专利名称：微阵列用基底、微阵列制法及从微阵列获得光数据的方法
技术领域：
本发明的一个或多个实施方式涉及用于微阵列的基底、使用其制造微阵列的方法 以及从微阵列获得光数据的方法。
背景技术：
微阵列通常由与靶物质结合并固定在基底上的多个确定区域(清楚区域， distinct region)中的探针材料组成。微阵列用在各种靶物质分析中。通过将含有荧光物 质标记的靶物质的样品与微阵列的探针材料接触并测量由探针材料与荧光物质标记的靶 物质产生的反应产物发射的光信号来分析靶物质。通常，由于微阵列包括其中可能固定许多不同类型的探针材料的高密度的独立区 域(在下文中也称为“样点”)，因此在单一的实验中照射和检测数千个或数万个或更多的 样点以确定样品是否含有可与探针材料结合的靶物质。因而，对由微阵列分析结果所获得 的图像数据进行分析的操纵器在评价各杂交样点的亮度之前产生微阵列样点位置的网格 或图案，并且在将从微阵列获得的图像信号量化之前产生局部背景。换言之，在对所述分析 结果进行分析之前，操纵器产生网格以更容易地进行分析。微阵列网格是用在检测软件中 用于更有效地寻找图案中各样点的位置的模板。因而，需要使用从包括许多样点的微阵列 获得的光数据有效地鉴别各样点的位置。鉴别样点位置的常规方法包括使用已知的样点信息手动鉴别光图像上的样点的 方法以及使用自动点样设备(spot placement equipment)的方法。然而，即使有了上述方法，也仍然需要开发使用从微阵列获得的光数据容易地寻 找各样点的位置的分析方法。
发明内容
本发明的一个或多个实施方式包括用于制造从其容易地获得光数据的微阵列的 基底以及制造该基底的方法。本发明的一个或多个实施方式包括从其容易地获得光数据的微阵列。本发明的一个或多个实施方式包括从微阵列获得光数据的方法。在一个实施方式中，用于产生微阵列的基底，所述基底包括设置于所述基底上的 第一基准标记(fiducial mark)、以及在所述基底上的探针固定区域，其中所述第一基准标 记的表面是疏水的并且探针固定化合物固定于所述探针固定区域上。在一个实施方式中，所述第一基准标记包括所述基底的从其除去氧化物层的区 域。在一个实施方式中，所述基底的从其除去氧化物层的区域包括所述基底的表面和 覆盖有疏水材料的所述基底的表面之一。在一个实施方式中，所述基底进一步包括第二基准标记。在一个实施方式中，所述第二基准标记包括形成于所述基底表面上的至少两个柱子。在一个实施方式中，所述第二基准标记包括固定在所述基底表面上的与靶物质强 烈地相互作用的材料。微阵列的实施方式包括设置于基底上的第一基准标记和所述基底的其上固定探 针材料的区域，其中所述第一基准标记的表面是疏水的。在一个实施方式中，所述第一基准标记包括所述基底的从其除去氧化物层的区 域。在一个实施方式中，所述基底的从其除去氧化物层的区域包括所述基底的表面和覆盖有疏水材料的所述基底的表面之一。在一个实施方式中，所述微阵列进一步包括第二基准标记。在一个实施方式中，所述第二基准标记包括形成于所述基底表面上的至少两个柱子。在一个实施方式中，所述第二基准标记包括与靶物质强烈地相互作用并固定在所 述基底的表面上的材料。在一个实施方式中，所述至少两个柱子的相邻柱子隔开约0. Ιμπι 约ΙΟΟΟμπι的 间隔，和各柱子的横截面的尺寸为约0. Iym 约ΙΟΟΟμπι。制造用于微阵列的基底的方法的实施方式包括提供其上形成氧化物层的基底， 其中所述基底具有疏水表面；在所述氧化物层上涂覆光刻胶以形成光刻胶层；通过掩模将 光照射到所述光刻胶层上；将所述光刻胶层显影和蚀刻所述氧化物层的未被所述光刻胶层 保护的一部分以使所述基底的表面暴露；以及将探针固定化合物固定在所述基底的不包括 所述疏水表面的一部分上。在一个实施方式中，所述蚀刻包括使用疏水材料的干法蚀刻过程。制造探针微阵列的方法的实施方式包括提供其上设置氧化物层的基底，其中所 述基底具有疏水表面；在所述氧化物层上涂覆光刻胶以形成光刻胶层；通过掩模将光照射 到所述光刻胶层上；将所述光刻胶层显影和蚀刻所述氧化物层的未被所述光刻胶层保护的 一部分以使所述基底的表面暴露；将探针固定化合物固定在所述基底的不包括所述疏水表 面的一部分上；和将探针材料固定在所述基底的其上固定所述探针固定化合物的部分上的 多个确定区域上。在一个实施方式中，制造用于微阵列的基底的方法包括提供其上设置氧化物层 的基底；在所述氧化物层上涂覆光刻胶以形成光刻胶层；通过掩模将光照射到所述光刻胶 层上；将所述光刻胶层显影和蚀刻所述氧化物层的未被所述光刻胶层保护的一部分以使所 述基底的表面暴露，其中所述蚀刻包括使用疏水材料的干法蚀刻过程；以及将探针固定化 合物固定在所述基底的不包括疏水表面的一部分上。在一个实施方式中，所述疏水材料包括碳氟化合物。制造探针微阵列的方法的实施方式包括提供其上设置氧化物层的基底；在所述 氧化物层上涂覆光刻胶以形成光刻胶层；通过掩模将光照射到所述光刻胶层上；将所述光 刻胶层显影和蚀刻所述氧化物层的未被所述光刻胶层保护的一部分以使所述基底的表面 暴露，其中所述蚀刻包括使用疏水材料的干法蚀刻过程；将探针固定化合物固定在所述基 底的不包括疏水表面的一部分上；以及将探针材料固定在所述基底的其上固定所述探针固定化合物的部分上的多个确定区域上。在一个实施方式中，从包括第一基准标记、第二基准标记和其中固定探针材料的区域的微阵列获得光数据的方法，该方法包括使标记有发光物质的靶物质与所述微阵列 接触，其中所述第一基准标记具有疏水表面；将光照射到所述微阵列上；测量由于照射光 从所述微阵列产生的光以产生光数据；由所述光数据鉴别所述第一基准标记和所述第二基 准标记；参考所鉴别的第一和第二基准标记鉴别其中固定探针材料的区域；以及从所鉴别 的其中固定探针材料的区域获得光数据。在一个实施方式中，在鉴别所述第一基准标记和所述第二基准标记中，通过参考 所述第一基准标记的光强度与所述第一标记周围的区域相比有多低的程度来鉴别所述第
一基准标记O在一个实施方式中，在鉴别所述第一基准标记和所述第二基准标记中，通过参考 所述第二基准标记的光强度与所述第二基准标记周围的区域相比有多高来鉴别所述第二 基准标记。在一个实施方式中，在鉴别所述第一基准标记和所述第二基准标记中，通过参考 所述第一基准标记的光强度与所述第一标记周围的区域相比有多低来鉴别所述第一基准 标记，和通过参考所述第二基准标记的光强度与所述第二基准标记周围的区域相比有多高 来鉴别所述第二基准标记，以及通过所述第一和第二基准标记彼此的相对位置来鉴别所述 第一基准标记和所述第二基准标记。在一个实施方式中，所述第二基准标记包括形成于基底表面上的至少两个柱子。在一个实施方式中，所述第二基准标记包括固定在所述基底表面上的与所述靶物 质强烈地相互作用的材料。微阵列的实施方式包括设置于基底上的第一确定区域；设置于所述基底上的第 二确定区域；以及设置于所述基底上的第三确定区域，其中探针核酸固定于所述第三确定 区域上，所述探针核酸具有与靶核酸的序列互补的序列，所述第一确定区域与标记有能检 测的标记的靶核酸或标记有能检测的标记的靶物质之间的结合力弱于所述第二确定区域 与所述标记有能检测的标记的靶物质之间的结合力，以及所述第二确定区域与所述标记有 能检测的标记的靶物质之间的结合力等于或强于所述第三确定区域中的所述探针核酸与 所述标记有能检测的标记的靶物质之间的结合力。在一个实施方式中，当所述第一确定区域和所述第二确定区域与所述标记有能检 测的标记的靶核酸或所述标记有能检测的标记的靶物质反应时，从所述第二确定区域获得 的检测信号强于从所述第一确定区域获得的检测信号。在一个实施方式中，当所述检测信号包括荧光信号时，从所述第二确定区域获得 的荧光信号强于从所述第一确定区域获得的荧光信号。在一个实施方式中，布置所述第一确定区域与所述第二确定区域的组合，使得当 与所述标记有能检测的标记的靶核酸和所述标记有能检测的标记的靶物质反应时，将从所 述第一确定区域和所述第二确定区域获得的检测信号与从所述第三确定区域获得的检测 信号辨别出来。在一个实施方式中，所述第一确定区域与所述第二确定区域的组合具有使得在进 行相同的反应时，从所述第三确定区域获得的检测信号对于偶然具有相同的排列具有低的可能性的布置。在一个实施方式中，所述第一确定区域和所述第二确定区域的组合具有文字数字 的(alphanumeric)形状。在一个实施方式中，所述微阵列包括多个面板(panel)，以及所述第一确定区域、所述第二确定区域和所述第三确定区域的多个组合布置在所述微阵列的所述多个面板的 各个中。在一个实施方式中，所述微阵列的所述面板各自是四边形的，以及所述第一确定区域、所述第二确定区域和所述第三确定区域的所述组合布置在所述各面板的分别的四个 角中。