专利名称：用于合成感染性丙型肝炎病毒的细胞培养系统的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及病毒学领域，更特别地涉及在组织培养系统中产生丙型肝炎病毒(HCV)。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)使高比例的被感染个体发生慢性感染并伴有进行性肝脏病理学改变，包括肝硬化和肝细胞癌。抗病毒药物如干扰素α和病毒唑在控制HCV感染上作用有限。其结果，它成为美国进行肝移植的首要原因。HCV是含单链加极性RNA基因组(～9500nt)的有包膜病毒，当直接注射进黑猩猩肝脏时是有感染性的。病毒RNA的5′非翻译区含有内在核糖体进入部位(IRES)，用于将单链开放阅读框翻译成大的聚合蛋白。通过前体的蛋白水解加工产生病毒的结构和非结构蛋白。因为缺少合适和可靠的组织培养系统，HCV成为难于研究的病毒。新近确立的缺少病毒结构蛋白的HCV复制子是一个重要的进展，因为它可以在组织培养细胞中检测病毒基因的表达和复制。但是，以复制子为基础的系统不产生感染性病毒，因为没有病毒结构蛋白；因此，不发生细胞至细胞的病毒传播。此外，病毒基因组的遗传分析受到妨碍，由于研究个体突变需要产生稳定的细胞系。
HCV聚合蛋白从氨基末端到羧基末端包括，核心蛋白(C)、包膜蛋白(E1和E2)和非结构蛋白(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B)。C编码核心核壳体蛋白，E1和E2是包被病毒的包膜蛋白，NS2、NS3和NS4A涉及HCV聚合白的蛋白水解加工，NS5B具有RNA聚合酶和RNA解螺旋酶活性。NS4A和NS5B的功能未知。
尽管新近克隆了HCV的RNA基因组，但仍然需要可靠的组织培养系统以产生HCV。采用常规的方法，RNA病毒，如脊髓灰质炎病毒，通过用RNA转染细胞而在细胞内产生。用来自RNA病毒如脊髓灰质炎病毒的病毒cDNA转染细胞，还没有成功的产生这种病毒。人们期望，做为RNA病毒的HCV也可以容易地通过用RNA的转染过程而产生，但是发现这种方法不适合于HCV。进一步，人们期望用病毒cDNA转染细胞会是产生HCV的成功方法。无论如何，本发明提出了通过用基因编码的HCV转染肝细胞来合成感染性HCV的一种方法，然后将未感染的细胞与HCV接触以形成另外的HCV。已经发现此合成方法是成功的。
发明概述本发明是基于在组织培养系统中产生感染性丙型肝炎病毒(HCV)的方法的基本发现。在此描述了能够在细胞培养中合成感染性HCV的暂时的、丙型肝炎病毒(HCV)cDNA为基础的表达系统。该系统支持细胞至细胞的病毒传播。在实施例中，通过HCV的复制缺陷和有复制能力突变体的遗传分析显示了该系统的有效性。本发明提供了可靠的系统，不仅用于病毒基因组的遗传分析，而且用于开发新的抗病毒策略。
在一个方面，本发明涉及产生HCV的培养系统。通过用编码HCV的核酸序列和编码RNA聚合酶的核酸序列在适合于转染细胞的条件下转染肝细胞，从细胞培养中制备细胞培养基，其中，转染后的细胞培养基中含有HCV。
本发明的另一个方面涉及在培养系统中被HCV感染的肝细胞的传染性水平的检测方法，如上所描述，通过检测培养系统中细胞表面上表达的HCV特异蛋白量来检测。
而本发明的另一个方面涉及鉴定HCV活性调节物的方法，HCV活性如附着、穿透、包封、释放、复制、翻译或蛋白加工。通过将待测化合物与上面描述的培养系统接触并检测HCV活性的增加或降低而鉴定调节物，HCV活性如附着、穿透、包封、释放、复制、翻译或蛋白加工。同没有接触待测化合物的培养系统相比，HCV活性增加或降低确定了待测化合物是调节物。
在相关的方面，本发明还包括调节HCV活性的方法，如附着、穿透、包封、释放、复制、翻译或蛋白加工。通过将含HCV的标本与用上面描述的鉴定方法选择的HCV活性调节物接触实施本方法，HCV活性如附着、穿透、包封、释放、复制、翻译或蛋白加工。
在另一个方面，本发明涉及如上描述所鉴定的调节物。
在另一个方面，本发明包括通过给予如上描述的调节物来诊断、调节或治疗HCV感染的组织或病毒相关的组织纤维化的方法。
在另一个方面，本发明涉及检测HCV活性调节物的试剂盒，HCV活性如附着、穿透、包封、释放、复制、翻译或蛋白加工，该试剂盒含有上面描述的细胞，在另一个实施例中，试剂盒含有使用说明书。
仍在另一个方面，本发明涉及含有如上所述鉴定的调节物的药物组合物和药学可接受的载体。
图表简述
图1流式细胞仪(FACS)显示的HCV包膜蛋白E1和E2的表面表达E1/E2的表面表达在1×107Huh-7细胞共转染后测定(A)，用pEGFP-N1和pCVH77C(wt)转染(左泳道)，用pEGFP-N1、pCVH77C和AR333126(T7-质粒)转染(中泳道)，和pEGFP-N1、终止密码子突变体pSC1和AR 3126转染(右泳道)。FACS分析显示没有未转染和pEGFP-N1转染的细胞，因为它们与缺少AR3126者相似。(B)转染1、2和3周后E1和E2的细胞表面表达。用抗E2抗体标记的未转染和pEGFP-N1转染细胞的流式曲线与抗E1抗体标记者相似，因此没有显示。
图2显示了HCV非结构蛋白表达的细胞内流式细胞仪分析，采用标准的方法和厂商(BD Pharmingen，San Diego，CA)提供的试剂盒进行感染的Huh-7细胞的渗透和染色。抗-NS3、-NS4和-NS5的一抗从Austral Biologicals购买。羊抗鼠PE二抗与图1中用于标记的抗体是一样的。
图3的图表显示用多聚甲醛固定的HCV的蔗糖密度梯度。
发明的详细描述本发明涉及产生丙型肝炎病毒(HCV)的组织培养系统和如此产生的HCV的应用方法。
定义术语″丙型肝炎病毒″和″HCV″是指BB-NANBH主要病原体的病毒种属，其原型分离体在W089/046699；EPO出版物318，216；和美国专利No.5,350,671中得到鉴定，它们的公开物在此引入为参考文献。这里所用的″HCV″包括能够引起丙型肝炎的病原株，和弱化株或从中衍生的有缺陷干扰颗粒。HCV基因组由RNA组成。已知含RNA的病毒具有相对高的自发性突变率，据报道每个整合的核苷酸大约为10-3至10-4(Fields & Knipe，″病毒学基本原理″(1986，Raven Press，N.Y))。由于基因型的异质性和流动性是RNA病毒的固有特征，在HCV种属内会存在多个种株/分离体，其可能是有毒的或无毒的。
如在此所使用的短语″核酸″或″核酸序列″是指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸，或指它们中任一的片段，指基因组或合成来源的DNA或RNA，它们可能是单链的或双链的，并可表现为正义或反义链，指肽核酸(PNA)，或指任何DNA样或RNA样物质，它们是天然或合成来源的。
特定多肽或蛋白的″编码序列″、″编码核苷酸序列″或″编码基因″，是在合适的调控序列控制下被转录和翻译成多肽或蛋白的核酸序列。
如在此所使用的，多核苷酸″来自″指定序列是指，多核苷酸序列由相当于指定核苷酸序列的至少大约6个核苷酸，优选地至少大约8个核苷酸，更优选地至少大约10-12个核苷酸，甚至更优选地至少大约15-20个核苷酸的序列区组成。″相当于″是指与指定序列同源或互补。优选地，多核苷酸来自于与HCV基因组特有序列同源或互补的序列区。序列是否是HCV基因组特有可以通过本领域技术人员已知的技术确定。例如，序列可以与数据库，如基因库中的序列进行比较，以确定它是否存在于未感染的宿主或其它生物体中。序列也可以与其它病毒体的已知序列进行比较，包括那些已知导致肝炎的病毒，如HAV、HBV、HDV，和黄病毒的成员。衍生序列与其它序列的相应性或非相应性也可以通过合适的严格条件下的杂交来确定。确定核酸序列互补性的杂交技术是本领域已知的。又见，例如，Maniatis等人，(1982)。另外，杂交形成的成对多核苷酸的错配可以通过已知的技术确定，包括例如，用特异地消化成对多核苷酸中单链的核酸酶如S1消化。可“衍生”典型DNA序列的区域包括但不限于，例如，编码特异抗原决定簇的区域，以及非转录和/或非翻译区。
