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专利名称：一种全天麻胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药制剂的质量控制方法，特别是涉及一种用高效液相色谱法对全天 麻胶囊制剂指纹图谱的构建方法及其指纹图谱。
背景技术：
中药质量控制是中药现代化的重要内容，指纹图谱技术被认为是中药质量控制研 究的有效手段。中药指纹图谱能比较全面地反映中药中化学物质的种类与数量，是实现中 药真实性、质量可控性和产品稳定性的可行模式，能更好地反映中药的内在品质。随着中药 指纹图谱及化学模式识别技术的发展，指纹图谱技术已日益成为国内外广泛接受的中药质 量评价模式。基于定量指纹图谱技术的中药质量控制模式是以传统中医药理论体系为基础 的综合控制模式，体现了中医药整体治疗的特色。定量指纹图谱技术在原有指纹图谱的方 法上赋予指纹图谱大量的定性、定量信息共同应用于中药质量控制，对指纹图谱中多个目 标成分尤其是有效成分进行准确定量，使中药质量控制更加准确，能更真实反映中药的质 量状况和产品组成，产品的质量和稳定性更加可靠。全天麻胶囊是以天麻为主要原料的中药制剂，具有平肝，息风的作用，主要用于肝 风上扰所致的眩晕、头痛、肢体麻木等。天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛等酚类化合物 作为全天麻胶囊的活性成分，常作为含量测定中质量控制指标性成分。随着现代医药的高 速发展，现行《中国药典》中全天麻胶囊的质量控制标准已不能真实反映全天麻胶囊的内在 品质及批与批之间产品质量的一致性。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种全天麻胶囊指纹图 谱的建立方法及其指纹图谱，该方法用高效液相色谱法对全天麻胶囊种的多种指标成分进 行含量测定，获得指纹图谱，用于评价和控制全天麻胶囊的质量，可以保证全天麻胶囊的质 量稳定性、一致性和可控性，从而确保全天麻胶囊的安全性和有效性。为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案
本发明一种全天麻胶囊指纹图谱的建立方法全天麻胶囊用乙醇水溶液提取后浓缩， 加乙腈水溶液溶解，以天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛和巴利森苷为对照品，照高效 液相色谱法建立指纹图谱。进一步的，上述全天麻胶囊指纹图谱的建立方法全天麻胶囊用质量百分浓度为 10 80%的乙醇水溶液提取后浓缩至干品，干品加体积百分浓度为0. 5 5%的乙腈水溶 液溶解，以天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛和巴利森苷为对照品，对照品用体积百分 浓度为0. 5 5%的乙腈水溶液溶解，照高效液相色谱法建立指纹图谱。前述方法中所述高效液相色谱法的色谱条件为=Synergi 4u Hydro-RP 80A柱为 色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1. Oml/min,柱温28 45°C，检测波长220 284nm。
4
具体的，前述全天麻胶囊指纹图谱的建立方法如下
(a)供试品溶液的制备称取全天麻胶囊0.5 5. 0g，精密加入质量百分浓度为10 80%的乙醇水溶液10 100ml，称定重量，加热回流提取0. 5 5h，放冷，再称定重量，用 相同浓度的乙醇溶液补足减失重量，摇勻，过滤，取续滤液浓缩至干品后加体积百分浓度 为0. 5 5%的乙腈水溶液溶解，定容至10ml，摇勻，微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶 液；
(b)对照品溶液的配制精密称取天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛和巴利森苷对 照品各0. 5 5mg置IOml量瓶中，加体积百分浓度为0. 5 5%的乙腈水溶液溶解并定容 至刻度，再精密吸取10 500μ 1置5ml量瓶中，用相同浓度的乙腈溶液定容至刻度，微孔 滤膜过滤，取续滤液作为对照品溶液；
(c)色谱条件Synergi4u Hydro-RP 80A柱为色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为 质量百分浓度0. 1 %的磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1. Oml/min,柱温30 40°C，检测波长 265 275nm ；
(d)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到全天麻 胶囊的指纹图谱。前述全天麻胶囊指纹图谱的最佳建立方法如下
(a)供试品溶液的制备精密称取全天麻胶囊1.Og,精密加入50%的乙醇溶液25ml， 称定重量，加热回流提取3h，放冷再称定重量，用50%的乙醇溶液补足减失的重量，摇勻，滤 过，取续滤液10ml，浓缩至干品后加2%乙腈溶液溶解并定容至10ml，摇勻，微孔滤膜过滤， 取续滤液作为供试品溶液；
(b)对照品溶液的配制精密称取天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛和巴利森苷对 照品各Img置IOml量瓶中，2%乙腈溶液溶解并定容至刻度，再精密吸取100 μ 1置5ml量瓶 中，2%乙腈溶液定容至刻度，微孔滤膜过滤，取续滤液作为对照品溶液；