在一个实施方式中，所述第一确定区域包括疏水材料，以及所述标记有能检测的 标记的靶核酸和所述标记有能检测的标记的靶物质包括亲水材料。在一个实施方式中，所述第二确定区域固定有与所述标记有能检测的标记的靶物 质结合的物质。在一个实施方式中，所述第二确定区域具有与所述标记有能检测的标记的靶物质 结合的表面特性。在一个实施方式中，所述第二确定区域固定有生物素，以及所述标记有能检测的 标记的靶物质包括标记有能检测的标记的链霉抗生物素蛋白。在一个实施方式中，所述第二确定区域固定有比固定在所述第三确定区域表面上 的探针核酸长的核酸，以及所述标记有能检测的标记的靶物质包括与所述探针核酸互补的 核酸。分析微阵列信号的方法的实施方式，其中所述微阵列包括设置于基底上的第一确 定区域、设置于基底上的第二确定区域、和设置于基底上的第三确定区域，其中探针核酸固 定于所述第三确定区域上，所述探针核酸具有与靶核酸的序列互补的序列，所述第一确定 区域与标记有能检测的标记的靶核酸或标记有能检测的标记的靶物质之间的结合力弱于 所述第二确定区域与所述标记有能检测的标记的靶物质之间的结合力，以及所述第二确定 区域与所述标记有能检测的标记的靶物质之间的结合力等于或强于所述第三确定区域中 的所述探针核酸与所述标记有能检测的标记的靶物质之间的结合力，所述方法包括从通 过使所述微阵列与包括所述标记有能检测的标记的靶核酸和所述标记有能检测的标记的 靶物质的至少一种的样品反应所产生的反应产物获得信号；以及通过参考从所述第一确定 区域和所述第二确定区域获得的信号辨别从所述第三确定区域获得的信号。制造微阵列的方法的实施方式包括提供基底；在所述基底上设置氧化物层；将 所述氧化物层图案化以形成至少两个柱子；和在所述至少两个柱子上设置探针固定化合 物，其中在所述至少两个柱子之间的区域起到第一基准标记的作用，以及所述柱子和探针 固定化合物起到具有与所述第一基准标记不同的光反射特性的第二基准标记的作用。
从结合附图考虑的实施方式的以下描述，这些和/或其它方面将变得明晰和更易理解，在附图中图IA C是说明制造用于微阵列的基底的方法的实施方式的一系列横截面图，其中所述基底包括第一基准标记和其中将固定探针材料的区域；图2和图3是说明用于微阵列的基底和/或微阵列的至少一个实施方式的图；图4A C是说明具有包括至少一个柱子的结构的亮的基准标记A的实例和制造 其的方法的实施方式的图；图5A是说明其中柱子结构构成亮的基准标记的机理的图；图5B是图5A中所示的柱子结构的顶部平面图；图6A和6B显示同样的结构的示意性图像，其中图6B是反射光图像和图6A是荧 光图像；图7显示微阵列分析图像的实例；图8显示其中通过参考图7中所示图像中的基准标记精确地布置基准标记和数据 样点的网格化实施方式；图9显示其中通过参考图7中所示图像中的基准标记非精确地布置基准标记和数 据样点的网格化实施方式；和图IOA E显示微阵列的面板的图像，其中所述面板包括暗的基准标记和亮的基 准标记的多个组合并且所述组合具有不同的形状；其中用圆圈标出的四个角分别被放大成 示于图IOB E中的四个正方形图像。
具体实施例方式现在详细介绍实施方式，其实例图解于附图中。在这点上，本实施方式可具有不同 的形式并且不应解释为限于本文中所阐述的说明内容。相反，提供这些实施方式，使得该公 开内容彻底且完整，并将本公开内容的范围全面地传达给本领域技术人员。因此，通过参照 附图，仅在下面描述实施方式，以解释本说明内容的各方面。应理解，当一元件被称为“在”另一元件“上”时，该元件可直接在所述另一元件上， 或者在其间可存在中间元件。相反，当一元件被称为“直接在”另一元件“上”时，则不存在 中间元件。本文中所使用的术语“和/或”包括一个或多个关联的列举项的任何和全部组
I=I O应理解，尽管术语第一、第二、第三等可在本文中用来描述各种元件、组分、区域、 层和/或部分，但这些元件、组分、区域、层和/或部分不应被这些术语所限制。这些术语仅 用来使一个元件、组分、区域、层或部分区别于另一元件、组分、区域、层或部分。因此，在不 背离本发明的教导的情况下，可将以下讨论的第一元件、组分、区域、层或部分称为第二元 件、组分、区域、层或部分。本文中所使用的术语仅仅是为了描述具体实施方式
而并非意图限制本发明。除非 上下文清楚地另作说明，本文中所使用的单数形式“一种”、“一个”和“该”也意图包括复数 形式。还应理解，当用在本说明书中时，术语“包含”或“包括”表示存在所述特征、区域、整 体、步骤、操作、元件和/或组分，但不排除存在或添加一种或多种其它的特征、区域、整体、 步骤、操作、元件、组分和/或其集合。此外，在本文中可使用相对术语诸如“下部”或“底部”以及“上部”或“顶部”来 描述如图中所示的一个元件与另外的元件的关系。应理解，除图中所示的方位之外，相对术 语还意图包括器件的不同方位。例如，如果附图之一中的器件翻转，则被描述为在其它元件“下”侧的元件将定向在所述其它元件的“上”侧。因此，取决于图的具体方位，示例性术语“下部”可包括“下部”和“上部”两种方位。类似地，如果附图之一中的器件翻转，则被描述 为“在”其它元件“下面”或“之下”的元件将定向在所述其它元件“上面”。因此，示例性术 语“在......下面”或“在......之下”可包括在......上面和在......下面两种方位。除非另外定义，在本文中所使用的所有术语(包括技术和科学术语)的含义与本 发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。还应理解，术语，例如在常用字典中定 义的那些，应被解释为其含义与它们在相关领域的背景中和本公开内容的环境中的含义一 致，并且将不对所述术语作理想化或过于形式的解释，除非在本文中清楚地如此定义。在本文中参照作为本发明的理想化实施方式的示意图的横截面图描述实施方式。 照此，将预计到由于例如制造技术和/或公差而引起的所述图的形状变化。因而，实施方式 不应解释为限于本文中所图示的区域的具体形状，而是包括由例如制造所造成的形状上的 偏差。例如，图示或描述为平坦的区域通常可具有粗糙的和/或非线性的特征。此外，所图 示的尖锐的角可为圆形的。因而，图中所示的区域在本质上是示意性的，并且它们的形状不 意示区域的精确形状，并且不意图限制本公开内容的范围。本文中描述的所有方法均可以合适的顺序进行，除非本文中另有说明或与上下文 明显矛盾。任何和所有实施例、或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅用来更好地说明本 公开内容，而不是对本公开内容的范围加以限制，除非另有说明。说明书中的语言都不应被 解释为是在将任何非要求保护的要素指明为对于本文中所使用的实施方式的实践是必需 的。在下文中，参照附图详细描述本发明。实施方式提供用于微阵列的基底。所述基底包括第一基准标记和其中将固定探针 材料的区域，其中第一基准标记具有疏水表面，和探针固定化合物固定于其中将固定探针 材料的区域的表面上。所述基底的实施方式可由选自如下的材料形成玻璃、石英、硅、塑料和其它具有 类似特性的材料。实施方式还包括其中可在所述基底上自然或人工形成氧化物层的配置。 自然形成的氧化物层的实例为形成于硅基底上的二氧化硅膜。可使用已知的方法在基底上 形成氧化物层。例如，在一个实施方式中，可通过液相沉积、蒸发、溅射或其它类似的已知方 法在基底上沉积氧化物，形成氧化物层。使用第一基准标记鉴别在用于微阵列的基底的光图像分布图(lightimage profile)中的其中固定探针材料的区域。具体而言，当分析固定在基底中的探针材料和与 所述探针材料结合的靶物质之间的相互作用的结果时，使用所述基准标记来利用光学信号 鉴别所述区域。当用光照射时，第一基准标记发射与其中固定探针的区域和/或背景区域 即其中仅固定探针固定化合物的区域相比具有低强度或相当低强度的荧光。这样的发光特 性可通过降低第一基准标记的表面与标记有荧光物质的靶物质之间的反应性来获得。第一 基准标记可具有任何形状和任何结构；换言之，所述基准标记不限于特定的形状或结构。例 如，在一个实施方式中，第一基准标记可具有文字或符号形状。从顶部平面图观察到的第一 基准标记形状的尺寸可具有与其中固定探针的区域相同的尺寸或不同的尺寸。如本领域普通技术人员会知晓的，其中固定探针的区域也称为“样点”。从顶部平 面图观察到的第一基准标记形状的尺寸可为约0. Ιμπι 约100 μ m，例如，所述基准标记的宽度和/或长度可为约0. 1 μ m 约100 μ m。在另一实施方式中，在从顶部平面图观察第一基准标记形状时，第一基准标记是圆形的并且其直径可为约0. ιμπι 约100 μ m。另外，在 替换的实施方式中，所述尺寸可指由穿过从顶部平面图观察到的第一基准标记形状的重量 中心的线与所述第一基准标记形状的边界线所形成的最短线段。