衍生的多核苷酸不一定按自然法则地来自所显示的核苷酸序列，而可能以任何方式产生，包括例如化学合成或DNA复制或逆转录或转录。另外，与特意的用途一致，相应于指定序列的区域联合可以用本领域已知的方式被修饰。
相似地，″来自于″或″产生于″指定核酸序列的多肽或氨基酸序列，是指多肽具有的氨基酸序列等同于该序列编码的多肽或其一部分，其中所述的一部分由至少3-5个氨基酸、更优选地至少8-10个氨基酸、甚至更优选地至少11-15个氨基酸组成，或与该序列编码的多肽在免疫学上是相同的。此专门名词也包括指定核酸序列表达的多肽。
重组体或衍生的多肽不一定翻译自指定的核酸序列或HCV基因组；它可以用任何方式产生，包括例如，化学合成，或重组体表达系统的表达，或分离自HCV包括突变的HCV。重组体或衍生的多肽序列中可包括一个或多个氨基酸类似物或非天然氨基酸。在序列中插入氨基酸类似物的方法为本领域已知。还可包括一个或多个标记，这是本领域技术人员已知的。
如在此所使用的术语″重组多核苷酸″是指基因组的多核苷酸，cDNA，是半合成或合成来源的，根据其起源或处理的情况(1)没有连接天然伴随的多核苷酸的全部或一部分，(2)连接于与天然所接多核苷酸不同的多核苷酸，或(3)天然不存在。
如在此所使用的″氨基酸″或″氨基酸序列″是指寡肽、肽、多肽或蛋白序列，或指它们中任一的片段、部分、或亚单位，以及指天然存在的或合成的分子。
如在此所使用的，术语″多肽″、″肽″、″多蛋白″或″蛋白″是指相互通过肽键或修饰的肽键即肽等配物连接在一起的氨基酸，以及可含有修饰的氨基酸而不是20个基因编码的氨基酸。多肽可以通过天然的过程被修饰，如翻译后加工，或通过本领域熟知的化学修饰技术被修饰。修饰可以发生在多肽中的任何部位，包括肽主干、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当理解，相同类型的修饰可以相同或不同程度的出现在特定多肽的数个部位。而且，特定多肽可具有许多类型的修饰。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、血红素部分的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交叉结合环化、二硫键形成、去甲基化、共价交叉结合的形成、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酰胺、甲酰基化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、pergylation、蛋白水解加工、磷酸化、异戊基化、外消旋作用、selenoylation、硫酸化、和转移-RNA介导的氨基酸添加到蛋白如精氨酰基化。(见Creighton，T.E.，蛋白质—结构和分子特性第二版，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；蛋白质的翻译后共价修饰，B.C.Johnson，主编，Academic Press，New York，1-12页(1983))。
如在此所使用的，术语″分离的″是指从其原有环境(如，天然环境，假如它是天然存在的)中移出的物质。例如，存在于活动物中的天然多核苷酸或多肽不是分离的，但在天然系统中从某些或全部共存物质中分离的相同多核苷酸或多肽，就是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分和/或这种多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，它们仍然是分离的，因为这种载体或组合物不是其天然环境中的一部分。
如在此所使用的，术语″重组体″是指核酸与其天然环境中不相邻的″主干″核酸相邻。此外，要″富集的″核酸在核酸主干分子群中表现为5％或以上数量的核酸插入物。根据本发明的主干分子包括核酸如表达载体、自我复制核酸、病毒、整合核酸，以及其它用于维持或处理目的核酸插入物的载体或核酸。典型地，富集的核酸在重组体主干分子群中表现为15％或以上数量的核酸插入物。更典型地，富集的核酸在重组体主干分子群中呈现为50％或以上数量的核酸插入物。在一个实施方式中，富集的核酸在重组体主干分子群中呈现为90％或以上数量的核酸插入物。
″重组体″多肽或蛋白是指通过重组体DNA技术产生的多肽或蛋白；即，从用编码所需多肽或蛋白的外源DNA构建物转化的细胞中产生。″合成的″多肽或蛋白是通过化学合成制备的。固相化学肽合成方法也可以用来合成本发明的多肽或片段。这种方法自从20世纪60年代早期已经为本领域已知(Merrifield，R.B.，J. Am.Chem.Soc.，852149-2154，1963)(又见Stewart，J.M.和Young，J.D.，固相肽合成(Solid Phase Peptide Sythesis)，第二版，Pierce Chemical Co.，Rockford，I11，11-12页))，并新近被用在可商业渠道获得的实验室肽设计和合成试剂盒中(Cambridge Research Biochemicals)。这种可商业渠道获得的实验室试剂盒普遍地应用H.M.Geysen等人的讲授，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，813998(1984)，并供在多“杆”或“插脚”的顶部合成肽，多“杆(rod)”或“插脚(pins)”均与一个单板连接。当使用这种系统时，一板杆或插脚被倒置并插入第二个板的相应孔或池中，后者含有溶液以附着或锚着合适的氨基酸到杆或插脚的顶端上。通过重复这种处理步骤，即，倒置和插入杆和插脚的顶端到合适的溶液中，氨基酸被构建成所需的肽。另外，可以得到许多可获得的FMOC肽合成系统。例如，多肽或片段的组装可以用Applied Biosystems公司的Model 431 A型自动肽合成仪在固体支持物上进行。这种装置提供了获取本发明肽的简便方法，通过直接合成或通过合成一系列可以采用其它已知技术连接的片段。
如在此所使用的″启动子序列″是编码序列5′末端DNA上的一个位点，RNA聚合酶会结合在它上面并启动转录。启动子序列″可操作地连接到″编码序列上，当RNA聚合酶在启动子上启动转录时，会将编码序列转录成mRNA。预想，其它调控元件如增强子也可用在本发明中。
如在此所使用的术语″多核苷酸″是指任何长度的核苷酸的聚合形式，或者是核糖核酸，或者是脱氧核糖核酸。此术语仅指分子的一级结构。因此，此术语包括双和单链的DNA和RNA。还包括已知类型的修饰，例如，本领域已知的标记，甲基化，″加帽″，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰，例如，用无电荷连接(如，甲基磷酸盐类、磷酸三酯类、磷酸胺类、氨基甲酸盐类等)和有电荷连接(如，含硫磷酸盐类、二硫磷酸盐类等)的修饰，含附属部分的修饰如蛋白(包括如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚-L-赖氨酸等)，含插入物的修饰(如吖啶、补骨脂素等)，含螯合剂的修饰(如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)，含烷化剂的修饰，具有修饰连接的修饰(如α异头核酸等)，以及未修饰形式的多核苷酸。