(c)色谱条件Synergi4u Hydro-RP 80A柱为色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为 0. 1%磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1. Oml/min,柱温40°C，检测波长270nm ；
(d)测定精密吸取供试品溶液5 40μ 1注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定， 得到全天麻胶囊的指纹图谱。前述方法中所述微孔滤膜过滤是用0. 2 μ m的微孔滤膜过滤。前述方法中所述梯度洗脱的程序以如下体积比浓度配置进行
洗脱时间流动相A的比例流动相B的比例
O min2%98%
8 min2%98%
21 min8%92%
30 min12%88%
47 min25%75%。用前述方法建立的指纹图谱中有33个特征共有峰，其中第7、10、22、26、27和29 号峰分别为天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷，图 谱总长度为65min。上述指纹图谱中所述33个特征共有峰的平均保留时间(min)如下1号峰 4号峰 7号峰 10号峰 13号峰 16号峰 19号峰 22号峰 25号峰 28号峰 30号峰
1. 957 士 0. 24% 4. 034 士 1. 06% 8. 101 士 0. 64% 12. 997 士 0. 45% 15. 093 士 0. 43% 17. 198 士 0. 26% 21. 015士0. 37% 26. 189士0. 27% 30. 058士0.15% 39. 403士0.10% 45. 440士0. 06%
2 号峰2. 281 士0. 74% ； 5 号峰4. 354士 1. 56% ； 8 号峰10. 225士0. 48% ； 11 号峰13. 838士0. 34% ； 14 号峰15. 889士0. 27% 17 号峰18. 275士0. 24% 20 号峰21. 856士0. 55% 23 号峰27. 906士 1. 43% 26 号峰34. 886士0. 11%
29号峰40. 597士0. 68%
30号峰47. 550士0. 08%
3 号峰3. 010士 1. 13% ； 6 号峰4. 675士 1. 12% ； 9 号峰11. 545士0. 58% ； 12 号峰14. 662士0. 29% 15 号峰16. 817士0. 42% 18 号峰20. 580士0. 14% 21 号峰24. 871 士0. 14% 24 号峰28. 724士 1. 39% 27 号峰36. 798士0. 09% 30 号峰42. 923士0. 10% 30 号峰48. 326士0. 06%c与现有技术相比，本发明的有益效果如下
(1)用本发明所提供的方法建立的全天麻胶囊HPLC指纹图谱与对照图谱的相似度均 大于0. 9，能有效的表征其质量，有利于全面监控产品的质量。(2)指纹图谱注重各特征峰的关联性和指纹图谱的整体面貌特征，避免了全天麻 胶囊质量控制的单一性和片面性，减少了人为处理产品质量达标的可能性。(3)本发明基于指纹图谱用多指标成分控制产品质量，保证了产品质量的长期稳 定性，疗效的安全性和可靠性。(4)本发明具有方便、快捷、稳定、精密度高和重现性好等优点，可准确可靠的控制 全天麻胶囊的质量。


图1是全天麻胶囊指纹图谱；
图2是10批次全天麻胶囊的指纹图谱。
具体实施例方式
实施例1 全天麻胶囊基于指纹图谱的质量控制方法
仪器Prominenece UFLC超快速液相色谱仪系统，Agilent 1100高效液相色谱仪系 统，AE240十万分之一电子天平，超纯水机。试药天麻素对照品、巴利森苷对照品、对羟基苯甲醇对照品，对羟基苯甲醛对照 品，乙腈(色谱纯)，全天麻胶囊。供试品溶液的制备精密称取本全天麻胶囊1. 0g，精密加入质量百分浓度为50% 的乙醇水溶液25ml，称定重量，加热回流提取3h，放冷再称定重量，用相同浓度乙醇溶液补 足减失的重量，摇勻，滤过，取续滤液10ml，浓缩至干品后加体积百分浓度为2%的乙腈水溶 液溶解并定容至IOml，摇勻，用0. 2 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。对照品溶液的配制精密称取天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛和巴利森苷对 照品各Img置IOml量瓶中，用体积百分浓度为2%的乙腈水溶液溶解并定容至刻度，再精密 吸取100μ 1置5ml量瓶中，用相同浓度乙腈水溶液定容，用0. 2μπι微孔滤膜滤过，取续滤 液作为对照品溶液。色谱条件Synergi4u Hydro-RP 80A 柱(4. 6mmX 150mm，4 μ m )为色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0. 1%磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1. Oml/min,柱温40°C，检测波长 270nm，梯度洗脱程序的体积浓度配置如下
洗脱时间流动相A的比例流动相B的比例
O min2%98%
8 min2%98%
21 min8%92%
30 min12%88%
47 min25%75%。测定精密吸取供试品溶液10 μ 1注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到 全天麻胶囊的指纹图谱，如图1所示。供试品指纹图谱与全天麻胶囊标准指纹图谱相似度应不低于0. 90，参照峰为7、 10、22、26、27和29号峰，分别为天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷B、巴利森 苷C和巴利森苷，图谱总长度为65min，具体各峰平均保留时间(min)为