在一个实施方式中，第一基准标记可为通过从基底除去氧化物层而形成的区域。 在一个实施方式中，所述区域可为从其除去氧化物层的基底自身的表面、或者覆盖有疏水 材料的表面。在一个实施方式中，所述疏水材料可得自干法蚀刻材料诸如碳氟化合物。在 一个实施方式中，所述碳氟化合物可为四氟甲烷。在这点上，可使用公知的利用材料的等离 子体反应的干法蚀刻过程蚀刻基底的表面。所述基底可具有其上固定探针固定化合物的表面。在一个实施方式中，所述表面 可为排除第一基准标记的表面的整个表面、或者其上将固定探针的表面。探针固定化合物 的实施方式可包括选自以下的至少一种化合物生物素，抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋 白，聚L-赖氨酸，以及具有氨基、醛基、硫醇基、羰基、琥珀酰亚胺基团、马来酰亚胺基团、环 氧基团、异硫氰酸酯基团的化合物，以及其它具有类似特性的物质。包含氨基的化合物的实 例包括3-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(“EDA”)、 三甲氧基甲硅烷基丙基二亚乙基三胺C‘DETA”)、3-(2-氨基乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷、 以及3-氨基丙基三乙氧基硅烷。包含醛基的化合物的实例包括戊二醛。包含硫醇基的化合 物的实例包括4(3)-巯基丙基三甲氧基硅烷(“MPTS”)。包含环氧基团的化合物的实例包 括3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷。包含异硫氰酸酯基团的化合物的实例包括4-亚苯 基二异硫氰酸酯(“PDITC”)。包含琥珀酰亚胺和马来酰亚胺基团的化合物的实例包括二 琥珀酰亚胺基碳酸酯(“DSC”)和琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺苯基)丁酸酯(“SMPB”)。术语“微阵列”可指其中可与靶物质结合的特定物质例如探针材料固定在基底的 确定区域中的装置。通常，至少两个确定区域(也称为样点)彼此一起布置在基底上。探 针材料可为生物分子物质，例如，DNA、RNA、cDNA、mRNA、蛋白质、糖或其它类似物质。除了第一基准标记之外，用于微阵列的基底还可进一步包括第二基准标记。在一 个实施方式中，第二基准标记可定位在第一基准标记附近。在一个实施方式中，可通过将基 底表面图案化来限定第二基准标记。在一个实施方式中，可使用已知的方法来进行所述图 案化。例如，所述图案化方法的实施方式可包括光刻法。作为图案化的结果，基底在第二基 准标记附近的部分通过蚀刻而除去，并由此第二基准标记可具有柱子结构，如将参照附图 在下面更详细地描述的。所述柱子结构的水平横截面可为例如圆形或四边形，包括长方形 和正方形形状，但是所述柱子结构的形状不限于此。可使所述柱子结构的边缘倾斜，使得从 其倾斜边缘反射照射光。即，可设置所述边缘使得其不垂直于基底或所述柱子的水平面。在 另一实施方式中，可使所述边缘成圆形。通过柱子边缘的形状提供对照射光进行反射的反 射表面。然而，上述这种形状不应解释为将实施方式限制为具体的机理。实施方式包括其 中所述蚀刻可为湿法蚀刻或干法蚀刻的配置。在一个实施方式中，第二基准标记可由至少两个柱子组成。相邻柱子之间的距离可小于微阵列的像素的直径。本文中所使用的像素是指由反射光获得的微阵列的图像 分布图或者由探针材料与靶物质之间的相互作用获得的荧光强度的图像分布图上的像素。 在一个实施方式中，各柱子的横截面尺寸可为约0. 001 μ m 约10 μ m,和相邻柱子可隔开Ο.ΟΟΙμπι 约ΙΟμπι的间隔。第二基准标记可包括布置在边界中的柱子，所述边界具有与 其中将固定探针材料的样点的形状相同的从顶部平面图观察的形状。实施方式包括其中由 从第二基准标记反射的光所获得的第二基准标记的反射图像可与在探针材料与靶物质彼 此相互作用之后从探针样点获得的荧光图像基本上相同或不同的配置。可以可检测探针材料与靶物质之间的相互作用的任何角度照射光。在一个实施方 式中，照射光可以约0° 约45°的角度进入基底的表面。照射光可为光诸如任何波长的 光，或者更具体而言，照射光可为对应于荧光物质的特定激发波长的激发光。在一个实施方 式中，可以相对于基底表面约45° 约135°的角度测量光。用于微阵列的基底可进一步包括用于确定参考系的对准标记，在该参考系中可确 定微阵列上其它元件的位置。术语“对准标记”是指容许用于微阵列的基底相对于探针材 料固定装置定位在相同位置的标记。对准标记确保用于微阵列的基底相对于探针材料固定 装置定位在相同的位置。因而，固定在基底上的探针样点的位置例如其坐标值可用作客观 的参比值。可相对于通过对准标记确定的基底的特定位置提供探针样点的坐标。例如，可 用通过参考对准标记，水平轴与垂直轴相交的坐标鉴别样点的位置。第一基准标记、第二基 准标记和其中固定探针材料的样点可在通过基准标记确定的坐标参考系中相对于彼此的 预定位置处形成。在一个实施方式中，对准标记可为通过光刻法形成的图案。例如，在一个实施方式 中，对准标记可为在基底上的十字形符号或T形文字的图案。根据另一实施方式，微阵列包括第一基准标记和其中固定探针材料的区域，其中 第一基准标记具有疏水表面。在一个实施方式中，可通过将探针材料固定在用于微阵列的基底上的多个确定区 域中制造微阵列。在一个实施方式中，所述区域各自可具有约0. 1 μ m 约1000 μ m的尺寸， 和相邻区域之间的距离可为约0. Ιμπι 约1000 μ m。在一个实施方式中，所述区域的密度 可为例如1000个区域/cm2的数量级、IO4个区域/cm2的数量级、IO5个区域/cm2的数量级、 或者IO6个区域/cm2或更大的数量级。在本实施方式中，第一基准标记与在上面对于先前的实施方式所描述的基本上相 同。基底的实施方式可由选自如下的材料形成玻璃、石英、硅、塑料和其它具有类似 特性的材料。在一个实施方式中，可在基底上形成自然或人工形成的氧化物层。在一个实施方式中，第一基准标记可为通过从基底除去氧化物层形成的区域。在 一个实施方式中，所述区域可为从其除去氧化物层的基底自身的表面、或者覆盖有疏水材 料的表面。在一个实施方式中，所述疏水材料可得自干法蚀刻材料诸如碳氟化合物。在一 个实施方式中，所述碳氟化合物可为四氟甲烷。除了第一基准标记之外，微阵列还可进一步包括第二基准标记。在一个实施方式 中，第二基准标记可定位在第一基准标记附近。在暴露于激发光时，第二基准标记可基本上 发射明亮的光。本文中使用的术语“明亮的光”意指明亮到足以在考虑关于第二基准标记 的已知信息的情况下将第二基准标记与其它区域区分开的光。例如，在一个实施方式中，第 二基准标记可具有等于或高于其中固定探针材料的区域的亮度。第二基准标记可包括至少一个柱子。在其中第二基准标记包括两个或更多个柱子的实施方式中，相邻柱子之间的间隔可为约0.001 μ m 约100 μ m。在一个实施方式 中，相邻柱子之间的间隔可为约0. 001 μ m 约0. 01 μ m。在另一实施方式中，相邻柱子之 间的间隔可为约0. 001 μ m 约0. 1 μ m。在另一实施方式中，相邻柱子之间的间隔可为约 0. 001 μ m 约1 μ m。在另一实施方式中，相邻柱子之间的间隔可为约0. 001 μ m 约10 μ m。 所述柱子各自的横截面的尺寸的实施方式可为约0. 001 μ m 约100 μ m。在一个实施方式 中，各柱子的横截面的尺寸可为约0. 001 μ m 约0.01 μ m。在一个实施方式中，各柱子的横 截面的尺寸可为约0. 001 μ m 约0. 1 μ m。在一个实施方式中，各柱子的横截面的尺寸可为 约0. 001 μ m 约1 μ m。在一个实施方式中，各柱子的横截面的尺寸可为约0. 001 μ m 约 IOum0在一个实施方式中，所述至少一个柱子可通过蚀刻基底上的氧化物层而形成。根据其它的实施方式，如在下面更详细地描述的，制造用于微阵列的基底的方法 包括提供其上形成氧化物层的基底，其中该基底具有疏水表面；在氧化物层上涂覆光刻 胶以形成光刻胶层；使用掩模将光照射到光刻胶层上；通过将光刻胶层显影和蚀刻氧化物 层的未被光刻胶层保护的一部分而使基底的表面暴露；以及将探针固定化合物固定在基底 的不包括疏水表面的一部分上。所述方法包括提供其上形成氧化物层的基底。氧化物层的实施方式可包括自然形 成的氧化物层诸如在硅基底暴露于大气时自然形成的硅氧化物膜。替换的实施方式包括其 中可通过在基底上沉积氧化物层而形成氧化物层的配置。在后面的替换的实施方式中，可 通过在基底例如硅基底上沉积氧化物诸如硅氧化物而形成氧化物层。