术语″纯化的病毒多核苷酸″是指实质上游离的HCV基因组或其片段，即，含有的与天然病毒多核苷酸相关的多肽不超过大约50％，优选地不超过大约70％，甚至更优选地不超过大约90％。从病毒颗粒中纯化病毒多核苷酸的技术为本领域已知，包括例如，用促溶剂裂解颗粒，微分萃�。屯ü胱咏换徊阄�、亲和层析、和根据密度沉降来分离多核苷酸和多肽。
术语″纯化的病毒多肽″是指实质上游离的HCV多肽或其片段，即，含有的与天然病毒多肽相关的细胞成分不超过大约50％，优选地不超过大约70％，甚至更优选地不超过大约90％。纯化病毒多肽的技术为本领域已知。
如在此所使用的，术语″培养″、″培养的″或″培养中的″是指在制备的培养基中体外生长细胞。如在此所使用的，″培养系统″是包含产生病毒颗粒的细胞的细胞培养。特别地，本发明的培养系统包括产生HCV的培养细胞。
″重组体宿主细胞″、″宿主细胞″、″细胞″、″细胞系″、″细胞培养″，和其它表示以单细胞体培养的微生物或较高级的真核细胞系的这种术语，是指可以或已经被用作重组体载体或其它传递DNA的接受体的细胞，包括已经被转染的原始细胞的后代。可以理解，由于天然的、意外的或有意的突变，单一亲代细胞的后代在形态上、在基因组或总DNA互补码上，可能不一定完全等同于原始亲代。
″复制子″是做为多核苷酸在细胞内复制的自主单位的任何遗传元件，如质粒、染色体、病毒、粘粒等；即，能够在其自身控制下复制。
″载体″是有另一个多核苷酸片段附着其中的复制子，以引起所附着的片段的复制和/或表达。
″控制序列″是指对于影响它们所连接的编码序列的表达是必需的多核苷酸序列。这种控制序列的性质依宿主生物体而不同；在原核生物，这种控制序列一般地包括启动子、核糖体结合位点和终止子；在真核细胞，这种控制序列一般地包括启动子、终止子和在某些情况下的增强子。术语″控制序列″最小限度地是要包括所有对于表达是必要的成分，可能还包括其它成分例如前导序列，它们的存在是有益的。
″开放阅读框″(ORF)是编码多肽的多核苷酸序列区域；此区可表现为部分编码序列或总编码序列。
″编码序列″是在合适的调控序列控制下转录成mRNA和/或翻译成多肽的多核苷酸序列。编码序列的分界通过5′-末端的翻译开始密码子和3′-末端的翻译终止密码子来确定。编码序列可以包括但不限于mRNA、cDNA和重组体多核苷酸序列。
″免疫学可识别成/为″是指具有在指定多肽中也存在的抗原决定簇和多肽，一般是HCV蛋白。免疫学一致性可以通过抗体结合和/或竞争结合来确定；这些技术是本领域一般技术人员已知的。
如在此所使用的，″抗原决定簇″是指多肽的抗原性决定因素。抗原决定簇可能在空间构造中含有3个氨基酸，它对抗原决定簇是特有的。一般地，抗原决定簇含有至少5个这种氨基酸，更通常地，含有至少8-10个这种氨基酸。确定氨基酸空间构造的方法是本领域已知的，包括例如，x-线检晶仪和二维核磁共振。
当多肽与抗体结合时，它与抗体是有″免疫学活性的″，因为抗体识别多肽中含有的特异抗原决定簇。免疫学活性可通过抗体结合试验确定，更特别地通过抗体结合动力学、和/或通过采用竞争剂的结合竞争试验确定，竞争剂是含有抗体定向对抗的抗原决定簇的已知多肽。确定多肽是否与抗体具有免疫学活性的技术为本领域已知。
如在此所使用的，术语″转染″是指细胞在培养中吸收外源DNA。
如在此所使用的，术语″免疫原性多肽″是引起细胞和/或体液免疫反应的多肽，在有或没有佐剂的情况下单独或连接到载体上而引起。
如在此所使用的，″转化″是指外源多核苷酸插入宿主细胞中，不管所用的插入方法，例如，直接吸收、转导、f-交配或电穿孔。外源多核苷酸可以保持为未整合的载体，例如质粒，或可选择地，可以整合进宿主基因组。
如在此所使用的，″处理″是指预防和/或治疗。
如在此所使用的，″个体″是指脊椎动物，特别是哺乳动物种属成员，包括但不限于家养动物、变种动物，和灵长类包括人类。
如在此所使用的，核酸″正义链″含有与mRNA序列同源的序列。″反义链″含有与″正义链″序列互补的序列。
如在此所使用的，病毒的″正链基因组″是单链且编码病毒多肽的基因组，RNA或DNA。正链RNA病毒的实例包括外衣病毒、冠状病毒、逆转录病毒、和杯状病毒科。还包括以前被分类为外衣病毒的黄病毒。见Fields & Knipe(1986)。
如在此所使用的，″纯化的HCV″是指HCV制剂，它已经从通常伴随有病毒的细胞成分中分离，以及从感染组织中存在其它类型病毒中分离。分离病毒的技术是本领域技术人员已知的，包括例如离心和亲和层析。
如在此所使用的，术语″HCV颗粒″包括完整的病毒粒子，以及病毒粒子形成过程中的中间体颗粒。HCV颗粒一般地具有一个或多个与HCV核酸有关的HCV蛋白。
如在此所使用的，术语″探针″是指与靶区域中序列形成杂交结构的多核苷酸，由于探针中的至少一个序列与靶区域中的序列具有互补性。
如在此所使用的，术语″靶区域″是指要扩增和/或要检测的核酸区域。
如在此所使用的，术语″病毒RNA″，包括HCV RNA，是指来自病毒基因组的RNA、其片段、其转录体，以及从它们衍生的突变体序列。
如在此所使用的，″生物标本″是指从个体中分离的组织或液体标本，包括但不限于例如，血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤表面切片、呼吸、消化和泌尿生殖道、泪液、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官，还有体外细胞培养成分的标本(包括但不限于细胞培养基中生长的细胞产生的条件培养基，推定的病毒感染的细胞，重组体细胞，和细胞成分)。
如在此所使用的，“质粒”是一个自我复制的，环状的双链DNA分子。经常，用限制性酶切断质粒，插入外源DNA，并将质粒转移至细胞中。“质粒”的命名是小写的“p”放在前面和/或后面跟着大写字母和/或数字。在此的起始质粒可以是商业渠道获得的，从公共渠道获得而不受限制，或可从获得的质粒根据已发表的步骤构建而成。另外，与在此所描述的质粒相同的质粒在本领域中是已知的，对普通的专业技术人员是显而易见的。
DNA的“消化”是指用仅作用于DNA中特定序列的限制性酶催化切割DNA。在此所使用的多种限制性酶可从商业渠道获得，其使用的反应条件、辅因子和其他必要条件对于普通的专业技术人员是已知的。为了分析，典型地使用1g质粒或DNA片断和大约2单位酶，置于大约20μl缓冲溶液中。为了构建质粒而分离DNA片断，典型地以更大的体积用20至250单位酶消化5至50μg DNA。厂商指定了特定限制性酶的合适缓冲液和底物的量。一般使用的孵育时间为在37℃大约1小时，但可根据供应者的说明书而改变。消化后，可进行凝胶电泳来分离所需的片断。
“寡核苷酸”是指单链多聚脱氧核苷酸或可被化学合成的两个互补多聚脱氧核苷酸链。这样的合成寡核苷酸没有5’磷酸盐，因此不能与另一个寡核苷酸连接，不需在激酶的存在下用ATP添加磷酸盐。合成的寡核苷酸可与没有被脱磷酸化的片断连接。
提到两个核酸或多肽时，术语“实质上相同的”是指两条或以上的序列，当被比较和排列进行最大对应性分析时，它们具有至少60％，70％，80％，在某些情况下90-95％的核苷酸或氨基酸残基的同一性，如采用已知的序列比较算法之一或肉眼观察进行测定。通常，在至少大约100个残基的区域中存在实质上的相同，最普遍的是在至少大约150-200个残基中序列是实质上相同的。在一些实施例中，在编码区域的整个长度中序列是实质上相同的。
另外，“实质上相同的”氨基酸序列是通过一个或多个保守的或非保守的氨基酸取代，删除或插入与参考序列发生差异的序列，特别是当取代发生在非分子活性部位的位点时，并假设该多肽基本上保留了它的功能特性。保守的氨基酸取代，例如一个氨基酸取代同类型的另一个氨基酸(如，一个疏水氨基酸如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或蛋氨酸取代另一个，或一个极性氨基酸取代另一个，如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸或谷酰胺取代天冬酰胺)。
