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专利名称：一种快速鉴别作物种子纯度的方法
一种改进的、利用电泳法快速鉴别作物种子，特别是禾本科作物种子纯度的方法，属选种技术领域。
随着现代种植技术的发展，人的对种子重要性的认识越来越高，种子的质量或者说高质量的种子纯度成为增产的关键。当前，鉴别禾本科作物种子纯度，例如玉米种子，一直采用形态法，即从待检种子的外观开始，直至种苗和全株长成，随访检查，借以判别是否纯种。这种方法有着难以克服的缺点一是形态特征不易掌握，用直觉去判断种子的纯度，易产生较大的误差;二是确定种子的纯度时间长，与生产严重脱节，鉴别一批种子一般需三个月左右，最快的也要十几天。且鉴定与生产同步进行，鉴定结论作出之时，即是作物长成定型之日，生米做成熟饭，无法弥补;三是浪费大量的人财物，而得到的数据准确度都很低。如何迅速准确地鉴定出作物种子的纯度，一直是国内外研究的课题。
对此，国际上曾有人利用等电聚焦技术分析种子蛋白质的方法，去鉴别种子的纯度。其原理是两性载体(ampholion)在电场的作用下形成一个PH梯度，蛋白质分子运动到与其等电点相同的PH区段，就不再运动，这种方法分辨率较高，也比较准确，但两性载体价格昂贵，检测费用高。
浙江大学、中国科学院遗传研究所提出利用同工酶电泳技术鉴别种子纯度，但这种方法要求待检种子必须都能发芽，若是死种子，酶就丧失了活力，电泳后也就无法判定种子的归属。
中国科学院植物研究所利用电泳技术分析玉米种子的纯度，采用未脱脂的玉米粉，用尿素提取蛋白，凝胶先进行予电泳而后加样。这种方法较为简单易行，但存在以下问题一是蛋白质在电泳过程中易产生沉淀;二是电泳分辨率不高;三是有些蛋白质同脂肪结合在一起，对蛋白质迁移率有影响，常发生拖带现象，使蛋白图谱不清晰。
本发明的目的在于提供一种利用电泳技术，迅速准确地鉴定作物种子纯度的简便实用方法。它应具备较低的检测成本，而又能获得清晰的蛋白图谱。
除此之外，本发明还应解决蛋白质的沉淀和蛋白图谱中的拖带现象。
本发明的目的是这样实现的利用电泳技术，以一定浓度一定PH值的Tris-乳酸缓冲液配胶，使其在电场中形成PH梯度胶，使待测种子蛋白质分子在电场作用下迁移至与其等电点一致的PH区段，并一直聚焦在那里，当蛋白质分子分离完后，再按传统的方法染色照相，即可获得清晰的蛋白图谱。然后，将待测种子蛋白图谱与标准蛋白图谱相比较，即可求得被测种子的纯度。
以下结合实施例对本发明作进一步详述。
本发明的关键是寻找一种电泳检测所需要的低成本高效率的PH梯度胶，即制作出合适的分离胶(包括重胶液和轻胶液)和成层胶。中国科学院植物所采用的分离胶的成份是(以总体积20ml为例，下同)重胶液(20%)轻胶液(10%)30%丙烯酰胺8.0ml30%丙烯酰胺40ml乳酸钙0.2g乳酸钙0.2gTEMED20-30μlTEMED15-25μl10%APS30-50μl10%APS40-60μl水4.0ml水8.0ml成层胶的成份是(5%)30%丙烯酰胺1.0ml乳酸钙0.1gTEMED30μl10%APS40-60μl水5.0ml其中TEMED是指NN，N′N′-四甲基乙二铵，APS是指过硫酸铵。
本发明所用分离胶是在上述组份基础上，加入Tris-乳酸(Tris是指三羟甲基氨基甲烷)和尿素，各组份含量为重胶液(15-25%)轻胶液(10-15%)Tris-乳酸1.7-5ml尿素0.5-4g0.5-4g
30%丙烯酰胺5-8.3ml3.3-5ml水5-6.7ml乳酸钙0.05-0.15g0.05-0.15gTEMED25-40μl15-40μl10%APS30-60μl30-60μl本发明所用成层胶(3.5-7%)是在原成胶的基础上，加入尿素而成，其组份含量为尿素0.5-1g30%丙烯酰胺0.5-1ml水3.2-3.7ml乳酸钙0.05-0.1gTEMED20μl10%APS30μl由于在胶中加入了尿素，增加了蛋白质的溶解度，从而克服了电泳过程中的沉淀现象。
为了防止在蛋白图谱中出现拖带现象，增加清晰度，在制备被检样品时首先要对种子进行脱脂，脱脂溶剂可采用丙酮、乙醚等。
以下给出本发明所用分离胶和成层胶的几个实施例1、重胶液单各浓度中的含量组份名称位18%21%24%Tris-乳酸ml4.33.11.9尿素g11.5330%丙烯酰胺ml5.76.98.1乳酸钙g0.10.150.15TEMEDμl30303010%APSμl5050502、轻胶液单各浓度中的含量组份名称位10%12%15%尿素g11.63.430%丙烯酰胺ml3.344.8水ml6.765.2乳酸钙g0.10.150.13TEMEDμl30303010%APSμl5050503、成层胶单各浓度中的含量组份名称位4%5%7%30%丙烯酰胺ml0.560.70.98乳酸钙g0.040.060.1水mL3.63.53.2尿素g0.40.70.96TEMEDμl20202010%APSμl303030制备被检种子蛋白图谱的操作步骤如下1、制备样液将被检种子粉碎，用丙酮进行脱脂，然后将脱脂后的玉米粉加入1M的尿素充分振荡、离心后，制得蛋白样液。
