专利名称：河豚鱼成分检测实时pcr检测引物、试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及食品中河豚鱼成分检测实时PCR检测引物、试剂盒及检测方法。
背景技术：
水产品是世界经济贸易的重要组成部分，也是重要的食品蛋白质来源。可食用水产品种类繁多，国际贸易的主要品种有25大种群，仅美国食品药品管理局列出的可食水产品名单上就有约1700多种。随着水产品国际贸易的发展和加工水平的提高，特定种类产品供需关系的变化，部分商家用低值水产品假冒高值水产品进行销售，获得不当的经济利益，如将养殖的鳟鱼假冒大西洋鲑，将罗非鱼、錤鳅鱼假冒红鲷等。也曾有将河豚鱼片混入安康鱼片导致食用者中毒死亡的案例。由美国National Seafood Inspection Laboratory开展的一项为期9年的调查结果显示:有37%的鱼类产品和13%的其它海洋食品的物种没有正确标识。最近欧洲和北美进行的市场调查表明，水产品原料错误标识率在15-43%，红鲷产品的错误标识率竟高达75%。除了经济损失之外，该行为还对保护频临灭绝物种、食品安全、经济秩序带来严重危害。水产加工品的物种真伪鉴定目前已经成为水产加工业中面临的重要问题。欧盟已经建立了标签法，强制生产商提供水产品物种证明、产地和生产方法等信息；美国按照食品药品化妆品联邦法案的规定，禁止水产品的假冒行为；加拿大食品检验局及进口商于2011年12月起尝试对部分进口海产品进行DNA检验。这种检测主要针对以低值鱼冒充高值鱼的经济欺诈情况。为了防止经济欺诈行为的发生，确保食品安全，有必要针对水产加工品的原料真伪进行鉴定。当水产品未经加工处理、外观完整时，通�？梢酝ü翁卣髋卸掀分值恼嫖�。对于水产加工品如 鱼糜、烤鱼片、生鱼片、罐头、鱼粉等，则需要建立基于DNA分析的鉴定方法。河豚鱼和安康鱼加工成鱼片或鱼泥之后，很难从形态上加以区别。为了确保食用安全性，防止食用河豚鱼中毒，有必要选择合适的基因片段，建立实用、可行的鉴定实时PCR方法。目前我国在食品中河豚鱼成分检测方法仍是个空白，在保证方法稳定性、特异性等方面存在很多困难，这也是制约方法建立的瓶颈。鉴于水产品原料真伪鉴定在维护贸易公平、保障食品安全、保护濒危物种等方面的重要性，很多研究人员均对该领域展开了深入研究，建立了一系列的方法并加以应用。EspineiraM等采用PCR测序的FINS方法鉴定鲷、罗非鱼、鲭鱼、鮫錬鱼、比目鱼、鲑鱼。DNA条形码计划是FINS技术中的重要组成部分，该计划是利用一段被称作DNA条形码的序列(C0I)通过PCR测序和分析将物种鉴定标准化的一项全球性项目。到目前为止，已有93%的淡水鱼物种和98%的海洋鱼物种可以通过该方法准确鉴别。Rasmussen R S，Rea S和HsiehC H分别利用PCR-RFLP进行鱼酱、河豚鱼肉、鲑鱼与鳟鱼等海洋食品的鉴定。Rehbein H等利用PCR-SSCP法进行鲑鱼、沙丁鱼、鳗鱼、金枪鱼、鲣鱼、鲟鱼等多种鱼的鉴定。LowensteinJ H等采用RAro方法用于鲶鱼等遗传分析与鉴定。最近有报道针对DNA条形码，利用物种特异性多重PCR成功鉴定鲨鱼、比目鱼、鲣鱼、鲭鱼、鲑鱼和鳟鱼。Taylor等根据ATPase6和ATPase8基因建立了多重Real-time PCR方法，用来鉴定三种具有重要商业价值的鳕鱼。此夕卜，Rasmussen、Itoi S和Lopez I分别采用TaqMan MGB探针用于鳗鱼、金枪鱼、鲑鱼和鳟鱼的鉴定，Bayha K Mort等采用TaqMan LNA探针用于真鲷和美国红鱼的鉴定。2004年，法国率先开发出用于食品与动物饲料检测的DNA芯片FoodExpert-1D系统，可同时分析超过数十种新鲜的或加工过的脊椎动物，包括15种鱼类。Chisholm J等将FoodExpert-1D系统与Real-timePCR进行了比较,表明具有很好的适用性。