1号峰 4号峰 7号峰 10号峰 13号峰 16号峰 19号峰 22号峰 25号峰 28号峰 30号峰
1. 957 士 0. 24% 4. 034 士 1. 06% 8. 101 士 0. 64% 12. 997 士 0. 45% 15. 093 士 0. 43% 17. 198 士 0. 26% 21. 015士0. 37% 26. 189士0. 27% 30. 058士0.15% 39. 403士0.10% 45. 440士0. 06%
2 号峰2. 281 士0. 74% ； 5 号峰4. 354士 1. 56% ； 8 号峰10. 225士0. 48% ； 11 号峰13. 838士0. 34% ； 14 号峰15. 889士0. 27% 17 号峰18. 275士0. 24% 20 号峰21. 856士0. 55% 23 号峰27. 906士 1. 43% 26 号峰34. 886士0. 11%
29号峰40. 597士0. 68%
30号峰47. 550士0. 08%
3 号峰3. OlO士 1. 13% ； 6 号峰4. 675士 1. 12% ； 9 号峰11. 545士0. 58% ； 12 号峰14. 662士0. 29% 15 号峰16. 817士0. 42% 18 号峰20. 580士0. 14% 21 号峰24. 871 士0. 14% 24 号峰28. 724士 1. 39% 27 号峰36. 798士0. 09% 30 号峰42. 923士0. 10% 30 号峰48. 326士0. 06%c实施例2 全天麻胶囊指纹图谱的建立
采用实施例1所述方法测定共10个批次的全天麻胶囊(20080102、20080401、 20080603,20081001,20081205,20090302,20090405,2009050U2009060U20090602)o10个批次的全天麻胶囊的指纹图谱如图2所示。通过10批次全天麻胶囊HPLC图谱的比较，进行相似度评价采用国家药典委员 会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版)”对10批次全天麻胶囊进行相似度计 算，10批次全天麻胶囊与对照指纹图谱(10批次全天麻胶囊生成的共有模式Si)相似度均 大于0.97 (表1)。表1全天麻胶囊相似度比较结果
权利要求
一种全天麻胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于全天麻胶囊用乙醇溶液提取后浓缩，加乙腈水溶液溶解，以天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛和巴利森苷为对照品，照高效液相色谱法建立指纹图谱。
2.按照权利要求1所述全天麻胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于全天麻胶囊用 质量百分浓度为10 80%的乙醇溶液提取后浓缩至干品，干品加体积百分浓度为0. 5 5%的乙腈水溶液溶解，以天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛和巴利森苷为对照品，对照 品用体积百分浓度为0. 5 5%的乙腈水溶液溶解，照高效液相色谱法建立指纹图谱。
3.按照权利要求1或2所述全天麻胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于所述高效 液相色谱法的色谱条件为Synergi 4u Hydro-RP 80A柱为色谱柱，流动相A为乙腈，流动 相B为磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1. Oml/min,柱温28 45°C，检测波长220 284nm。
4.按照权利要求3所述全天麻胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于(a)供试品溶液的制备称取全天麻胶囊0.5 5. Og，精密加入质量百分浓度为10 80%的乙醇水溶液10 100ml，称定重量，加热回流提取0. 5 5h，放冷，再称定重量，用 相同浓度的乙醇溶液补足减失重量，摇勻，过滤，取续滤液浓缩至干品后加体积百分浓度 为0. 5 5%的乙腈水溶液溶解，定容至10ml，摇勻，微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶 液；(b)对照品溶液的配制精密称取天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛和巴利森苷对 照品各0. 5 5mg置IOml量瓶中，加体积百分浓度为0. 5 5%的乙腈水溶液溶解并定容 至刻度，再精密吸取10 500μ 1置5ml量瓶中，用相同浓度的乙腈水溶液定容至刻度，微 孔滤膜过滤，取续滤液作为对照品溶液；(c)色谱条件Synergi4u Hydro-RP 80A柱为色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为 质量百分浓度0. 1 %的磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1. Oml/min,柱温30 40°C，检测波长 265 275nm ；(d)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到全天麻 胶囊的指纹图谱。
