血清样品，加20叱U9处理液(9mo1/L尿素，2%CHAPS，1%DTT,50mmol/LTris-CL,pH9.0)，充分混匀，冰浴振荡30min后取出，加入360叱结合缓冲液(100咖ol/LNaAc，pH4.0),立即混匀。磁珠上样及洗脱将处理好的样品IOO叱加至己装好WCX磁珠(弱阴离子表面，羧酸基团，捕获正电荷基团蛋白)的PCR管中，置磁性处理器上孵育30min，除去液体。加100叱磁珠结合缓冲液(50mmol/LNaAc，pH4.04.3)至已装好WCX磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育2分钟，除去液体，重复上述操作2次。加10叱ElutionBuffer2min，洗脱标本至上清液。取5PL上清液移至另一个PCR管中，加入5叱SPA饱和溶液充分混匀，取1叱混合溶液加样到Au或Steel片上，晾干后上机测量。数据收集将处理好的Au或Steel片置入MALDI-TOF-MS进行蛋白质谱分析。在读取数据前，用加有al1-in-one标准蛋白质的芯片校正质谱仪，使分子量误差<0.1%。本研究中阅读仪的主要参数设定为，最高检测分子量为50kDa,优化分子量范围100015000Da，最佳聚集中心8000Da，数据采集参数范围2080，收集总数为130次。软件中设定读片程序，以读取数据。定量性控制及质谱激光能量调控每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至50%质谱信号强度的最大值。用2746±1Da、5909i1Da、6634±1Da标准峰为质谱内标定性(分子量)质控标准，使分子量误差<0.01%，从而获得的精确的蛋白质谱图谱。统计学分析应用软件分析处理所有峰谱，形成蛋白质谱图谱。所有的图谱都进行了标准化，统一到它们自己全部的离子总数(峰面积的总和)。将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至4050%信号强度的最大值，并且用最显著的峰进行了校正，而后又进行了"减少基线"，定义蛋白峰(s/n>5，最小的峰强度〉1.6)。分析所有l50kDa之间的蛋白峰，并且仔细检査了每个相应的峰，计算出峰的平均值M，标准误差(SD)和变异系数(CV%)。用Mann-Whitney〃检验比较配对样本的蛋白峰，计算尸值。肾癌检测多肽蛋白筛选用Mann-Whitney〃检验比较配对样本的蛋白峰，CV〈510%;初步分析筛选出尸〈0.00001的肾癌患者与正常人群有10个差异多肽蛋白，不同峰的分子量、临界峰值均值M及特征蛋白的表达变化见表一-表一肾癌患者特征蛋白的表达变化蛋白分子量(m/z)肾癌患者蛋白临界峰值均值特征蛋白的表达变化<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表一中向上箭头"t"为在肾癌患者血清中高表达的上调特征蛋白；向下箭头"4"为在肾癌患者血清中低表达的下调特征蛋白；图l、2为肾癌及正常人血清中4个差异蛋白峰(3931、3952、11470和11685m/z)的原始质谱图谱；上2张图谱(CANCER)为肾癌，下2张图谱(NORMAL)为正常健康人。其中3931和3952m/z在肾癌中表达下调，而11470和11685m/z在肾癌中表达升高；将上述10个差异蛋白作为肾癌质谱检验模型的特征蛋白；实施例2临床试用及双盲测试由于多个特征蛋白组合起来才可将肾癌与正常人等完全分开，故选取上述10个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M，建立了肾癌患者与正常人、肾良性疾病、肾癌淋巴结转移及肾癌远端转移患者两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱模型(图3-5)，所说的特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值M分别为m/z=3931，M《15.71;m/z=5356，M》7.31;m/z=5474，M《4.83;m/z=3935，M《7.76;m/z=3190，M^7.21;m/z=4021，M29;m/z=11685，M>22.51;m/z=15076，M》20.71;其中肾癌患者与正常人鉴别的质谱模型A由m/z=3931，M《15.71;m/z=5356，M》7.31绘制而成，肾癌患者与肾良性疾病鉴别的质谱模型B由m/z=5474，M《4.83;m/z=3935，M《7.76绘制而成，肾癌患者与肾癌淋巴结转移及肾癌远端转移鉴别的质谱模型C由ra/z=3190，M^7.21;m/z=4021，M29;m/z=11685，M》22.51;m/z=15076，M>20.71绘制而成；分子量(m/z)误差<0.01°/。，临界峰值均值M的CV〈510%。利用该质谱模型，只要将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与本发明质谱模型逐一进行对比分析，就可用于肾癌检验。