2、准备胶室按常规方法制备好胶室，底部琼脂浓度为1%，高度为3厘米左右。
3、灌胶按配方将重胶液、轻胶液及成层胶配好。将轻胶液倒入梯度混合仪内远离导管的筒内，打开阀门，让轻胶液充满两筒之间的通道，关闭阀门，把重胶液倒入另一筒。将梯度混合仪放在磁力搅拌器上，开启电源搅拌。将导管插入胶室，调整胶液的流速，并迅速打开开关注胶。待胶液离凹玻璃上口3厘米时，停止灌胶并在胶液上注入一薄层水，待胶聚合后，抽出复盖水，注入成层胶，并插入“梳子”，制出符合要求的样品槽。尔后将胶室转移到电泳槽上，用琼脂将玻璃板与电泳槽有机板之间的间隙封好。
4、加样用微量进样器吸取30-40μl的样液，加入样品槽，再加一些0.1M乳酸溶液，然后用琼脂将样品槽密封。
5、电泳在上电极室加入0.1M的乳酸溶液，下电极加入Tris-乳酸缓冲液，上电极为正极，下电极为负极，接通电源。在上电极室胶的正上方上加入甲基绿指示剂，待甲基绿到达底部时，即可收电泳。
6、制备蛋白图谱将电泳后的凝胶取出，切除成层胶及琼脂，将分离胶移入染色盘内，倒入染色液染色，染毕后用脱色剂脱色，直至背景无色为止，即可得到被检干种子蛋白的电泳区带图谱。如需要，图谱可照象留挡。
将被检种子蛋白的图谱与标准种子蛋白图谱相比较，即可求得被检种子的纯度。
用本发明做玉米种子纯度鉴定，所得图谱清晰，没有沉淀和拖带现象，分辨率明显提高，图谱中的蛋白谱带数增多。例如中单2号玉米种子的谱带由原来的9条(指采用中国科学院植物所所用方法制得的蛋白图谱中的谱带数，下同)增至18条;丹玉13号玉米种子的谱带由原来的7条增至15条等等。由于谱带增加，使检测的结果更为准确。经计算，其平均误差为0.34%，与形态法相比较，其准确度是形态法三叶期的21倍，花期的25倍，全生育成株的3倍。同GB3543-83国际中允许的误差相比，准确度也提高近3倍。
另外，用本发明鉴定种子纯度非常迅速，时间仅需30小时，而形态法则需720-3000小时。由于检测迅速，使农民完全可以在播种前检测完毕，且准确度高，避免了劣种、假种所带来的经济损失。检测费用低，与采用两性载体的等电聚焦法相比，成本降低了近90%。本发明可以广泛用于检测禾本科作物，诸如玉米、小麦、高梁、谷子等种子的纯度。
权利要求
1.一种快速鉴别种子纯度的方法，它利用电泳技术，将被检种子粉碎，制备蛋白质样液，加入胶室内，进行电泳、染色及脱色等操作后，制得其蛋白图谱，而后与标准种子的蛋白图谱相比较，求得被检种子的纯度，电泳胶室所用的分离胶由重胶液及轻胶液在梯度混合仪上混配而成，其中，重胶液由丙烯酰胺、乳酸钙、N、N、N′、N′-四甲基乙二胺、过硫酸铵及水组成，轻胶液由丙烯酰胺、乳酸钙、N、N、N′、N′-四甲基乙二胺、过硫酸铵和水组成，成层胶由丙烯酰胺、乳酸钙、NN、N′、N′-四甲基乙二胺、过硫酸胺及水组成，其特征在于在分离胶中加入尿素和三羟甲基氨基甲烷乳酸缓冲液，在成层胶中加入尿素，各组份含量为a、重胶液(15-25%)(以20ml总量计，下同)三羟甲基氨基甲烷-乳酸 1.7-5ml尿素 0.5-4g乳酸钙 0.05-0.15gNNN′N′-四甲基乙二胺 15-40μl30%丙烯酰胺5-8.3ml10%过硫酸铵30-60μlb、轻胶液(10-15%)尿素 0.5-4g30%丙烯酰胺3.3-5ml水 5-6.7ml乳酸钙 0.05-0.15NNN′N′-四甲基乙二胺 15-40μl10%过硫酸铵30-60μlc、成层胶尿素 0.5-1g30%丙烯酰铵0.5-1ml水 3.2-3.6ml乳酸钙 0.05-0.1gNNN′N′-四甲基乙二铵 20μl10%过硫酸铵30μl。
2.根据权利要求1所述的快速鉴别作物种子纯度的方法，其特征在于被检种子在粉碎后进行脱脂，脱脂溶剂可采用丙酮、乙醚等。
全文摘要
一种快速鉴别种子纯度的方法，它利用电泳技术制作被检种子的蛋白图谱，与标准种子的蛋白图谱比较后求得被检种子的纯度。由于采用了一定浓度一定pH值的Tris—乳酸缓冲液配胶，使其在电场中形成pH梯度胶，从而使蛋白图谱清晰、准确。其误差率较国标要求值提高了近3倍，时间由720-3000小时缩短为30小时，检测成本降低90％。
文档编号G01N27/447GK1046979SQ9010054
公开日1990年11月14日 申请日期1990年2月2日 优先权日1990年2月2日
发明者牛战旗, 尚颖 申请人:河北省农产商品质量鉴督检验站