5.按照权利要求4所述全天麻胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于(a)供试品溶液的制备精密称取全天麻胶囊1.Og,精密加入50%的乙醇溶液25ml， 称定重量，加热回流提取3h，放冷再称定重量，用50%的乙醇溶液补足减失的重量，摇勻，滤 过，取续滤液10ml，浓缩至干品后加2%乙腈溶液溶解并定容至10ml，摇勻，微孔滤膜过滤， 取续滤液作为供试品溶液；(b)对照品溶液的配制精密称取天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛和巴利森苷对 照品各Img置IOml量瓶中，2%乙腈溶液溶解并定容至刻度，再精密吸取100 μ 1置5ml量瓶 中，2%乙腈溶液定容至刻度，微孔滤膜过滤，取续滤液作为对照品溶液；(c)色谱条件Synergi4u Hydro-RP 80A柱为色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为 0. 1%磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1. Oml/min,柱温40°C，检测波长270nm ；(d)测定精密吸取供试品溶液5 40μ 1注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定， 得到全天麻胶囊的指纹图谱。
6.按照权利要求4或5所述全天麻胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤(a)和 (b)中所述微孔滤膜过滤是用0. 2 μ m的微孔滤膜过滤。
7.按照权利要求3所述全天麻胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于所述梯度洗脱 的程序以如下体积比浓度配置进行洗脱时间流动相A的比例流动相B的比例·0 min2%98%·8 min2%98%·21 min8%92%·30 min12%88%·47 min25%75%。
8.按照权利要求4或5所述全天麻胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于所述梯度 洗脱的程序以如下体积比浓度配置进行洗脱时间流动相A的比例流动相B的比例·0 min2%98%·8 min2%98%·21 min8%92%·30 min12%88%·47 min25%75%。
9.权利要求1至8任一所述方法建立的全天麻胶囊指纹图谱，其特征在于所述指纹 图谱中有33个特征共有峰，其中第7、10、22、26、27和29号峰分别为天麻素、对羟基苯甲 醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷，图谱总长度为65min。
10.按照权利要求9所述的全天麻胶囊指纹图谱，其特征在于所述33个特征共有峰 的平均保留时间如下·1号峰 4号峰 7号峰 10号峰 13号峰 16号峰 19号峰 22号峰 25号峰 28号峰 30号峰·1. 957 士 0. 24% 4. 034 士 1. 06% 8. 101 士 0. 64% ·12. 15. 17. 21. 26. 30. 39. 45.·997 士 0. 093 士 0. 198 士 0. 015 士 0. 189 士 0. 058 士 0. 403 士 0. 440 + 0.·45% 43% 26% 37% 27% 15% 10% 06%·2 号峰2. 281 士0. 74% ； 5 号峰4. 354士 1. 56% ； 8 号峰10. 225士0. 48% ； 11 号峰13. 838士0. 34% ；·3 号峰3. 010士 1. 13% ； 6 号峰4. 675士 1. 12% ； 9 号峰11. 545士0. 58% ； 12 号峰14. 662士0. 29%·14号峰 17号峰 20号峰 23号峰 26号峰 29号峰 30号峰·15. 889 士 0. 18. 275 士 0. 21. 856士0. 27. 906士 1. 34. 886士0. 40. 597 士0. 47. 550 士0.·27% 24% 55% 43% 11% 68% 08%·15号峰 18号峰 21号峰 24号峰 27号峰 30号峰 30号峰·16. 20, 24, 28, 36, 42, 48,·817 士 0. 580 士 0. 871 士 0. 724 士 1. 798 士 0. 923 士 0. 326 士 0.·42% 14% 14% 39% 09% 10% 06%,
全文摘要
本发明公开了一种全天麻胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，该方法包括(a)供试品溶液的制备，(b)对照品溶液的配制，(c)色谱条件Synergi4uHydro-RP80A柱为色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1.0ml/min，柱温30～40℃，检测波长265～275nm，(d)测定，得到全天麻胶囊的指纹图谱。此方法测定的指纹图谱重复性高，重现性好，相似度高，作为全天麻胶囊的质量控制方法，能很好的控制全天麻胶囊的质量，有利于全天麻胶囊产品的安全性和质量的稳定性。
文档编号G01N30/06GK101972414SQ201010532518
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者刘智, 张秋生, 高翔 申请人:贵州益康制药有限公司