在此所使用的“片段”是至少存在两种不同的构型的天然存在的蛋白的一部分。如天然存在的蛋白一样，片段含有相同的或实质上相同的氨基酸序列。“实质上相同的”的含义是一条氨基酸序列的大部分、但不是完全相同，但保留了与其相关的序列的至少一种功能活性。通常，如果至少大约85％是相同的，两条氨基酸就是“实质上相同的”或“实质上同源的”。具有与天然存在蛋白不同的三维结构的片段也包括在内。这样的一个实例，是“前体-形式”分子，如较低活性的前体蛋白，通过切割的修饰可产生具有明显更高活性的成熟酶。
“杂交”是指一条核酸链与一条互补链通过碱基配对结合在一起的过程。杂交反应是灵敏的和选择性的，这样特殊的目的序列即使在标本中存在很低的浓度也可被鉴定出来。可通过例如，在预杂交和杂交溶液中盐或甲酰胺的浓度，或通过杂交温度来确定合适的严格条件，这些条件在本领域是为人所熟知的。特殊的是，严格性可通过降低盐浓度，增加甲酰胺浓度或提高杂交温度而增加。
例如，在高严格条件下的杂交可在大约37℃至42℃大约50％甲酰胺中进行。杂交也可在大约30℃至35℃，大约35％至25％甲酰胺的严格性降低的条件下进行。特殊的是，杂交可在42℃在50％甲酰胺，5X SSPE，0.3％SDS，和200n/ml切变和变性的鲑鱼精DNA的高严格条件下进行。杂交也可在如上所述的严格性降低的条件下进行，但温度降低为35℃，在35％甲酰胺中。对应于特殊严格性水平的温度范围可进一步通过计算目的核酸的嘌呤和嘧啶比例，相应地调整温度来缩窄。上述的范围和条件的变化在本领域中是为人所熟知的。
术语“变异体”是指本发明在一个或多个碱基对、密码子、内含子、外显子或氨基酸残基上(分别)被修饰的多核苷酸或多肽，仍然保留了NS3的生物学活性。变异体可通过任何所包括的方法来产生，如，滑移(shuffling)、寡核苷酸定向诱变、组装PCR、有性PCR诱变、体内诱变、基因盒诱变、循环整体诱变、指数整体诱变、位点特异诱变和其任何组合。
说明描述了一个短暂的、丙型肝炎病毒(HCV)cDNA为基础的表达系统，能够在细胞培养中合成感染性HCV。该系统支持细胞至细胞的病毒传播。系统的有效性可在实施例中通过HCV的复制缺陷和有复制能力突变体的基因分析而证明。在转染获得的上清液连续三次传代后，从培养基中分离的病毒感染自然Huh-7细胞，并合成病毒编码蛋白和病毒正链和负链RNA。免疫金电镜可发现40-60nm大小HCV颗粒的细胞内(胞浆)合成，以及明显的细胞损害。本研究提供了一种可信赖的系统，不仅可用于病毒基因组的遗传分析，还可以形成新的抗病毒策略。
在一个方面，本发明涉及产生HCV的一种培养系统。细胞培养基从细胞培养中制备。通过用编码HCV的核酸和编码RNA聚合酶的核酸序列在适合转染细胞的条件下转染一种肝细胞而制备细胞培养物，其中在转染后，细胞培养基中含有HCV。在一个实施例中，细胞培养基进一步接触一种未转染的肝细胞，其中HCV从未转染的肝细胞中被分泌出来。这一个步骤可重复多次，以获得感染HCV的多个细胞。在另一个实施例中，未转染的肝细胞与转染细胞共同培养。仍然在另一个实施例中，培养系统进一步包括细胞培养基的分离。仍然在另一个实施例中，培养系统进一步包括用编码NS3和NS5B的核酸序列转染细胞。在一个实施例中，肝细胞是一种肝细胞癌细胞，在另一个实施例中，是人肝细胞癌细胞，如Huh-7。HCV在肝细胞癌细胞如Huh-7中的表达水平高于其他细胞如人子宫颈癌细胞系(HeLa)，见表1中所示。肝细胞癌细胞也可以是，例如HepG2，C3A或PLC。细胞也可能是B细胞。本发明的转染和未转染细胞可以是两种不同的细胞类型。有至少6个HCV基因型和超过50个亚型。在本发明中使用的HCV类型可包括但不限于1a，1b，1c，2a，2b，2c，2i，3a，3b，3c，4a，4b，4c，4d，4e，4f，4g，4h，5a，和6a。在一个实施例中，HCV是1a型HCV。在一个深入的方面，本发明涉及采用这种方法以及共同转染的细胞产生的HCV。
在另一个实施方式中，通过将编码HCV的核酸和编码RNA聚合酶的核酸转染进单个质粒中产生细胞培养物。在一个优选的实施方式中，编码HCV的核酸和编码RNA聚合酶的核酸被转染进两个单独的质粒中。当培养系统进一步包括用编码NS3和NS5B的核酸转染细胞，编码HCV的核酸和编码RNA聚合酶的核酸和编码NS3和NS5B的核酸可被转染进单个质粒中或多个质粒中，最大至三个单独的质粒中。
在本发明的方法中可以使用与RNA聚合酶基因对应的HCV DNA质粒上的任何启动子。在一个实施方式中，启动子是T7启动子，RNA聚合酶是在CMV启动子控制下的T7 RNA聚合酶。任何调节转录的合适的核酸可用作启动子，如PL，tac，trp，trc，T3，T7，β-半乳糖苷酶，lacZ，SP6，SV40，QB或CMV启动子，结合任何相应的编码RNA聚合酶的RNA聚合酶基因。因此，本发明的聚合酶可包括但不限于，与启动子PL，tac，trp，trc，T3，T7，β-半乳糖苷酶，lacZ，SP6，SV40，QB和CMV相关的聚合酶。在一个实施方式中，启动子是SP6，RNA聚合酶是SP6RNA聚合酶。在另一个实施方式中，启动子是QB，RNA聚合酶是QBRNA聚合酶。
本发明的T7 RNA聚合酶存在于细胞浆中，将在T7启动子的驱动下转录HCV cDNA，产生HCV RNA。病毒RNA然后被翻译产生病毒结构(核心，E1，E2和p7)和非结构(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B)蛋白。然后发生了由依赖RNA的RNA聚合酶(NS5B)引导的病毒RNA复制。当后代病毒粒被制备并被分泌至培养基中时，这些病毒颗粒可感染其他的细胞，引起病毒的传播。监测病毒蛋白合成的方法在实施例中进行举例，包括但不限于荧光激活的细胞分类(FACS)和免疫金电镜。
在转染后立即进行FACS分析可能能检测出最初由HCV质粒转染的细胞表面上表达的E1/E2。但被从转染的细胞中释放的刚制备的病毒感染的邻近细胞也应该引起这些邻近的细胞表面上的E1/E2表达。因此，E1/E2阳性细胞的数量应该随着感染后的时间而增加。
使用第四代病毒制剂感染的Huh-7细胞，用人抗E1和抗E2抗体(细胞内染色)和一个与10nm金颗粒连接的二抗(抗人IgG)染色细胞，通过免疫金电镜可在体外显示合成的HCV 1a型颗粒，表明病毒颗粒是在感染细胞中被合成的。
在从用HCV转染的细胞中收获的上清液(培养基)中检测HCV正链和负链RNA可通过RT-PCR进行。在用GFP；GFP和HCV；GFP，HCV和T7聚合酶(最上面的泳道)转染的细胞中进行比较。HCV负链合成可见于HCV正链T7聚合酶感染细胞中收获的上清液的感染作用中。负链的测定显示了病毒RNA的复制。定量RT-PCR对HCV正链和负链RNA合成的检测结果显示在病毒感染的细胞中每个细胞有400个拷贝的正链和45个拷贝的负链被合成。
本发明的另一个方面涉及在培养系统中测定HCV感染的肝细胞感染水平的一种方法，如上所述，通过测定培养系统中细胞的细胞表面上表达的HCV特异蛋白的含量。HCV由以下蛋白构成C，E1，E2，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B。在培养系统中细胞的细胞表面上表达的HCV特异蛋白可以是E1，E2，NS5A或NS3蛋白。
