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专利名称：一种血液、尿液及组织中硝酸盐与亚硝酸盐的检测方法
技术领域：
本发明属于药物残留检测技术领域，具体涉及一种准确测定人或动物的血液、尿液及组织中硝酸盐与亚硝酸盐含量的方法。
背景技术：
一氧化氮(NO)是一种重要的舒血管因子，低浓度NO使支气管平滑肌和肺血管舒张，它的有效释放对人体或动物维持正常的血管压力起着重要的作用。同时，NO还是一种重要的神经递质，在不同的中枢神经系统中扮演了重要和神秘的角色，几乎参与所有系统的生理过程调控和病理生理过程的发展，而在抑制血小板聚集、动脉粥样硬化、肌肉松弛、炎症、血压、免疫反应和心血管监管方面的作用尤为重要。但NO的化学性质非常活泼，在体内的半衰期仅为3 5s，极容易被氧化，在动物体内主要以硝酸盐(N03_)、亚硝酸盐(N02_)的形式存在。同时硝酸盐和亚硝酸盐还会来自于食品，植物性食品和动物源食品往往天然含有大量的硝酸盐，如果保存和处理不当，在硝酸盐还原酶作用下这些食品可能产生大量的亚硝酸盐。一次摄入过量的亚硝酸盐可以引起高铁血红蛋白血症，3个月以下儿童尤其敏感。同时，亚硝酸盐还能与食品中常见的有机胺类物质形成致癌性的N-亚硝胺化合物，从而威胁人体健康。因此,可以通过测定尿液、血液中的NOf和NOf的含量来反映体内NO含量和作为反应多项身体机能的重要指标。目前，N03_、NO2-的测定一般是通过硝酸还原酶法、镉柱还原法、离子色谱法、紫外分光光度法等来完成的。然而血液或尿液中N02_含量低，因个体差异，血液或尿液中复杂的成分常常干扰实验结果，难以达到检测需求。现有技术中尚未见用HPLC同时准确测定尿液、血液及组织中的硝酸盐与亚硝酸盐含量的方法。

发明内容
本发明的目的在于 针对现有技术的不足，提供一种稳定性好、干扰小、能同时准确测定血液、尿液及组织中硝酸盐与亚硝酸盐含量的方法。本发明的目的通过以下技术方案予以实现。除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。一种血液、尿液及组织中硝酸盐与亚硝酸盐的检测方法，包括以下步骤:(I)硝酸盐、亚硝酸盐标准工作曲线制作:分别取浓度为200 μ g/mL的NOf标准溶液 0.20,0.4,0.6,0.80、1.0OmL 和浓度为 20 μ g/mL 的 NO2-标准溶液 0.20,0.4,0.6,0.80、1.0OmL,分别稀释至5mL,分别得到浓度为8.0,16.0, 24.0，32.0，40.0 μ g/mL的N03_溶液和
0.8，1.6，2.4，3.2，4.0 μ g/mL 的 N02_ 溶液；加入 150 μ L GriessA 试剂，混合均匀；Imin 后加入150 μ L GriessB试剂,混合均勻，放置5min后,进样10 μ L至液相色谱仪,经洗脱后，分别在220nm和510nm波长处进行测定；得到硝酸盐及亚硝酸盐回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率；(2)样品检测:
尿液的检测:取IOmL尿液,加入0.5 1.0g吸附剂,混合均勻，离心脱色,滤纸过滤除去吸附剂；取5mL脱色后的尿液,加入150 μ L GriessA试剂,混合均勻；lmin后加入150 μ L GriessB试剂,混合均勻,放置5min后,进样10 μ L至液相色谱仪,经洗脱后,分别在220nm和510nm波长处进行测定；所述吸附剂为:活性炭、硅镁吸附剂、海泡石、凸棒石、直链藻、娃藻土、娃胶、活性氧化招或壳聚糖中之一种，用量0.5 1.0g ;血液的检测:取5mL新鲜血液，放入离心机中离心，取上清液，加入10%重量体积比的氢氧化钠溶液0.1mL和5%重量体积比的硫酸锌溶液lmL，离心分离，取上清液ImL加入50 μ L GriessA试剂,混合均勻;Imin后加入50 μ L GriessB试剂,混合均勻，放置5min后,进样10 μ L至液相色谱仪，经洗脱后，分别在220nm和510nm波长处进行测定；组织匀浆的检测:取0.2g 1.0g组织块在生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重；量取3 5mL生理盐水于烧杯中，剪碎上述洗净的组织块，超声lOmin，使组织匀衆化；将制备好的勻衆放入离心机中离心，取上清液ImL,加入50 μ L GriessA试剂,混合均勻；Imin后加入50 μ L GriessB试剂,混合均勻,放置5min后,进样10 μ L至液相色谱仪，经洗脱后，分别在220nm和510nm波长处进行测定。其中，步骤(I) (2)中所述的GriessA试剂为50mg对氨基苯磺酸溶于10%醋酸