Kochzius等针对欧盟重要的11种进口鱼类建立了一种DNA芯片。每种方法都有各自的优势和不足。PCR测序法在速度与成本这两方面没有优势。PCR-RFLP方法的分析步骤比较多，相当费时。SSCP的高灵敏度要求很高程度的可重复性，每一次的实验条件要没有差别。PCR-RAPD的主要缺点在于该方法的可重复性，尤其是目标DNA的量少或轻微降解时，这个缺点尤其突出。AFLP方法相对费时，没有大规模应用。DNA芯片与其它方法相比，样本分析相对较慢并且成本过高。Real-time PCR方法具有成本低、操作简便的特点，特别适用于对混合样品的鉴定，应用最为广泛。但是该方法只能用一对特异性的引物分析一个物种，在通用性上受到很大限制。
发明内容
为了解决上述实际问题，本发明建立了一种食品中河豚鱼成分检测实时PCR检测引物、试剂盒及检测方法。提取样品DNA，以DNA为模板，分别采用特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，直接读取实时荧光PCR的增幅现象，能够对食品中的河豚鱼成分进行鉴定。本发明的一方面在于:公开一种河豚鱼成分检测用引物与探针，其包括碱基序列SEQ IDN0.f 3。
本发明建立对河豚鱼物种的真伪鉴别方法，本发明使用了欧洲分子生物学实验室的数据库(gene databanks, EMBL)和BOL、FishTrace参考序列数据库，比较了其中足够多的河豚鱼成分的种间数据。在一些侯选基因片段中，选择了河豚鱼细胞色素b基因片段进行设计引物和探针，建立了实时PCR方法特异性检测河豚鱼DNA的方法，实现对物种属性的真伪鉴别。针对河豚鱼细胞色素b基因片段基因序列设计检测用引物与探针，该基因具有很高的种属特异性。采用DNAMAN8.0软件，据此设计了本发明用于检测的河豚鱼成分的检测引物和探针，序列信息见表I。在引物的设计上对引物和探针的退火温度的一致性，GC含量的相似性等因素进行了充分的考虑，引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。表I河豚鱼特异性检测引物和探针序列
权利要求
1.一种食品中河豚鱼成分的检测用引物与探针，其特征在于，包括以下碱基序列: 上游引物:SEQ ID N0.1 下游引物:SEQ ID N0.2 探针:SEQ ID N0.3。
2.一种食品中河豚鱼成分的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于:包括权利要求1所述食品中河豚鱼成分的检测用引物与探针。
3.一种食品中河豚鱼成分的的实时荧光PCR检测方法，其特征在于:利用权利要求1所述的引物与探针，对样品DNA进行实时荧光PCR方法检测。
4.根据权利要求3所述的食品中河豚鱼成分的的实时荧光PCR检测方法，其特征在于:所述对样品DNA进行实时荧光PCR方法检测为: ①实时荧光PCR反应体系: 反应体系总体积为25 μ L，其中:
全文摘要
本发明公开了一种食品中河豚鱼成分检测实时PCR检测引物、试剂盒及检测方法。该方法针对河豚鱼的特异性基因序列，设计了河豚鱼基因的检测用引物和探针SEQ ID NO.1~3，采用实时荧光PCR法对食品中河豚鱼成分的定性检测。本发明所研制的食品中河豚鱼成分的实时荧光PCR法定性检测方法、对提高食品中河豚鱼成分的检测效率及灵敏度，降低检测成本，检测市场上相关假冒产品，进行食品安全监测和提高检验技术具有重要意义，具有广阔发展前景。
文档编号G01N21/64GK103114142SQ20131004378
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者曹际娟, 李晶泉, 郑秋月, 徐君怡 申请人:曹际娟, 李晶泉, 郑秋月, 徐君怡
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