本发明的另一个方面涉及鉴定HCV活性如附着，穿透，包封，释放，复制，翻译或蛋白加工的调节物的一种方法。可以通过将待测化合物与上述的培养系统接触，并检测HCV活性，如附着，穿透，包封，释放，复制，翻译或蛋白加工的增加或减少，来鉴定调节物。同不与待测化合物接触的培养系统相比，HCV活性的增加或减少可鉴定待测化合物为一种调节物。如果检测到减少，调节物是HCV附着，穿透，包封，释放，复制，翻译或蛋白加工的抑制剂。如果检测到增加，调节物是HCV附着，穿透，包封，释放，复制，翻译或蛋白加工的激动剂。在一个实施方式中，这些活性可通过检测培养系统中被HCV感染的细胞表面上HCV特异蛋白的表达而测定。这样的蛋白包括E1，E2，NS5A或NS2蛋白。在一个实施方式中，调节物是一种蛋白。在另一个实施方式中，调节物是一种核酸分子。仍然在另一个实施方式中，调节物是一种肽，拟肽或其他小分子。
在一个相关的方面，本发明也包括了调节HCV活性如附着，穿透，包封，释放，复制，翻译或蛋白加工的一种方法。该法的实施可通过将一个含有HCV的标本与HCV活性的调节物接触，所述的活性如附着，穿透，包封，释放，复制，翻译或蛋白加工，可采用上述的鉴定方法来选择。在一个实施方式中，调节物是一种蛋白。在另一个实施方式中，调节物是一种核酸分子。仍然在另一个实施方式中，调节物是一种肽，拟肽或其他小分子。这样的一个标本包括含有HCV的任何液体。
仍然在另一个方面，本发明涉及含有如上所述鉴定的一种调节物的药物组合物和一种药学上适合的载体。在一个实施方式中，调节物是一种蛋白。在另一个实施方式中，调节物是一种核酸分子。仍然在另一个实施方式中，调节物是一种肽，拟肽或其他小分子。
另外，本发明包括了通过应用如上所述的一种调节物诊断、调控或治疗HCV感染组织或与病毒有关的组织纤维化的一种方法。在一个实施方式中，调节物是一种蛋白。在另一个实施方式中，调节物是一种核酸分子。仍然在另一个实施方式中，调节物是一种肽，拟肽或其他小分子。
在另一个方面，本发明涉及检测HCV活性的一种试剂盒，所述活性如附着，穿透，包封，释放，复制，翻译或蛋白加工，所述试剂盒含有上述细胞。在一个优选的实施方式中，该试剂盒含有实施检测的说明书，该说明书可被打印在包装内的添加物，包装或试剂盒内的标签上。印刷品也可置于试剂盒的容器上，在检测容器上指示了样品的标记和试剂的体积。准确的说明书可根据被检测的物质和/或所使用的检测方法而变化，但应包括以下的一种或多种说明稀释试剂盒成分和/或样品制剂的说明，指导每个测定中所使用物质的体积或浓度，指导对反应物的标记，指导获取各成分测定值，优选的温度条件和添加成分和混合的时间，校准测定结果所使用的标准。
下面的实施例的目的是说明而不是限制本发明。
实施例实施例1在组织培养系统中体外合成感染性丙型肝炎病毒已经开发了一种可靠的基于cDNA的组织培养测定法来合成感染性丙型肝炎病毒(HCV)。
在特定的条件下将已克隆的wt HCV(1a)cDNA转染进人肝细胞性癌(Huh-7)细胞可引起细胞表面表达病毒糖蛋白E1和E2。病毒结构和非结构性(NS5A和NS3)蛋白的表达增加至转染3周。从细胞培养物中分离的上清液(培养基)当与新鲜的Huh-7细胞混合时是有感染性的。培养上清液的感染性可抵抗脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的处理。在四代后病毒的效价明显增加，用传代的病毒感染的细胞显示有病毒蛋白和病毒正义和反义链RNA的合成。从突变的HCV cDNA克隆转染的Huh-7细胞中不能收获感染性病毒。有效阻断HCV-IRES介导的翻译的两个抑制剂可抑制感染性病毒的合成。密度梯度离心和最初的电镜显示在这个系统中可制备完整的病毒颗粒。
实施例2丙型肝炎病毒在Huh-7细胞中的复制细胞培养人肝细胞癌Huh-7细胞在含有10％胎牛血清，青霉素，链霉素和L-谷氨酰胺的1640 RPMI中培养。
质粒DNA试剂丙型肝炎病毒(HCV)的cDNA克�。琾CV-H77C，是由NIH的Drs.Jens Bukh和Robert Purcell，Bethesda，MD惠赠的。在此构建物中HCV基因组的转录是细菌噬菌体、启动子引导的。质粒DNAs是AR3126和AR3132，它含有T7RNA依赖的RNA聚合酶基因和真核转录起始和终止信号，是由Dr.F.William Studier，Brookhaven National Laboratory，Upton，NY惠赠的。编码renilla reniformis绿荧光蛋白的EGFP-N1质粒DNA是从Promega Biotec，Madison，WI购买的。
Huh-7细胞的转染采用BIGCO.BRL Life Technologies的Superfect试剂用合适的质粒DNA进行转染。包含在T-75组织培养皿中的10×106个细胞用含有15微克的每种质粒DNA的Superfect进行处理。
从上清液中获取病毒，并处理Huh-7细胞在规定的时间周期从转染的细胞获取上清液，并储存在-70℃。这些获取的上清液用来处理Huh-7细胞，用上清液中含有的HCV颗粒进行感染。
流式细胞仪检测HCV包膜的表达转染或上清液处理的Huh-7细胞用抗E1或抗E2抗体，采用与以前Koka等人所述相似的步骤进行染色。与PE交联的羊抗鼠IgG1抗体用来标记一抗。在Becton-Dickinson FACSCAN上进行流式细胞仪分析。
RNA的分离和HCV RNA的RT-PCR根据厂商提供的方法用Qiagen试剂盒分离RNA。分离的RNA使用20个单体的正向和反向引物扩增，在HCV正义链RNA的5’末端产生530bp DNA片段，在病毒反义链的3’末端产生480bp的片段。
细胞内流式细胞仪检测HCV非结构蛋白一步细胞渗透和抗体染色试剂盒购自BD-Pharmingen，并根据厂商提供的方法使用。
实施例3转染为了开发一种基于cDNA的HCV组织培养系统，感染性的1a型HCV cDNA(pCV-H77C(M.Yanagi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，8738(1997).))在T7启动子的控制下，与SV-40启动子控制下的T7 RNA聚合酶基因(AR 3126(B.M.Benton，W.K.Eng，J.J.Dunn，F.W.Studier，R.Stemglanz，P.A.Fisher.Molecular Cell Biol，10，353(1990).)共转染。后一个构建物缺乏核定位信号。
Huh-7细胞(1×107)用质粒DNA在T-75组织培养皿中60-70％汇合程度下转染/共转染。在一些实验中，转染是在6孔培养板中进行的(每孔3×106个细胞和每种质粒2μg)。10μg每种质粒加入至0.45毫升无血清RPMI，并与180μl Quiagen的superfect转染试剂混合。混合物在室温下孵育10分钟，然后加入3毫升含有10％胎牛血清的RPMI。混合物然后被铺于Huh-7细胞上，并在37℃孵育6小时。细胞培养基常规换液直至收获细胞用适当的抗体标记或进行RNA分离。
实施例4病毒蛋白合成假设T7 RNA聚合酶在细胞浆中形成，它应该能在T7启动子的控制下转录HCV cDNA，产生大量的HCV RNA。然后病毒RNA被翻译，产生病毒结构(核心，E1，E2和p7)和非结构(NS2，NS3，NS4A和B，NS5A和B)蛋白。推测此时就发生了由RNA依赖的RNA聚合酶(NS5B)引导的病毒RNA复制。如果形成了后代病毒粒，并分泌至组织培养基中，这些新形成的病毒颗粒能感染邻近的细胞，引起病毒的细胞至细胞传播。
病毒蛋白合成通过荧光激活的细胞分选仪(FACS)测定细胞表面上病毒包膜蛋白E1和E2的表达来监测。HCV E1和E2的细胞表面表达通过流式细胞仪根据以前所述的方法进行测定(P.Koka，B.D，Jamieson，D.G.Brooks，J.A.Zack J.Virol.73，9089(1999)。抗E1和抗E2抗体(LotNo.C569617)购自Austral Biologicals，San Ramon，CA。同型抗体(人IgG)用作对照。抗体效价的范围可稀释至1∶400以消除对照细胞的背景染色。用藻红蛋白(PE)标记的鼠抗E1/E2抗体用作二抗，在4℃孵育30分钟，在标记抗体前后，细胞团用PBS冲洗，在3000rpm离心3分钟。