可利用已知的方法进 行所述沉积。例如，在一个实施方式中，可通过液相沉积、蒸发、溅射或其它类似方法在基底 上沉积氧化物，形成氧化物层。氧化物层可具有使得从基底反射的光与从氧化物层反射的 光发生相长干涉的厚度。在一个实施方式中，氧化物层可由SiO2形成。然而，可用能够导 致相长干涉的任何有机或无机材料膜代替氧化物层。例如，在一个实施方式中，可用氮化硅 代替氧化物层。所述方法还包括在氧化物层上涂覆光刻胶以形成光刻胶层。可使用已知方法进行 所述涂覆。例如，在一个实施方式中，所述涂覆可为旋涂、沉积涂覆、或另外的类似涂覆方 法。在一个实施方式中，可通过加热使光刻胶层硬化。光刻胶的类型不受涂覆方法和硬化 条件的限制。例如，实施方式包括其中光刻胶可为正型光刻胶或负型光刻胶的配置。所述方法还包括使用掩模将光照射到光刻胶层上。可使用根据光刻胶是正型光刻 胶还是负型光刻胶而改变的方法制备掩模使得以如上所述的所需形状和在第一基准标记、 第二基准标记和/或样点之间的所需间隔形成第一基准标记。接着，使用掩模将基底选择 性地曝光。光照射条件可根据所使用的光刻胶的材料和类型而改变。实施方式包括其中 除了具有用于形成第一基准标记的图案之外，掩模还可具有用于形成对准标记的图案的配 置，所述对准标记容许用于微阵列的基底相对于探针材料固定装置例如布置器(arrayer) 或定位器(spotter)定位在恒定的位置以在其上更精确地固定探针材料。因而，掩�？晌� 具有对准标记的图案的掩模。可使用与用于形成第一基准标记的图案化方法相同的图案化 方法，例如，通过光刻法，形成对准标记。在一个实施方式中，对准标记和第一基准标记可同 时形成。所述方法还包括通过将光刻胶层显影和蚀刻氧化物层的未被光刻胶层保护的一 部分而使基底表面暴露。
光刻胶层的显影可包括用显影溶液处理经照射的光刻胶层。在一些实施方式中，可对经处理的光刻胶层进一步清洗。可根据所使用的光刻胶的类型和材料来选择显影溶 液。在显影步骤之后，蚀刻氧化物层的未被光刻胶层保护的部分并且由此形成第一基准标 记。可使用已知的方法进行所述蚀刻。例如，在一个实施方式中，所述蚀刻可为使用疏水材 料的干法蚀刻过程。在一个实施方式中，该疏水材料可为碳氟化合物。在一个实施方式中， 该碳氟化合物可为氟代烷诸如四氟甲烷。在一个实施方式中，该氟代烷可为C1-C20氟代 烷。作为所述蚀刻的结果，在基底中形成凹进部分，并且所述凹进部分的底部和/或壁可具 有与基底的表面相同的性质，尤其是疏水性质。另外，在其中通过使用疏水材料的干法蚀刻 进行所述蚀刻的实施方式中，由于疏水材料的沉积，所述凹进部分的底部和/或壁可具有 疏水性质。可使用已知的方法除去光刻胶层。例如，在一个实施方式中，可使用用于溶解光 刻胶的有机溶剂例如丙酮除去光刻胶层。具有疏水表面的基底可由选自硅、塑料和其它类似材料的材料形成。所述塑料可 选自聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯(“PTFE”)以及其它具有类似特性的材料。所述方法还包括将探针固定化合物固定在基底的不包括疏水表面的部分上。探针 固定化合物与探针材料相互作用以固定探针材料。探针固定化合物的实施方式可包括例如 选自如下的至少一种化合物生物素，抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白，聚L-赖氨酸，以 及具有氨基、醛基、硫醇基、羰基、琥珀酰亚胺基团、马来酰亚胺基团、环氧基团、异硫氰酸酯 基团的化合物或者其它具有类似特性的物质。具有氨基的化合物的实施方式可为3-氨基 三乙氧基硅烷(“GAPS”)。在其中探针固定化合物为例如生物素的实施方式中，可通过例 如使生物素琥珀酰亚胺基酯与经氨基硅烷处理的氧化物层反应来固定所述生物素。在其中 探针固定化合物为包含醛基的戊二醛的实施方式中，可通过例如使戊二醛与经氨基硅烷处 理的氧化物层反应来固定所述包含醛基的戊二醛。由于基底的疏水表面具有低的反应性或 不具有反应性，因此在探针固定化合物施加到基底上并与基底反应时，探针固定化合物固 定在基底的不包括疏水表面的部分上。随后可使用清洗溶液除去施加到疏水表面上的探针 固定化合物。将探针材料固定在基底上施加探针固定化合物的各种区域的至少一个确定区域 上以由此形成微阵列。根据另一实施方式，制造探针微阵列的方法包括提供其上形成氧化物层的基底， 其中该基底具有疏水表面；在氧化物层上涂覆光刻胶以形成光刻胶层；使用掩模将光照射 到光刻胶层上；通过将光刻胶层显影和蚀刻氧化物层的未被所述光刻胶层保护的一部分而 使基底的表面暴露；将探针固定化合物固定在基底的不包括所述疏水表面的一部分上；和 将探针材料固定在基底的其上固定探针固定化合物的部分上的多个确定区域上。根据本实施方式的方法包括将探针材料固定在基底的其上固定探针固定化合物 的部分上的多个确定区域上。可将探针材料活化以通过与探针固定化合物结合或反应而将 其固定。例如，在其中探针固定化合物为抗生物素蛋白的实施方式中，可用生物素将探针材 料活化。另外，在其中探针固定化合物具有氨基诸如氨基硅烷的实施方式中，探针材料可 具有与琥珀酰亚胺基团和马来酰亚胺基团的酯键，并且所述酯键与所述氨基结合，由此将 探针材料固定。该方法中包括的其它操作与在上面对于先前的实施方式所描述的基本上相 同。
根据另一实施方式，制造用于微阵列的基底的方法包括提供其上形成氧化物层的基底；在氧化物层上涂覆光刻胶以形成光刻胶层；使用掩模将光照射到光刻胶层上；通过将光刻胶层显影和蚀刻氧化物层的未被光刻胶层保护的一部分而使基底的表面暴露，其中所述蚀刻为使用疏水材料的干法蚀刻过程；以及将探针固定化合物固定在基底的不包括疏水表面的一部分上。根据本实施方式的方法包括通过将光刻胶层显影和蚀刻氧化物层的未被光刻胶层保护的一部分而使基底的表面暴露，其中所述蚀刻为使用疏水材料的干法蚀刻过程。光刻胶层的显影可包括用显影溶液处理经照射的光刻胶层。在一些实施方式中，可对经处理的光刻胶层进一步清洗。可根据所使用的光刻胶选择显影溶液。在显影步骤之后，蚀刻氧化物层的未被光刻胶层保护的部分并由此形成第一基准标记。实施方式包括其中可使用已知的方法进行所述蚀刻的配置。例如，在一个实施方式中，所述蚀刻可为使用疏水材料的干法蚀刻过程。在一个实施方式中，该疏水材料可为碳氟化合物。在一个实施方式中，该碳氟化合物可为氟代烷诸如四氟甲烷。在一个实施方式中，该氟代烷可为C1-C20氟代烷。作为所述蚀刻的结果，在基底上形成凹进部分，并且所述凹进部分的底部和/或壁可具有与基底表面类似的性质，尤其是疏水性质。另外，如果所述蚀刻包括使用疏水材料的干法蚀刻，则由于疏水材料的沉积，所述凹进部分的底部和/或壁可具有疏水性质。在一个实施方式中，可使用已知的方法除去光刻胶层。例如，在一个实施方式中，可使用用于溶解光刻胶的有机溶剂例如丙酮除去光刻胶层。基底的实施方式可由选自如下的材料形成玻璃、石英、硅、塑料和其它具有类似特性的材料。所述塑料的实施方式可选自聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、以及聚四氟乙烯(“PTFE”)。在一个实施方式中，基底可由硅形成和氧化物层可由基底上的SiO2形成。所述方法中包括的其它操作与上面描述的相同。根据另一实施方式，制造探针微阵列的方法包括提供其上形成氧化物层的基底；在氧化物层上涂覆光刻胶以形成光刻胶层；使用掩模将光照射到光刻胶层上；通过将光刻胶层显影和蚀刻氧化物层的未被光刻胶层保护的一部分而使基底的表面暴露，其中所述蚀刻为使用疏水材料的干法蚀刻；将探针固定化合物固定在基底的不包括疏水表面的一部分上；以及将探针材料固定在基底的其上固定探针固定化合物的部分上的多个确定区域上。根据本实施方式的制造探针微阵列的方法包括将探针材料固定在基底的其上固定探针固定化合物的部分上的多个确定区域上。探针材料可为被活化以通过与探针固定化合物结合或反应而被固定的探针材料。例如，在其中探针固定化合物为抗生物素蛋白的实施方式中，探针材料可为用生物素活化的探针材料。另外，如果探针固定化合物具有氨基诸如氨基硅烷，则探针材料可具有与琥珀酰亚胺基团和马来酰亚胺基团的酯键，并且所述酯键与所述氨基结合，由此将探针材料固定。该方法中包括的其它操作与在上面对于先前的实施方式所描述的基本上相同。根据另一实施方式，从包括第一基准标记和其中固定探针材料的区域的微阵列获得光数据的方法包括使标记有发光物质的靶物质与微阵列接触，其中第一基准标记具有疏水表面；将光照射到微阵列上以测量从微阵列产生的光；由所获得的光数据鉴别第一基准标记；参考所鉴别的第一基准标记鉴别其中固定探针材料的区域；和从所鉴别的其中固定探针材料的区域获得光数据。