利用该质谱模型A-C(图3-5)，将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与本发明的质谱模型逐一进行对比分析，经临床试用及双盲测试，其鉴别肾癌患者与正常人的敏感性为91%，特异性为89%;肾癌与肾良性疾病患者敏感性90%,特异性92%，肾癌患者与肾癌淋巴结转移敏感性85%，特异性89%;肾癌患者与肾癌远端转移敏感性85%，特异性92%。利用C8及C18疏水基质磁珠的实验结果与上述WCX阴离子基质磁珠的实验结果一致。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求1.一种检测肾癌血清特征蛋白的质谱模型，其特征在于从血清中筛选出7个上调蛋白和3个下调蛋白作为特征蛋白；选取上述10个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M，建立了肾癌患者与正常人、肾良性疾病、肾癌淋巴结转移及肾癌远端转移患者两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱模型；其中肾癌患者与正常人鉴别的质谱模型A由m/z＝3931，M≤15.71；m/z＝5356，M≥7.31绘制而成，肾癌患者与肾良性疾病鉴别的质谱模型B由m/z＝5474，M≤4.83；m/z＝3935，M≤7.76绘制而成，肾癌患者与肾癌淋巴结转移及肾癌远端转移鉴别的质谱模型C由m/z＝3190，M≥7.21；m/z＝4021，M≥3.29；m/z＝11685，M≥22.51；m/z＝15076，M≥20.71绘制而成。2、一种检测肾癌血清蛋白质谱模型的制备方法，包括以下步骤1)4'C条件下2小时内收集经病理明确诊断的肾癌患者血清及经体检确定为正常的健康者的血清作为两组血清标本，进行一80。C低温冷冻备用；2)采用WCX磁珠对所述肾癌患者及正常人的两组血清标本的蛋白进行吸附；3)用激光解吸/电离飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行管分析阵列，或用电喷雾电离己洗脱的血清蛋白后用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)对结合在弱阴离子表面的WCX磁珠上的两组血清蛋白进行读�。纱嘶竦昧阶榈鞍字势淄计祝�4)在每次实验数据收集前，用标准蛋白及质谱的标准化质控0型血清校正仪器，使蛋白质分子量误差〈0.0W和临界峰值均值M的CV〈510%，并精确地、定量地收集肾癌患者和正常人优化的血清质谱图谱数据；5)对所得数据进行统计学处理，根据肾癌患者和正常人血清之间蛋白峰的差异，检测出2组血清蛋白质谱图谱之间有10个稳定的差异蛋白及其临界峰值，7个上调蛋白和3个下调蛋白作为特征蛋白；将所述10个差异蛋白作为肾癌蛋白质谱模型的特征蛋白；6)选取所述IO个特征蛋白中任意两个或两个以上的蛋白，以各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M构成用于检测肾癌血清特征蛋白质谱模型；其中所述的特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值M分别为m/z-3931'M《15.71;m/z=5356，M^7.31;m/z=5474，M《4.83;m/z=3935，M《7.76;m/z=3190，M》7.21;m/z=4021，M》3.29;m/z=11685，M》22.51;m/z=15076，M》20.71。3、选取如权利要求1所述的血清IO个蛋白中任意两个或两个以上的特征蛋白，利用该质谱模型，将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与本发明的质谱模型逐一进行对比分析，就可应用于肾癌的早期检测、筛查和复发转移的评估。全文摘要本发明涉及一种检测肾癌特征蛋白的优化质谱模型及其制备方法，属于质谱检测
技术领域：
。本发明从血清中筛选出7个上调蛋白和3个下调蛋白作为特征蛋白，选取所述10个蛋白中任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M，建立了肾癌患者与正常人、肾癌良性疾病、肾癌淋巴结转移及肾癌远端转移患者两两鉴别的血清特征蛋白质谱模型；本发明为进一步发现新的肾癌生物标志提供了基础。本发明对于肾癌的检测优于目前所采用的任何单一检测方法，为肾癌的早期发现、早期治疗提供了一种非侵入性技术，从而为降低肾癌的病死率、提高肾癌的治愈率，并进一步为高危人群筛查肾癌提供了一种新方法。文档编号G01N30/00GK101329347SQ20071011121公开日2008年12月24日申请日期2007年6月18日优先权日2007年6月18日发明者李继承,洋许申请人:洋许

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检测肾癌特征蛋白的优化质谱模型及其制备方法和应用的制作方法