在转染后的FACS分析可检测到最初用pCVH77C和AR3126质粒转染的细胞表面上有E1/E2的表达，用从转染细胞中释放的新制备的病毒感染的邻近细胞表面上也有E1/E2的表达。因此，在转染后可期望E1/E2阳性细胞的数目随时间而增加。25％的Huh-7细胞在与pCVH77C和AR3126质粒共转染后10天成为E1/E2阳性，相比之下使用对照抗体的阳性细胞为1％(图1A)。从转染作用中去除T7质粒可明显减少E1/E2的表面表达(3-4％)。E1/E2表达依赖于病毒蛋白的合成，通过突变H77C质粒的无功能而证实，其中终止密码子被引入ORF中诱导E1/E2的表达(图1A)。细胞与编码已知HCV IRES抑制剂(称为IRNA或抑制剂RNA；S.Das等人，J.Virol.725638(1998)。)的质粒共转染可完全地阻断E1/E2的表面表达。所有转染反应都含有检测转染效率的编码绿荧光蛋白(EGFP)的对照质粒。在共转染后E1/E2表面表达的时间进程显示E1/E2阳性细胞从第1周的8-12％逐渐增加至第2周的25-34％，最后在第3周为34-46％(图1B)。E1和E2表达之间的差异是由于在测定中使用的抗原特异抗体的敏感性不同。IFN-α和γ仅能微弱的抑制E1/E2的表达。这是可以预料的，因为1a型病毒对IFN的作用有很强的抵抗力。
实施例5体外蛋白合成为了确定感染性后代病毒是否排至培养基中，在用脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的混合物或单独使用缓冲液消化后，从被H77C和AR3126质粒共转染的细胞中分离细胞培养基。当用缓冲液处理的培养上清液感染的细胞显示在89％的细胞表面上有E2表达时，而在用脱氧核糖核酸酶/核糖核酸酶处理的上清液感染后82％的细胞是E2阳性的。对照实验显示在用于核酸酶消化的条件下对照DNA和RNA样品完全被降解。这些结果显示脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶抗性病毒颗粒被转染细胞排出。
在上清液感染的细胞中的病毒复制可通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，使用检测正义和反义链RNA的引物来检测。在用这些上清液感染Huh-7细胞感染前，每种病毒滴度为1500-4000拷贝/毫升的上清液(5毫升)用1μl无Danes胰Raze(Roche)和5μl RQ1无核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶(Promega)在37℃处理15分钟，足以完全消化10μg DNA或RNA。作为标准品，来自pCVH77C克隆的体外转录的正义和反义链RNA通过用Xbal或Ndel分别切割质粒而产生。采用寡核苷酸引物对进行RT-PCR分析，检测560碱基对(bp)的正义链RNA5’末端和产生430bp扩增产物的反义链RNA5’末端。正义链的互补引物5′-CCTTACCCAAATTGCGCGAC-3′(SEQ ID NO1.)用来进行RT反应。然后样品用核糖核酸酶如上进行处理。560bp的产物用5′-AGC TAGGCC GAG AGC CAC GG-3′(SEQ ED NO2)和5′-TGT CGT GCA GCCTCC AGG AC-3′(SEQ ID NO3)引物对进行扩增。在用反义链的互补对5′-AGAGAGGCCAGTATCAGCAC-3′(SEQ ID NO6)进行RT和核糖核酸酶消化后，430bp的产物用最初的引物对5′-GCT TCT GTC CAGAGG AGG CA-3′(SEQ ID NO4)和5′-GTC ATG CGG CTC ACG GACCT-3′(SEQ ID NO5)进行扩增。PCR扩增进行40循环，每个循环在94℃变性，60℃杂交，和72℃延伸1分钟。β-肌动蛋白RNA用作内参照，使用Promega Corp.，Madison，WI的引物对产生一个285bp的扩增产物。使用26个单体的正向引物5′-OH-TCA TGA AGT GTG ACGFTG ACA TCC GT-3′(SEQ ID NO7)和26个单体的反向引物5′-OH-CCT AGA AGC ATT TGC GGT GCA CGA TG-3′(SEQ IDNO8)。这个反应体系被孵育扩增，根据厂商的以下规定进行94℃ 2分钟，40循环(94℃-30秒变性，65℃-1分钟杂交，和68℃-2分钟延伸)。
从pCVH77C和pEGFP-N1或pCVH77C，pEGFP-N1和AR3126感染的细胞中收获细胞培养基(5ml，大约每百万1500个拷贝)用脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶如实施例5中所述进行处理，然后用来感染新鲜的Huh-7细胞。8天后，分离总细胞RNA，并进行定量RT-PCR分析检测560bp正义和430bp反义PCR产物。从线性化的pCVH77C转录的体外转录正义和反义链RNA采用相同组引物进行扩增。在从pCVH77C转染细胞中收获的上清液感染的细胞中，仅检测到560 bp长HCV(+)链PCR产物。但，560bp长正义和430bp长负义链PCR产物均可在pCVH77C和AR3126共转染细胞的培养基感染的细胞中检测到，这个发现与在RNA复制过程中所发现的负义链RNA的产生是一致的。在从pCVH77C和AR3126共转染细胞中收获的培养基中未检测到负义链PCR产物。这些结果显示pCVH77C和AR3126质粒转染的细胞中收获的上清液含有能够感染培养的正常Huh-7细胞的病毒颗粒。这些结果也显示了在用pCVH77C质粒单独转染的细胞中产生了小量的病毒颗粒。但当新鲜细胞用这种制剂感染时，尽管检测到输入的正义链RNA，并未观察到活动性的复制，这种复制可通过反义链RNA合成测定。当质粒通过电穿孔而不是脂质体被引入细胞中时，可以获得相似的结果，如果不是相同的话。
实施例6在突变构建体中的病毒复制在本实施例中使用以前显示在猿中是非感染性的(M.Yanagi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，2291(1999).)，或在基于复制子的测定中RNA复制缺陷(V.Lohman等人，Science 285.110(1999)；K.J.Blight，A.A.Kolykholv，C.M.Rice.Science 290，1972(2000)。)的突变构建物。以前发现在猿中三个(1a型)3′UTR X-区删除突变体(-98X，X-52，-42X)是非感染性的，而在猿中可变区删除突变体(V-24)是感染性的，可诱导疾病(M.Yanagi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，2291(1999).)。NS5B突变体已经显示在基于复制子的测定中RNA复制是完全缺陷的，该突变体中GDD基序在1b型背景中改变为AAG(V.Lohman等人，Science285，110(1999)；K.J.Blight，A.A.Kolykholv，C.M.Rice.Science 290，1972(2000).)。所有5种突变体构建物显示在DNA构建物的最初转染过程中，E1表面表达的水平是相似的，表明在转染细胞中T7 RNA聚合酶转录后合成了病毒蛋白。在wt和突变体质粒的最初转染后HCVE1的细胞表面表达如下pCVH77C，(35％)；GDD突变体(22％)；-98x(29％)；-42x(39％)；X-52(30％)和VR-24(38％)。