除了第一基准标记之外，微阵列还可进一步包括如上面详细描述的第二基准标 记。第二基准标记可定位在第一基准标记附近。当受光照射时，第二基准标记可发射明亮 的光。在本文中，“明亮的光”意指该光明亮到足以在给定的关于第二基准标记的已知信息 下将第二基准标记与其它区域区分开。例如，在一个实施方式中，第二基准标记可具有等于 或高于其中固定探针材料的区域的亮度的亮度。第二基准标记可由至少一个柱子组成。在其中第二基准标记包括至少两个柱子的 实施方式中，相邻柱子之间的间隔可为约0. 001 μ m 约10 μ m,和所述柱子各自的横截面 的尺寸可为约0. 001 μ m 约10 μ m。所述柱子各自可具有以容许照射到其上的光被反射的 形状形成的边缘。例如，在一个实施方式中，所述边缘可相对于其上形成所述柱子的基底倾 斜或成圆形。所述边缘的形状可在蚀刻所述柱子时自然形成。通常，在蚀刻基底时，由于例 如扩散，蚀刻的基底的边缘的形状可倾斜，不与基底垂直。所述倾斜边缘可用作反射表面。微阵列可为根据以上描述内容的微阵列的实施方式的任一个。根据本实施方式的从微阵列获得光数据的方法包括使标记有发光物质的靶物质 与微阵列接触，其中微阵列包括第一基准标记和其中固定探针材料的区域并且第一基准标 记具有疏水表面。
可在根据靶物质和探针材料的类型适当控制的条件下进行所述接触。例如，关于 DNA探针与靶DNA的杂交，将荧光标记的靶DNA与杂交缓冲液混合，然后对该混合物进行热 处理以使该靶DNA热变性，然后将所得溶液加到微阵列并且在保持水合的同时保持在适当 的温度下，由此形成杂交DNA。在反应完成后，可通过用具有受控的盐浓度和温度的溶液清 洗微阵列而除去未反应的物质。根据本实施方式的从微阵列获得光数据的方法还包括将光照射到微阵列上以测 量从微阵列产生的光。实施方式包括其中所测量的光可为荧光和/或反射光的配置。实施 方式包括其中照射光可为激光或任何波长的光的配置。当第二基准标记包括至少一个柱子 时，测量光可为反射光。可使用已知的方法进行向微阵列照射光以及测量从那里发射的光。在一个实施方式中，可以用于检测靶物质与探针样点中的探针材料之间的相互 作用的光照射角度进行光照射。光照射角度的实施方式可为相对于基底表面约0° 约 45°。照射光可为任何波长的光或者具有对应于荧光物质的激发波长的预定波长的激发 光。在一个实施方式中，可以相对于基底表面约45° 约135°的角度测量所述测量光。可使用光接收装置测量光。光接收装置的实施方式可包括光电倍增管、光电二极 管、电荷耦合器件(“CCD”)或其它类似装置。当使用适于荧光标记的激发光测量反射光 时，可同时测量反射光和荧光。在这样的实施方式中，可通过二向色镜分离反射光和荧光， 和用于测量荧光的光接收装置可与用于测量反射光的光接收装置可分开使用。所测得的光 数据可以图像形式或使得反射光的强度用数字表示的数字形式提供。根据本实施方式的从微阵列获得光数据的方法还包括由所获得的光数据鉴别第 一基准标记和参考所鉴别的第一基准标记鉴别其中固定探针材料的区域的位置和范围。所述方法还包括由所获得的光数据鉴别第一基准标记和任选地鉴别第二基准标 记，以及参考所鉴别的第一基准标记和所任选地鉴别的第二基准标记鉴别其中固定探针材 料的区域。关于所述鉴别，可通过参考与周围的光强度相比光强度有多低即暗度来鉴别第一基准标记。例如，在一个实施方式中，第一基准标记可具有等于或低于其中固定探针材料的 区域的亮度的亮度。可根据所使用的发光物质适当选择暗度。即，考虑到关于第一基准标 记和其它区域的预定信息，将显示低的光强度的位置和范围鉴别为第一基准标记，和参照 第一基准标记的位置和范围确定其中固定探针的其它区域。将所鉴别的关于其它区域的信 息与关于第一基准标记和其它区域的预定信息进行比较，确定关于其它区域的信息与预定 信息是否相同，如果必要，可进一步对所述信息进行校正。所述预定信息包括在微阵列的制 造期间所使用的在基底上的第一基准标记、第二基准标记和/或其中固定探针的区域的预 定位置或范围。关于鉴别步骤，可通过参考与周围的光强度例如其中固定探针材料的区域的光强 度相比光强度有多高来鉴别第二基准标记。例如，在一个实施方式中，第二基准标记可具有 等于或高于其中固定探针材料的区域的亮度。可根据所使用的发光物质的类型适当选择亮 度程度。即，考虑关于第二基准标记和其它区域的预定信息，将具有高的光强度的位置和范 围鉴别为第二基准标记，以及使用第二基准标记的位置和范围确定其中固定探针的其它区 域。将所鉴别的信息与关于第二基准标记和其它区域的预定信息进行比较，确定关于其它 区域的信息与预定信息是否相同，以及如果必要，可进一步对该信息进行校正。所述预定信 息包括在微阵列的制造期间所使用的在基底上的第一基准标记、第二基准标记和/或其中 固定探针的区域的预定位置或范围。在鉴别第一基准标记和第二基准标记中，可通过参照与周围相比光强度有多低来 鉴别第一基准标记，和可通过参考与周围相比光强度有多高来鉴别第二基准标记，以及可 通过参考第一基准标记和第二基准标记的相对位置来鉴别第一基准标记和第二基准标记。 具体而言，可通过参考第一基准标记和第二基准标记是否彼此相邻来鉴别第一基准标记和 第二基准标记。另外，可通过参考第一基准标记和第二基准标记的形状例如文字或符号来 鉴别第一基准标记和第二基准标记。根据另一实施方式，微阵列包括在基底上的第一确定区域、第二确定区域和第三 确定区域，其中探针核酸固定于第三确定区域上，探针核酸具有与靶核酸的序列互补的序 列，第一确定区域与标记有能检测的标记的靶核酸或者标记有能检测的标记的靶物质之间 的结合力弱于第二确定区域与标记有能检测的标记的靶物质之间的结合力，以及第二确定 区域与标记有能检测的标记的靶物质之间的结合力等于或强于第三确定区域中的探针核 酸与标记有能检测的标记的靶物质之间的结合力。关于第一确定区域和第二确定区域，当与标记有能检测的标记的靶核酸或标记有 能检测的标记的靶物质反应时，从第二确定区域获得的检测信号强于从第一确定区域获得 的检测信号。由于信号差别，可将第一确定区域和第二确定区域用作用于鉴别从微阵列 分析获得的信号的基准标记。第一确定区域和第二确定区域也可分别称为暗的基准标记 (“DF”)和亮的基准标记(“BF”)。另外，第三确定区域可称为数据样点。在本示例性实施方式中，检测信号可为荧光信号，和从第二确定区域获得的荧光 信号可强于从第一确定区域获得的荧光信号。从第二确定区域获得的荧光信号可比从第一 确定区域获得的荧光信号强10%或更多。示例性实施方式包括其中从第二确定区域获得的 荧光信号可比从第一确定区域获得的荧光信号强约20%的配置。示例性实施方式包括其 中从第二确定区域获得的荧光信号可比从第一确定区域获得的荧光信号强约30%的配置。示例性实施方式包括其中从第二确定区域获得的荧光信号可比从第一确定区域获得的荧 光信号强约40%的配置。示例性实施方式包括其中从第二确定区域获得的荧光信号可比从 第一确定区域获得的荧光信号强约50%的配置。示例性实施方式包括其中从第二确定区域 获得的荧光信号可比从第一确定区域获得的荧光信号强约100%的配置。示例性实施方式 包括其中从第二确定区域获得的荧光信号可比从第一确定区域获得的荧光信号强约200% 或更多的配置。能检测的标记的实施方式可为光学标记、放射性标记、以及用于将基底转变为生 色团物质的酶或各种其它类似标记。在一个实施方式中，光学标记可包括荧光物质。酶的 实例可包括碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。第一、第二和第三确定区域可各自具有约0. 1 ii m 约10 ii m的尺寸，例如，所述区 域的宽度和/或长度可在所述范围内。在其中第一、第二和第三确定区为圆形的实施方式 中，所述尺寸是指所述区域的直径。然而，如果第一、第二和第三确定区域不是圆形的，则所 述尺寸是指由穿过所述区域的重量中心的线与所述区域的边界线所形成的最短线段。关于第一确定区域和第二确定区域，可布置第一确定区域和第二确定区域，使得 当与标记有能检测的标记的靶核酸或标记有能检测的标记的靶物质反应时，将从第一确定 区域和第二确定区域获得的检测信号与从第三确定区域获得的检测信号辨别出来。所述组合可具有使得在进行相同的反应时，从所述第三确定区域获得的检测信号 具有对于偶然具有相同的排列具有低的可能性的排列的布置。在本文中，“对于偶然具有相 同的排列具有低的可能性的排列”意指在标记有能检测的标记的靶核酸或标记有能检测的 标记的靶物质与固定在第三确定区域中的探针核酸反应之后获得的检测信号的排列为在 概率统计上微不足道的，例如，在距离预期结果两个或更多个标准偏差之外的排列。在示例 性实施方式中，所述布置(排列)可具有文字或符号形状。实施方式包括其中第一确定区 域可围绕第二确定区域或者具有与第二确定区域的形状相反的形状的配置。