1.5mL和去离子水3mL ；GriessB试剂为4mg N-1-萘乙二胺盐酸盐溶于10%醋酸4mL。其中，步骤(1) (2)中所述的洗脱，其特征在于:流动相条件为乙腈:离子对试剂:甲醇体积百分比按表1条件进行梯度洗脱；表权利要求
1.一种血液、尿液及组织中硝酸盐与亚硝酸盐的检测方法，包括以下步骤: (1)硝酸盐、亚硝酸盐标准工作曲线制作:分别取浓度为200yg/mL的N03_标准溶液 0.20,0.4,0.6,0.80、1.0OmL 和浓度为 20 μ g/mL 的 NO2-标准溶液 0.20,0.4,0.6,0.80、1.0OmL,分别稀释至5mL,分别得到浓度为8.0,16.0, 24.0，32.0，40.0 μ g/mL的N03_溶液和0.8，1.6，2.4，3.2，4.0 μ g/mL 的 N02_ 溶液；加入 150 μ L GriessA 试剂，混合均匀；Imin 后加入150 μ L GriessB试剂,混合均勻，放置5min后,进样10 μ L至液相色谱仪,经洗脱后，分别在220nm和510nm波长处进行测定；得到硝酸盐及亚硝酸盐回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率； (2)样品检测: 尿液的检测:取IOmL尿液，加入0.5 1.0g吸附剂，混合均匀，离心脱色，滤纸过滤除去吸附剂；取51111^脱色后的尿液,加入150μ L GriessA试剂,混合均勻；lmin后加入150 μ LGriessB试剂,混合均勻，放置5min后,进样10 μ L至液相色谱仪,经洗脱后，分别在220nm和510nm波长处进行测定；所述吸附剂为:活性炭、硅镁吸附剂、海泡石、凸棒石、直链藻、硅藻土、娃胶、活性氧化招或壳聚糖中之一种，用量0.5 1.0g ; 血液的检测:取5mL新鲜血液，放入离心机中离心，取上清液，加入10%重量体积比的氢氧化钠溶液0.1mL和5%重量体积比的硫酸锌溶液lmL，离心分离，取上清液ImL加入50 μ LGriessA试剂，混合均勻；lmin后加入50 μ L GriessB试剂,混合均勻，放置5min后,进样10 μ L至液相色谱仪，经洗脱后，分别在220nm和510nm波长处进行测定； 组织匀浆的检测:取0.2g 1.0g组织块在生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重；量取3 5mL生理盐水于烧杯中，剪碎上述洗净的组织块，超声lOmin，使组织匀浆化；将制备好的匀浆放入离心机中离心，取上清液lmL，加入50 μ L GriessA试剂，混合均匀；Imin后加入50 μ L GriessB试剂,混合均勻,放置5min后,进样10 μ L至液相色谱仪,经洗脱后，分别在220nm和510nm波长处进行测定。
2.根据权利要求1所述的检 测方法，其特征在于:步骤(I)和(2)中所述的GriessA试齐Li为50mg对氨基苯磺酸溶于10%醋酸1.5mL和去离子水3mL ；GriessB试剂为4mg N-1-萘乙二胺盐酸盐溶于10%醋酸4mL。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤(I)和(2)中所述的洗脱，其流动相条件为乙腈:离子对试剂:甲醇体积百分比按表I条件进行梯度洗脱； 表I
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:样品检测中所述的离心条件为离心时间10 30min,离心速率4000 IOOOOr / min。
全文摘要
本发明公开了一种血液、尿液及组织中硝酸盐与亚硝酸盐的检测方法。在弱酸性条件下硝酸根离子与离子对试剂形成离子对，亚硝酸盐与Griess试剂发生重氮化偶合反应，形成偶氮化合物，使不能在色谱柱上保留且无紫外吸收的硝酸盐与亚硝酸盐能同时在不同波长下进行液相色谱分析，消除了相互干扰。对于基体干扰大、且含量低的血液、尿液及组织中的硝酸盐与亚硝酸盐检测具有较大适用性，硝酸盐与亚硝酸盐检测限分别为0.2μg/mL和0.05μg/mL。该发明具有操作简单、测定快速、有效，准确等特点。
文档编号G01N33/02GK103235093SQ20131012929
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月15日 优先权日2013年4月15日
发明者杨亚玲, 赵娇, 吕云辉 申请人:云南健牛生物科技有限公司