wt和突变体pCVH77C转染细胞中收获的上清液感染的细胞总RNA进行RT-PCR分析。用wt pCVH77C，NS5B GDD突变体(GDD AAG)，3′-UTR X区缺失突变体-98X，-42X和X-52以及变异区缺失突变体VR-24(M.Yanagi等人，Proc，Natl.Acad.Sci.USA 96，2291(1999)。)转染Huh-7细胞。所有的转染反应均包括质粒AR3126。从转染细胞中收获的组织培养基(5毫升)用来感染新鲜的Huh-7细胞8天。从感染细胞中收获的总RNA在如上所述的560bp(+)和430bp(-)链RNA存在下通过RT-PCR进行分析。用来检测病毒(-)链的RNA较用来检测(+)链的RNA大约多10倍以上。当新鲜的细胞用从wt和突变体DNA转染细胞中收获的组织培养基感染时，在用wt和VR-24转染来源的培养基感染细胞表面上可检测到E1/E2的表达。98X，X-52，-42X和GDD突变体显示E1/E2仅有背景水平的表达。总细胞RNA的RT-PCR分析显示来自wt和VR-24感染细胞的病毒(+)和(-)链特异的PCR产物，而不是正义和反义链RNA可在用-98X，-42X，X-52和GDD突变体感染的细胞中检测到。通过PCR分析发现在这些RNA标本中很明显没有病毒DNA的污染。在从感染细胞中分离的总DNA中也没有发现有病毒DNA被整合的证据。
实施例7消除污染为了排除脱氧核糖核酸酶/核糖核酸酶处理的培养上清液可能被病毒cDNA或RNA污染的可能性，推测含有感染性HCV颗粒的培养上清液在Hch-7细胞中连续传代3次。仅分泌至培养液中的病毒颗粒在每次传代的过程中用来感染细胞，从最终一代中获取的培养基，效价大约为3-5×104RNA拷贝/毫升，被用来在0，3，7和10天感染Huh-7细胞。
从用传代病毒感染的细胞中获取的总细胞RNA进行RT-PCR。在实施例5中所示的实验中获取的脱氧核糖核酸酶/核糖核酸酶-处理的组织培养基在Huh-7细胞中传代3次。最后一代的培养上清液(5毫升)，效价大约为每毫升40,000基因组当量，用来感染1×107Huh-7细胞。用传代病毒在0，3，7，10和20天感染的Huh-7细胞中分离的总RNA用来通过RT-PCR监测病毒正义和负义链RNA，分别从大约106和107细胞中分离的RNA用来检测(+)和(-)RNA。在感染3天后检测病毒(+)和(-)链RNA，RNA合成逐渐增加至20天。采用从已知量的体外转录正义和负义链RNA扩增的DNA通过产生线性标准曲线来定量RT-PCR数据。对于β-肌动蛋白的定量，如所指示的那样，通过从已知数量细胞中提取的RNA的RT-PCR产生扩增DNA。对于这些结果，每个细胞中正义和反义链RNA的分子数目估计分别为350和25。定量RT-PCR显示了在给定时间每个细胞中(+)与(-)RNA的比例大约为15∶1。初步的结果表明放线菌素D抗性病毒RNA在传代病毒感染的细胞中被合成。
在一个平行的实验中，同样的病毒标本用来感染Huh-7细胞7和14天，用HCV非结构蛋白的特异抗体进行细胞内染色。流式细胞仪分析显示在大约70％的培养细胞中存在NS3，NS4和NS5，意味着接近70％的细胞被传代病毒感染(图2)。通过从用1b型HCV质粒转染的细胞中成功的产生和传代感染性HCV就已经证实了这些结果。
实施例8；感染性病毒颗粒的观察为确定是否感染性病毒颗粒可通过电镜来显示，未感染和病毒感染的细胞单层(10天)用与金颗粒(10nm)交联的可识别抗E1和抗E2抗体的羊抗鼠抗体染色。细胞生长在6孔板(Coster)的0.45μm Transwell膜上，并如图1所述用来自初始对照(仅有转染试剂)或质粒DNA(AR3126+pCVH77C)转染细胞的连续传代上清液进行感染。感染后10天，细胞在含有3％多聚甲醛和1％戊二醛的PBS中4℃过夜进行固定。然后固定的细胞用PBS冲洗，用含20％正常羊血清(NGS)的PBS孵育以阻断。然后细胞如图1所述用鼠抗E1/E2一抗(或同型对照)进行染色，但在2％NGS的存在下4℃过夜。细胞用PBS冲洗，用由与羊抗鼠抗体(Ted Pella，Inc.，Redding，CA)交联的10nm金颗粒组成的二抗在2％NGS存在下孵育过夜。然后细胞用含1％四氧化锇的PBS后固定，用乙醇脱水，在环氧树脂中包埋。制备大约70nm厚的切片，用醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色，用透射电镜在JEOL-100CX电镜(JEOLLtd.，Tokyo，Japan)下进行观测。
单层薄切片的电镜照片显示与未感染的细胞相比感染细胞有明显的损害，包括核和其他细胞器的损害。发现大小在40-60nm的金颗粒集簇在膜结构内和周围。在未感染的细胞中未观测到金颗粒。在更高的放大倍数下金颗粒集簇的更仔细分析显示了与病毒颗粒装配的不同时期一致的图像。可观测到一些病毒颗粒处于芽殖的过程中，从该过程中出现了ER或恢复的ER/Golgi膜结构，而其他似乎已经释放至细胞浆中。病毒包被在一些颗粒上可清晰可见。来自传代病毒密度梯度分析的最初结果发现与通过EM观测到的病毒的近似大小是一致的。
要注意的是在此所使用的1a型H77C含有侧向HCV序列的5’和3’末端的两个T7启动子。因此，RNA的正义和反义链可能在最初用pCVH77C和AR3126转染的细胞中产生。仅用含5’和3’启动子的质粒转染的细胞可分泌感染性病毒颗粒；从pCVH77C中删除3’T7启动子可使其成为非感染性的，尽管在这些细胞中合成了很大量的(+)RNA。可以相信(+)和(-)RNA均存在对感染性病毒的产生是非常重要的，因为一种或多种病毒蛋白的大量合成由于具有毒性或产生细胞损害，因而对病毒的复制是不利的(M.M.C.Lai，C.F.Ware.Curr.Topics in Microand Immunology.242117-134(2000)；D.Moradpour，P.Kary，C.M.Rice，H.E.Blum.Hepatology 281920201.(1998).)。与这种观点一致的是最近的一个发现，即用pCVH77C转染的细胞，其中仅(+)链RNA被合成，不能产生感染性病毒(D.Moradpour，P.Kary，C.M.Rice，H.E.Blum.Hepatology 281920201.(1998).)。反义链RNA可减少蛋白合成，因此在更长的时间内合成了小量的蛋白，因此加速了病毒的复制和新病毒向培养基中的释放。可以选择的是，体外产生的dsRNA可触发IFN-通路，利于HCV缓慢和持续的生长。
表1
在Huh-7与HeLa细胞中HCV E1和E2的细胞表面表达。在FACS分析前单独用HCV和T7聚合酶转染细胞5天。结果显示人肝细胞但不是HeLa细胞可支持E1和E2的表达。
表2
在用脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的混合物处理之前(未处理)和之后，用HCV cDNA和T7 RNA聚合酶基因转染的细胞中获取的培养基用来感染新鲜的Huh-7细胞。结果显示用无细胞培养基对新鲜细胞的感染是由于包封的病毒，而不是污染了HCV DNA或RNA。
尽管本发明已经根据上述实施例被描述，可以理解的是任何修改和变化都包括在本发明的精神和范围之内。相应地，本发明仅受以下权利要求的限制。
权利要求
1.一种产生丙型肝炎病毒(HCV)的培养系统，包括从细胞培养物中制备细胞培养基，通过用编码HCV的核酸序列和编码RNA聚合酶的核酸序列在适合转染细胞的条件下转染肝细胞产生该细胞培养物，其中转染后的细胞培养基中含有HCV。