可将所述组合布置在微阵列的多个面板的各个中，其中所述面板各自包括多个组 合。例如，如果微阵列的面板各自是四边形的，则可在各面板的分别的四个角中布置所述组 合。在本文中，“面板”是指检测装置通过其从已与靶核酸反应的微阵列读取信号的单位区 域。例如，在其中检测装置为用于测量荧光的照相机的实施方式中，所述面板是指照相机通 过其从已与靶核酸反应的微阵列读取荧光信号的单位区域。微阵列可由多个面板组成，以 及在这样的实施方式中，可通过将从各面板获得的信号组合来分析从微阵列获得的信号。第一不同区域可包括疏水材料，以及标记有能检测的标记的靶核酸和标记有能检 测的标记的靶物质可包括亲水材料。此外，第二确定区域可固定有与标记有能检测的标记的靶物质结合的材料或者可 具有与标记有能检测的标记的靶物质结合的表面特性。例如，在一个实施方式中，第二确定 区域可固定有生物素，和标记有能检测的标记的靶物质可为标记有能检测的标记的链霉抗 生物素蛋白。由于生物素与链霉抗生物素蛋白之间的结合力通常强于探针核酸与靶核酸之 间的结合力，因此由生物素与链霉抗生物素蛋白的结合所获得的信号可强于由探针核酸与 靶核酸的结合所获得的信号。此外，第二确定区域可固定有比探针核酸长的探针，和标记有 能检测的标记的靶物质可为与所述更长的探针互补的核酸。实施方式包括其中固定在第一 确定区域中的探针核酸的长度可为约10bp 约50bp的配置。在一个实施方式中，固定在第一确定区域中的探针核酸的长度可为约IObp 约40bp。在另一实施方式中，固定在第一 确定区域中的探针核酸的长度可为约IObp 约30bp。此外，固定在第二确定区域中的探针 核酸可比固定在第一确定区域中的探针核酸长约IObp或更多。在一个实施方式中，固定在 第二确定区域中的探针核酸可比固定在第一确定区域中的探针核酸长约20bp。在另一实 施方式中，固定在第二确定区域中的探针核酸可比固定在第一确定区域中的探针核酸长约 30bp。在另一实施方式中，固定在第二确定区域中的探针核酸可比固定在第一确定区域中 的探针核酸长约lOObp。在另一实施方式中，固定在第二确定区域中的探针核酸可比固定在 第一确定区域中的探针核酸长约200bp或更多。微阵列使用减小的区域用于基准标记，可用相对较短的时间鉴别从微阵列获得的 信号以及面板之间的污染减少。根据另一实施方式，分析微阵列信号的方法包括从通过使上述微阵列与包括标 记有能检测的标记的靶核酸和标记有能检测的标记的靶物质的样品反应产生的反应产物 获得信号；以及通过参考从第一和第二确定区域获得的信号辨别从第三确定区域获得的信 号。分析微阵列信号的方法的本实施方式包括从通过使上述微阵列与包括标记有能 检测的标记的靶核酸和/或标记有能检测的标记的靶物质的样品反应所产生的反应产物 获得信号。实施方式包括其中所述反应可为杂交反应的配置，以及用于该杂交反应的条件 可为本领域中公知的。例如，在一个实施方式中，该杂交反应可在杂交缓冲液中在约4°C的 温度下进行过夜。微阵列与上面描述的实质上类似。可使用可根据所使用的标记物质而改 变的适当方法获得信号。例如，在其中使用荧光标记的实施方式中，测量在将激发光照射到 荧光标 记上时所产生的荧光。在一个实施方式中，可使用照相机进行所述测量。在下文中，参照下面的实施方式详细描述本发明的一个或多个实施方式。然而，这 些实施方式是说明性的实施方式并且不意图限制本发明的上述一个或多个实施方式的目 的和范围。图IA C为说明制造用于微阵列的基底100的方法的一系列横截面图，其中基底 100包括第一基准标记和其中将固定探针材料的区域。参照图1A，首先，在基底100上形成 氧化物层200。基底100的实施方式可包括硅，和氧化物层200的实施方式可包括二氧化 硅。如图IB中所示，可使用已知的方法将氧化物层200图案化。例如，实施方式包括其中 可在氧化膜上涂覆光刻胶以形成光刻胶涂层，然后使用具有用于第一基准标记的图案的掩 模将所述光刻胶涂层曝光和将其显影的配置。然后，蚀刻不被所述光刻胶保护的区域。实 施方式包括其中所述蚀刻可为使用例如氟代烷诸如四氟甲烷的干法蚀刻的配置。作为所述 蚀刻的结果，基底100具有起到第一基准标记作用的疏水表面或者如图IB的区域B所示的 覆盖有疏水材料的凹进部分。然后，将探针固定化合物300施加到基底100上使得探针固 定化合物300固定在基底100的氧化物层200上。在这点上，区域B是疏水的并且不与探 针固定化合物300反应。因而，可通过清洗除去未反应的探针固定化合物300。参照图1C，起到第二基准标记作用的区域A为亮的基准标记。即，当从被照射的微 阵列获得光数据时，区域A产生亮的光数据并起到亮的基准标记的作用。如将参照图4A C 中最右边的图更详细地描述的，区域A可具有包括至少一个柱子的结构，并且当被照射时， 所述柱子结构可发出强的反射光。由于所述柱子结构提供亮的光数据，因此区域A被用作亮的基准标记。对于图案化过程，当将氧化物层200图案化时，也可使用相同的图案化过程将所述至少一个柱子结构同时或顺序地图案化。尽管图1A C说明其中探针固定化合物 固定在区域A中的实施方式，但是如果提供具有高反射率的结构诸如包括至少两个柱子的 结构，则探针固定化合物可不固定在区域A中。此外，区域A可通过将与固定在探针固定区域中的探针固定化合物不同的固定化 合物固定在其上而用作亮的基准标记。例如，固定化合物300可选自与靶物质强烈地相互 作用的材料，该靶物质的实施方式包括抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白。在这样的实施 方式中，当分析靶物质时，通过使对应于固定化合物的靶物质例如抗生物素蛋白或链霉抗 生物素蛋白与荧光标记的生物素反应，所述亮的基准标记可产生亮的光数据。彼此强烈地 相互作用的物质例如生物素与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白所具有的结合力比常规 已知的分析物质例如具有约10bp 约50bp长度的核酸探针与核酸的结合力强得多，因而， 从所述彼此强烈地相互作用的物质获得的信号也是强的。例如，在一个实施方式中，生物 素与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的结合力为例如具有约10bp 约50bp长度的核酸 探针与核酸的结合力的10倍强或更强。在一个实施方式中，生物素与抗生物素蛋白或链 霉抗生物素蛋白的结合力为具有约10bp 约50bp长度的核酸探针与核酸的结合力的100 倍强。在一个实施方式中，生物素与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的结合力为具有约 10bp 约50bp长度的核酸探针与核酸的结合力的1000倍强。在一个实施方式中，生物素 与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的结合力为具有约10bp 约50bp长度的核酸探针与 核酸的结合力的10，000倍强或更强。通过结合来自作为暗的基准标记的区域B的光数据与来自作为亮的基准标记的 区域A的光数据，可容易地鉴别所述暗的基准标记和所述亮的基准标记。因而，由于在制造 微阵列时，所述基准标记的相对位置和范围是已知的，因此可容易地鉴别其中固定探针材 料的区域。图2和图3是说明用于微阵列的基底或微阵列的至少一个实施方式的图。参照图 2，暗的基准标记B可位于亮的基准标记A之间、或者位于其中固定探针的区域D之间、或者 位于亮的基准标记A与其中固定探针的区域D之间。图3显示其中暗的基准标记B形成为 仅在氧化物层中形成的凹进区域、以及形成亮的基准标记A和其中固定探针的区域D的实 施方式。参照图3，其中固定探针的区域D的周围被蚀刻。然而，在另外的实施方式中，其中 固定探针的区域D的周围可不被蚀刻。图4A C是说明具有包括至少一个柱子的结构的亮的基准标记A的实例和制造 所述亮的基准标记A的方法的实例的图。参照图4A C，在相同的图案化过程中形成亮的 基准标记A和其中固定探针的区域D。即，除了用于其中固定探针的区域D的图案之外，在 图案化过程中所使用的掩模还可包括用于亮的基准标记A和/或暗的基准标记B的图案。图5A和5B是说明其中柱子结构起到亮的基准标记的作用的机理的图。参照图 5A，当将光以相对于所述柱子的水平面为e的角度照射到柱子的周边(circumference)上 时，所述柱子的边缘构成反射表面500，并且提供反射光600，和可使用如图5A中所示的光 接收装置400例如照相机测量反射光600。在图5A中，为了清楚起见，放大了所述柱子的边 缘。由于反射光600具有比荧光高的强度，因此即使在反射光暴露于光测量装置短的时间 时，也测得强的光强度。