2.根据权利要求1所述的培养系统，它进一步包括将细胞培养基与未转染的肝细胞接触，其中所述的接触后，HCV从未转染的肝细胞中分泌。
3.根据权利要求2所述的培养系统，其中所述的未转染的肝细胞与转染的细胞共培养。
4.根据权利要求1或2所述的培养系统，它进一步包括分离细胞培养基。
5.根据权利要求1所述的培养系统，其中编码HCV的核酸序列和编码RNA聚合酶的核酸序列是在单个质粒中。
6.根据权利要求1所述的培养系统，其中编码HCV的核酸序列包含在第一个质粒中，编码RNA聚合酶的核酸序列在第二个质粒中。
7.根据权利要求1所述的培养系统，它进一步包括用编码NS3和NS5B的核酸序列转染肝细胞。
8.根据权利要求7所述的培养系统，其中编码HCV的核酸序列、编码RNA聚合酶的核酸序列、和编码NS3和NS5B的核酸序列是在单个质粒中。
9.根据权利要求7所述的培养系统，其中编码HCV的核酸序列、编码RNA聚合酶的核酸序列、和编码NS3和NS5B的核酸序列包含在不止一个质粒中。
10.根据权利要求1或2所述的培养系统，其中所述的肝细胞来自人组织。
11.根据权利要求10所述的培养系统，其中所述的肝细胞是肝细胞癌细胞。
12 根据权利要求11所述的培养系统，其中所述的细胞是Huh-7，HepG2，C3A或PLC。
13.根据权利要求1所述的培养系统，其中所述的HCV是1a型HCV或1b型HCV。
14.根据权利要求1所述的培养系统，其中所述的RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。
15.根据权利要求1所述的培养系统，其中编码HCV的核酸序列包括启动子，其中所述的启动子是由RNA聚合酶激活的。
16.根据权利要求15所述的培养系统，其中所述的启动子是T7、SP6或QB。
17.一种检测根据权利要求1所述的培养系统中用HCV感染的肝细胞的传染性水平的方法，包括检测培养系统中细胞表面上表达的HCV特异蛋白的量。
18.根据权利要求17中的方法，其中所述的HCV特异蛋白是核心蛋白、E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A或NS5B。
19.一种鉴定HCV附着、穿透、包封、释放、复制、翻译或蛋白加工的调节物的方法，包括a)将待测化合物与权利要求1的培养系统接触；和b)检测HCV附着、穿透、包封、释放、复制、翻译或蛋白加工的增加或减少，与没有接触化合物的培养系统相比，其中所述的增加或减少鉴定待测化合物为调节物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中检测为减少时，则调节物是HCV附着、穿透、包封、释放、复制、翻译或蛋白加工的抑制剂。
21.根据权利要求19所述的方法，其中检测为增加时，则调节物是HCV附着、穿透、包封、释放、复制、翻译或蛋白加工的激动剂。
22.根据权利要求19所述的方法，其中检测HCV附着、穿透、包封、释放、复制、翻译或蛋白加工的增加或减少是通过检测培养系统中细胞表面上HCV特异蛋白的表达水平而实现的。
23.根据权利要求20所述的方法，其中HCV特异蛋白是核心蛋白、E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A或NS5B。
24.通过根据权利要求19所述的方法鉴定的调节物。
25.一种调节HCV附着、穿透、包封、释放、复制、翻译或蛋白加工的方法包括，将含HCV的标本与权利要求24所述的调节物接触。
26.一种含有转染的肝细胞的试剂盒，该肝细胞被权利要求1所述的培养系统的HCV感染。
27.一种含有通过根据权利要求19所述的方法鉴定的调节物和药学可接受的载体的药物组合物。
28.根据权利要求27中的药物组合物，其中所述的调节物是蛋白质。
29.根据权利要求27中的药物组合物，其中所述的调节物是核酸分子。
30.根据权利要求27中的药物组合物，其中所述的调节物是肽、拟肽或其它小分子。
31.一种诊断、调节或处置HCV感染的组织或病毒相关的组织纤维化的方法，包括给予通过权利要求19所述的方法鉴定的调节物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述的调节物是蛋白质。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述的调节物是核酸分子。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述的调节物是肽、拟肽或其它小分子。
35.一种产生丙型肝炎病毒(HCV)的方法包括从细胞培养物中制备细胞培养基，通过用编码HCV的核酸序列和编码RNA聚合酶的核酸序列在适合转染细胞的条件下转染肝细胞产生细胞培养物，其中转染后的细胞培养基中含有HCV。
36.根据权利要求35所述的方法，它进一步包括将细胞培养基与未转染的肝细胞接触，其中在接触后，HCV从未转染的肝细胞中分泌。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述的未转染的肝细胞与转染的细胞共同培养。
38.根据权利要求35或36所述的方法，它进一步包括分离细胞培养基。
39.根据权利要求35所述的方法，其中编码HCV的核酸序列和编码RNA聚合酶的核酸序列是在单个质粒中。
40.根据权利要求35所述的方法，其中编码HCV的核酸序列包含在第一个质粒中，编码RNA聚合酶的核酸序列在第二个质粒中。
41.根据权利要求35所述的方法，它进一步包括用编码NS3和NS5B的核酸序列转染的肝细胞。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述的编码HCV的核酸序列、编码RNA聚合酶的核酸序列、和编码NS3和NS5B的核酸序列在一个质粒中。
43.根据权利要求41所述的方法，其中编码HCV的核酸序列、编码RNA聚合酶的核酸序列、和编码NS3和NS5B的核酸序列包含在不止一个质粒中。
44.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述的肝细胞来自人组织。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述的肝细胞是肝细胞癌细胞。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述的细胞是Huh-7，HepG2，C3A或PLC。
47.根据权利要求35所述的方法，其中所述的HCV是1a型HCV或1b型HCV。
48.根据权利要求35所述的方法，其中所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。
49.根据权利要求35所述的方法，其中编码HCV的核酸序列包括启动子，其中的启动子是由RNA聚合酶激活的。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述的启动子是T7，SP6或QB。
全文摘要
本发明涉及能够在细胞培养中合成感染性丙型肝炎病毒(HCV)并能够细胞至细胞传播病毒的HCV cDNA基培养系统。本发明还涉及在肝细胞中测定HCV感染水平的一种方法。本发明还提出了一种鉴定HCV活性调节物的方法，以及调节HCV活性的方法。本发明提供了对病毒基因组进行遗传分析和形成新的抗病毒策略的可靠系统。
文档编号G01N33/576GK1592794SQ02806237
公开日2005年3月9日 申请日期2002年3月11日 优先权日2001年3月9日
发明者A·达斯古普塔, P·S·科卡 申请人:加利福尼亚大学董事会
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