通常，所测得的反射光强度可为荧光强度的约1000 约10，000倍大或更大。在一个实施方式中，在测量反射光时，可不使用滤光器。图5B显示通过测量从具有包括至少两个柱子的结构的亮的基准标记反射的光而获得的该亮的基准标记的顶部 平面图。如图5B所示，光的强度按下面的顺序增加从基底100反射的光、从反射表面500 反射的光、以及从所述柱子结构的内部部分200反射的光。图6A和6B为由相同的结构分别获得的荧光和反射光图像的示意图。如图6A中 所示，当将标记有发光染料例如荧光染料的物质固定在区域A和B中时，将区域A和B暴露 于激发光并测量从那里发射的荧光。如图6A中所示，光均勻地分布在该结构的整个水平表 面上。然而，如图6B中所示，将光以相对于所述柱子的水平横截面平面约45°的角度照射 到区域A和B的周边上，从该结构的上部边缘反射光，和测量反射光。如图6B中所示，从该 结构的上部边缘的表面发射的光具有高的强度。在图6A和6B中，区域A和B各自为具有 至少一个柱子结构的亮的基准标记。图7显示微阵列分析图像的实例。微阵列分析图像可为以下面的方式获得的荧光 图像。将微阵列与标记有荧光物质的靶核酸杂交，然后将杂交产物暴露于对应于该荧光物 质的激发光，以及测量由其发射的光。参照图7，暗的基准标记具有暗的方形形状并且由位 于与该微阵列分析图像的边缘直接相邻的行和列中的确定区域组成，例如，所述暗的方形 形状形成列和行，诸如第二行和倒数第二行以及第二列和倒数第二列；亮的基准标记具有 文字L形状并且由位于从该微阵列分析图像的左边和下边数第三列和第三行中的确定区 域，例如，直接在第二列和倒数第二行内部的亮的方形形状构成；和所述暗的基准标记和所 述L形的亮的基准标记彼此相邻。因而，即使当从数据样点发射的光具有等于或高于所述 亮的基准标记的亮度时，所述亮的基准标记的位置也是可鉴别的。S卩，通过使用暗的基准标 记和亮的基准标记的组合，在微阵列分析图像中更容易地鉴别基准标记的位置，因而，还减 少了所使用的样点的数量。由于用在基准标记中的样点的数量减少，因此基准标记与样品 中所含的靶物质的反应对数据样点与样品中所含的靶物质的反应的影响减�。纱耸菅� 点的强度或精确度增加。图7显示微阵列中的一个面板的图像。图8显示其中通过参考图7中所示的基准标记精确地布置基准标记和数据样点的 网格化(gridding)实施方式。一旦鉴别了基准标记的位置或形状，便使用已知的方法鉴别 其它数据样点的位置。可使用肉眼或存储基准标记的信息的参比文件鉴别基准标记的位置 或形状。本文中所使用的参比文件是指存储在制造微阵列时所布置的基准标记的形状的信 息以及基准标记与数据样点的相对位置的信息的文件。参照图7，在所述方形形状的暗的基 准标记和所述L形的亮的基准标记、以及数据样点区域中，对网格进行分配以精确地对应 各自的样点。当使用微阵列分析靶物质时，通过参考所述网格的信号例如荧光信号分析所 述靶物质的信息。图9说明其中通过参考图7中所示图像中的基准标记非精确地布置基准标记和数 据样点的网格。参照图9，与微阵列中所形成的暗的基准标记相比，暗的基准标记的下侧向 上偏移使得所述暗的基准标记的下侧包括在第三行中的样点，从图像的下边缘在所需位置 上方的一行，以及亮的基准标记的下侧向上偏移使得亮的基准标记的下侧包括在第四行中 的样点，从图像的下边缘在所需位置上方的一行。结果，微阵列中实际的样点位置与网格中 的样点位置失配。因而，当对从所述网格读取的信号进行分析时，未准确地分析样品中的靶 物质。
图IOA E显示微阵列的面板的图像，其中所示面板包括暗的基准标记与亮的基 准标记的多个组合并且所述组合具有不同的形状。图IOB E显示图IOA的标记为B E 的区域的放大图。参照图IOA E，暗的基准标记与亮的基准标记的各组合定位在所述面板 的图像的四个角上并且这四个组合具有不同的形状。另外，图IOA说明暗的基准标记可用 于在微阵列的面板上形成文字数字符号以提供另外的鉴别，如图IOA中所示，所述符号拼 为“ 10-4E”。在图IOA E中，B是亮的基准标记样点，D是暗的基准标记样点，M和P是数 据样点。图IOA E中所使用的M是失配样点和P是完美匹配样点。图IOA显示微阵列的 一个面板的图像，包括总共144个基准标记样点(B D = 60 84)。如上所述，所述暗的 基准标记可为通过从其上形成氧化物层的基底除去氧化物层而形成的区域。实施方式包括 其中所述区域可为从其除去氧化物层的基底自身的表面、或者覆盖有疏水材料的表面的配 置。在其中使用疏水材料的实施方式中，该疏水材料可得自干法蚀刻材料诸如碳氟化合物。 在一个实施方式中，该碳氟化合物可为四氟甲烷。实施方式包括其中使用公知的材料的等 离子体反应进行干法蚀刻过程的配置。所述基底可具有其上固定探针固定化合物的表面。所述表面可为排除第一基准标 记的表面的整个表面、或者其上将固定探针的表面。所述探针固定化合物的实施方式可包 括选自以下的至少一种化合物生物素，抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白，聚L-赖氨酸， 以及具有氨基、醛基、硫醇基、羰基、琥珀酰亚胺基团、马来酰亚胺基团、环氧基团或异硫氰 酸酯基团的化合物。包含氨基的化合物的实例包括3-氨基丙基三甲氧基硅烷、EDA、DETA、 3-(2_氨基乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷、以及3-氨基丙基三乙氧基硅烷。包含醛基的化 合物的实例包括戊二醛。包含硫醇基的化合物的实例包括MPTS。包含环氧基团的化合物的 实例包括3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷。包含异硫氰酸酯基团的化合物的实例包括 PDITC0包含琥珀酰亚胺和马来酰亚胺基团的化合物的实例包括DSC和SMPB。如图IOA E中所示，暗的基准标记可定位在亮的基准标记附近。实施方式包括其中可通过将基底的表面图案化而限定第二基准标记的配置。可使 用已知的方法进行所述图案化。例如，在一个实施方式中，可通过光刻法进行所述图案化。 作为图案化的结果，所述第二基准标记可具有通过蚀刻而除去基底的在第二基准标记附近 的表面的一部分所形成的柱子结构。所述柱子结构的水平横截面可为例如圆形或四边形诸 如长方形或正方形形状，但是所述柱子结构的形状不限于此。在使用图IOA E中所示的多个不同的组合例如数据样点中可非偶然出现的组合 时，错网格化(misgridding)的可能性是低的。在用于获得图IOA E中所示结果的实施 方式中，在216个面板(72个面板/微阵列X3个微阵列)中没有发生错网格化。当使用 多个不同的组合时，由于每个面板使用较小的区域作为基准标记样点，因此形成更多的数 据样点。另外，由于基准标记样点的数量减少，因此鉴别网格所需的时间减少。当使用多个 不同的组合时，可减少在区分相邻面板时产生的混淆。如上所述，根据以上实施方式的一个或多个，使用用于微阵列的基底，可制造从其 容易地获得光数据的微阵列。通过使用根据上述实施方式的制造用于微阵列的基底的方法，可制造从其容易地 获得光数据的微阵列。 通过使用根据上述实施方式的微阵列，容易地获得光数据。
通过使用根据上述实施方式的制造微阵列的方法，可制造从其容易地获得光数据 的微阵列。通过使用根据上述实施方式的获得光数据的方法，可从微阵列容易地获得光数 据。应理解，本文中所述的示例性实施方式应仅在描述性的意义上考虑并且不用于限 制的目的。各示例性实施方式中的特征或方面的描述通常应认为可用于其它示例性实施方 式中的其它类似特征或方面。
权利要求
用于制造微阵列的基底，该基底包括设置于所述基底上的第一基准标记；和设置于所述基底上的探针固定区域，其中所述第一基准标记的表面是疏水的并且探针固定化合物固定于所述探针固定区域上。
2.权利要求1的基底，其中所述第一基准标记包括所述基底的从其除去氧化物层的区域。
3.权利要求2的基底，其中所述基底的从其除去氧化物层的区域包括所述基底的表面 和覆盖有疏水材料的所述基底的表面之一。
4.权利要求1的基底，进一步包括第二基准标记。
5.权利要求4的基底，其中所述第二基准标记包括形成于所述基底表面上的至少两个 柱子。
6.权利要求4的基底，其中所述第二基准标记包括固定在所述基底表面上的与靶物质 强烈地相互作用的材料。
7.微阵列，包括设置于基底上的第一基准标记；和 所述基底的其上固定探针材料的区域， 其中所述第一基准标记的表面是疏水的。
8.权利要求7的微阵列，其中所述第一基准标记包括所述基底的从其除去氧化物层的 区域。
9.权利要求8的微阵列，其中所述基底的从其除去氧化物层的区域包括所述基底的表 面和覆盖有疏水材料的所述基底的表面之一。
10.权利要求7的微阵列，进一步包括第二基准标记。
11.权利要求10的微阵列，其中所述第二基准标记包括形成于所述基底表面上的至少 两个柱子。
12.权利要求10的微阵列，其中所述第二基准标记包括与靶物质强烈地相互作用并固 定在所述基底表面上的材料。
13.权利要求11的微阵列，其中所述至少两个柱子的相邻柱子隔开约0.1 μ m 约 ΙΟΟΟμπι的间隔，和各柱子的横截面的尺寸为约0. Ιμπι 约1000 μ m。
14.制造用于微阵列的基底的方法，该方法包括提供其上形成氧化物层的基底，其中所述基底具有疏水表面； 在所述氧化物层上涂覆光刻胶以形成光刻胶层； 通过掩模将光照射到所述光刻胶层上；将所述光刻胶层显影和蚀刻所述氧化物层的未被所述光刻胶层保护的一部分以使所 述基底的表面暴露；和将探针固定化合物固定在所述基底的不包括所述疏水表面的部分上。
15.权利要求14的方法，其中所述蚀刻包括使用疏水材料的干法蚀刻过程。
16.制造探针微阵列的方法，该方法包括提供其上设置氧化物层的基底，其中所述基底具有疏水表面；在所述氧化物层上涂覆光刻胶以形成光刻胶层； 通过掩模将光照射到所述光刻胶层上；将所述光刻胶层显影和蚀刻所述氧化物层的未被所述光刻胶层保护的一部分以使所 述基底的表面暴露；将探针固定化合物固定在所述基底的不包括所述疏水表面的部分上；和 将探针材料固定在所述基底的其上固定所述探针固定化合物的部分上的多个确定区 域上。
17.制造用于微阵列的基底的方法，该方法包括 提供其上设置氧化物层的基底；在所述氧化物层上涂覆光刻胶以形成光刻胶层； 通过掩模将光照射到所述光刻胶层上；将所述光刻胶层显影和蚀刻所述氧化物层的未被所述光刻胶层保护的一部分以使所 述基底的表面暴露，其中所述蚀刻包括使用疏水材料的干法蚀刻过程；和 将探针固定化合物固定在所述基底的不包括疏水表面的部分上。
18.权利要求17的方法，其中所述疏水材料包括碳氟化合物。
19.制造探针微阵列的方法，该方法包括 提供其上设置氧化物层的基底；在所述氧化物层上涂覆光刻胶以形成光刻胶层； 通过掩模将光照射到所述光刻胶层上；将所述光刻胶层显影和蚀刻所述氧化物层的未被所述光刻胶层保护的一部分以使所 述基底的表面暴露，其中所述蚀刻包括使用疏水材料的干法蚀刻过程； 将探针固定化合物固定在所述基底的不包括疏水表面的部分上；和 将探针材料固定在所述基底的其上固定所述探针固定化合物的部分上的多个确定区 域上。
20.从微阵列获得光数据的方法，该微阵列包括第一基准标记、第二基准标记和其中固 定探针材料的区域，该方法包括使标记有发光物质的靶物质与所述微阵列接触，其中所述第一基准标记具有疏水表面；将光照射到所述微阵列上；测量由于照射光从所述微阵列产生的光以产生光数据； 由所述光数据鉴别所述第一基准标记和所述第二基准标记； 参考所鉴别的第一和第二基准标记鉴别其中固定探针材料的区域；和 从所鉴别的其中固定探针材料的区域获得光数据。
21.权利要求20的方法，其中，在鉴别所述第一基准标记和所述第二基准标记中，通过 参考所述第一基准标记的光强度与所述第一标记周围的区域相比有多低的程度来鉴别所 述第一基准标记。
22.权利要求20的方法，其中，在鉴别所述第一基准标记和所述第二基准标记中，通过 参考所述第二基准标记的光强度与所述第二基准标记周围的区域相比有多高来鉴别所述 第二基准标记。
23.权利要求20的方法，其中，在鉴别所述第一基准标记和所述第二基准标记中，通过 参考所述第一基准标记的光强度与所述第一标记周围的区域相比有多低来鉴别所述第一 基准标记，和通过参考所述第二基准标记的光强度与所述第二基准标记周围的区域相比有 多高来鉴别所述第二基准标记，以及通过所述第一和第二基准标记彼此的相对位置来鉴别 所述第一基准标记和所述第二基准标记。
24.权利要求20的方法，其中所述第二基准标记包括形成于基底表面上的至少两个柱子。
25.权利要求20的方法，其中所述第二基准标记包括固定在所述基底表面上的与所述 靶物质强烈地相互作用的材料。
26.微阵列，包括设置于基底上的第一确定区域；设置于所述基底上的第二确定区域；和设置于所述基底上的第三确定区域，其中探针核酸固定于所述第三确定区域上，所述探针核酸具有与靶核酸的序列互补的 序列，所述第一确定区域与标记有能检测的标记的靶核酸或标记有能检测的标记的靶物质 之间的结合力弱于所述第二确定区域与所述标记有能检测的标记的靶物质之间的结合力， 以及所述第二确定区域与所述标记有能检测的标记的靶物质之间的结合力等于或强于所 述第三确定区域中的所述探针核酸与所述标记有能检测的标记的靶物质之间的结合力。
27.权利要求26的微阵列，其中当所述第一确定区域和所述第二确定区域与所述标记 有能检测的标记的靶核酸或所述标记有能检测的标记的靶物质反应时，从所述第二确定区 域获得的检测信号强于从所述第一确定区域获得的检测信号。
28.权利要求27的微阵列，其中当所述检测信号包括荧光信号时，从所述第二确定区 域获得的荧光信号强于从所述第一确定区域获得的荧光信号。
29.权利要求26的微阵列，其中布置所述第一确定区域和所述第二确定区域的组合， 使得当与所述标记有能检测的标记的靶核酸或所述标记有能检测的标记的靶物质反应时， 将从所述第一确定区域和所述第二确定区域获得的检测信号与所述第三确定区域获得的 检测信号辨别出来。
30.权利要求29的微阵列，其中所述第一确定区域与所述第二确定区域的组合具有使 得在进行相同的反应时，从所述第三确定区域获得的检测信号对于偶然具有相同的排列具 有低的可能性的布置。
31.权利要求29的微阵列，其中所述第一确定区域和所述第二确定区域的组合具有文 字数字形状。
32.权利要求29的微阵列，其中所述微阵列包括多个面板，以及所述第一确定区域、所 述第二确定区域和所述第三确定区域的多个组合布置在所述微阵列的所述多个面板的各 个中。
33.权利要求32的微阵列，其中所述微阵列的所述面板各自是四边形的并且所述第一 确定区域、所述第二确定区域和所述第三确定区域的所述组合布置在所述各面板的分别的 四个角中。
34.权利要求26的微阵列，其中所述第一确定区域包括疏水材料，以及所述标记有能检测的标记的靶核酸和所述标记有能检测的标记的靶物质包括亲水材料。
35.权利要求26的微阵列，其中所述第二确定区域固定有与所述标记有能检测的标记 的靶物质结合的物质。
36.权利要求26的微阵列，其中所述第二确定区域具有与所述标记有能检测的标记的 靶物质结合的表面特性。
37.权利要求26的微阵列，其中所述第二确定区域固定有生物素，以及所述标记有能 检测的标记的靶物质包括标记有能检测的标记的链霉抗生物素蛋白。
38.权利要求26的微阵列，其中所述第二确定区域固定有比固定在所述第三确定区域 表面上的探针核酸长的核酸，以及所述标记有能检测的标记的靶物质包括与所述探针核酸 互补的核酸。
39.分析微阵列信号的方法，其中所述微阵列包括设置于基底上的第一确定区域、设置 于基底上的第二确定区域、和设置于基底上的第三确定区域，其中探针核酸固定于所述第 三确定区域上，所述探针核酸具有与靶核酸的序列互补的序列，所述第一确定区域与标记 有能检测的标记的靶核酸或标记有能检测的标记的靶物质之间的结合力弱于所述第二确 定区域与所述标记有能检测的标记的靶物质之间的结合力，以及所述第二确定区域与所述 标记有能检测的标记的靶物质之间的结合力等于或强于所述第三确定区域中的所述探针 核酸与所述标记有能检测的标记的靶物质之间的结合力，所述方法包括从通过使所述微阵列与包括标记有能检测的标记的所述靶核酸和所述标记有能检测 的标记的靶物质的至少一种的样品反应所产生的反应产物获得信号；和通过参考从所述第一确定区域和所述第二确定区域获得的信号辨别从所述第三确定 区域获得的信号。
40.制造微阵列的方法，所述方法包括提供基底；在所述基底上设置氧化物层；将所述氧化物层图案化以形成至少两个柱子；和在所述至少两个柱子上设置探针固定化合物，其中在所述至少两个柱子之间的区域起到第一基准标记的作用，以及所述柱子和探针 固定化合物起到具有与所述第一基准标记不同的光反射特性的第二基准标记的作用。
全文摘要
本发明提供微阵列用基底、微阵列制法及从微阵列获得光数据的方法。所述基底包括设置于所述基底上的基准标记、以及设置于所述基底上的探针固定区域，其中所述第一基准标记的表面是疏水的并且探针固定化合物固定于所述探针固定区域上。
文档编号G01N21/76GK101799422SQ20101011759
公开日2010年8月11日 申请日期2010年2月10日 优先权日2009年2月10日
发明者孙大淳, 安兑臻, 朴卿希, 李圭祥 申请人:三星电子株式会社
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