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专利名称：利用细菌的氧化反应判断其对药物敏感性的装置及方法
技术领域：
本发明涉及的是一种医学上对细菌作药敏实验的装置及方法，具体的讲是一种利 用细菌的氧化反应来判断细菌的药物敏感性的装置及方法。
背景技术：
各种致病细菌对抗菌药物的敏感性各异。测定细菌对不同药物的敏感程度，对应 临床治疗中的用药选择，以便及时有效地控制感染，具有重要的意义。目前的细菌对药物敏 感性试验方法主要有扩散法和稀释法两类。扩散法中常用的有纸片法，即将吸附了药物的 圆纸片覆盖于细菌培养基表面，通常作1天的培养后，通过测定抑菌圈的大小来判定细菌 对药物是否敏感；该方法通常只能作定性的测定，只有在与稀释法相配合，经统计学的回归 分析得到其抑菌圈直径与最小抑菌浓度间相关关系的回归方程后，才可达到定量检测的目 的。稀释法中有试管稀释法、微量液体稀释法等，虽克服扩散法的缺点，能作定量或半定量 的最小抑菌浓度测定，但其同样也都要有1天的培养过程，并且是通过观察菌液是否浑浊 来判定结果。可见，现有技术中的传统方法具有检测时间较长的问题，其检测过程一般超过 1天。根据化学反应中有无电子的转移或得失，可将化学反应分为两大类一类是在反 应过程中有电子的转移或得失，称为氧化还原反应，其中将反应过程中失去电子的反应定 义为氧化反应；另一类是在反应过程中没有电子的转移或得失，称为非氧化还原反应。现有技术中还存在利用电极的微生物细胞氧化反应研究模型，其通过观察微生物 细胞在电极表面的电化学响应信号来分析微生物细胞的氧化现象、揭示微生物细胞发生氧 化反应的机理。已解明细菌的氧化现象主要与菌体内辅酶A等成分的氧化反应相关，辅酶A 等成分发生氧化反应后，可使细菌的新陈代谢受阻。近年来，将输液管等电极化后，该项技 术在国外已应用于发电所冷却管，食品、化妆品企业送水管和排污管等的管面污染与生物 膜形成的防止方面。同样，通过分析不同微生物细胞的电化学响应信号及氧化反应现象，可 以进行不同微生物细胞的分类鉴定。但是，所述利用电极的微生物细胞氧化反应研究模型， 使用了复杂的电源控制系统及特制极谱记录仪。

发明内容
本发明的目的是提供一种快速、准确和操作方便的利用细菌的氧化反应判断细菌 对药物的敏感性的装置及方法。为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案一种利用细菌的氧化反应判断 细菌对药物的敏感性的装置，包括虚拟电压信号发生器、计算机、工作电极和对极；经过所 述药物处理的所述细菌附着在所述工作电极上；所述电压信号发生器与计算机连接，并能 在所述计算机的控制下向工作电极和对极之间施加在预定电压范围内变化的电压；同时， 所述计算机对流过所述工作电极和对极之间的电流进行采样，从而得到所述电压与所述电 流之间的伏安图谱；当所述伏安图谱出现至少一个峰谷时，表明所述细菌对所述药物不敏感；如果没有出现峰谷，那么表明所述细菌对所述药物敏感。进一步，所述峰谷是由所述细菌在氧化反应时，其菌体内的辅酶A参与电极反应、 并在氧化反应时释放电子而形成的。本发明还提供一种利用细菌的氧化反应判断细菌对药物的敏感性的方法，将经过 所述药物处理的所述细菌置于电极的表面；然后向所述电极施加在预定电压范围内变化的 电压，并记录流过所述电极的电流，从而得到所述电压与所述电流之间的伏安图谱；当所述 伏安图谱出现至少一个峰谷时，表明所述细菌对所述药物不敏感；如果没有出现峰谷，那么 表明所述细菌对所述药物敏感。本发明中的所述装置和方法使用包括工作电极及对极在内的电极系统，将经药物 处理后的菌置于工作电极表面，在电极间施加扫描电压，当所述扫描电压达到所述细菌的 氧化电位时，其菌体内的辅酶A参与氧化反应而释放电子，从而能够根据这此过程中得到 的所述伏安图谱上是否有峰谷来判断细菌对药物的敏感性。


图1是本发明中的利用细菌的氧化反应判断细菌对药物的敏感性的装置的原理 图。图2是大肠埃希氏菌(K9512)氧化反应的伏安图谱。图3是大肠埃希氏菌(K9510)氧化反应的伏安图谱。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的技术方案进行详细说明。细菌的氧化反应现象可通过其实验模型表达，本发明的所述的细菌对药物的敏感 性实验，是建立在细菌氧化反应基础上的。本发明借助近年来计算机及虚拟仪器技术的快速发展，自行设计虚拟的电压信号 发生器，并利用计算机控制输出电源、记录伏安图谱，从而开发了结构简单、易于操作的细 菌氧化反应实验模型，所述实验模型能够用于观察电极间的电子流动变化，探讨细菌的氧 化反应特征。图1示出了本发明中的细菌氧化反应实验模型装置的原理见图1。如图1所示，所 述实验模型装置包括虚拟电压信号发生器1、计算机2、工作电极3、对极4、参比电极5、细 菌6、纸质滤膜7。其中，所述工作电极3为平面石墨电极，对极4为钼电极，参比电极5为 饱和甘汞电极(SCE, Saturated Calomel Electrode)。所述纸过滤膜7为孔径0. 45 u m的 普通实验用硝酸纤维纸质滤膜，用于滤去菌液中的液体并附着菌体6。所述电压信号发生器1为自行设计的虚拟仪器，其采用市售的Lab VIEW软件和多 功能数据采集卡，将所述多功能数据采集卡插入计算机2的PCI接口，从而制作成本发明中 的虚拟仪器式的阶梯形电压信号发生器1，优选地，所述多功能数据采集卡采用美国NI公 司的16位精度的PCI-6229数据采集卡；进一步，通过在所述计算机2的界面上输入阶梯形 电压信号参数，在计算机2自动控制下，从所述多功能数据采集卡的模拟电压输出通道产 生所需的电压信号，加到工作电极与对极上，同时用台式数字万用表自动测量流过工作电 极与对极之间的电流，所述万用表通过RS-232C接口与计算机2相连，并由计算机2自动采集记录流过工作电极与对极之间的电流值并进行后续处理，特别地，所述后续处理是指利 用计算机形成电压与电流的关系图，从而形成伏安图谱，所述伏安图谱对应的是同一时刻 输出的阶梯形电压和用万用表自动测量的流过电极间的电流。优选地，所述阶梯形电压信 号参数被设定为0. 00-1. 00V、其递增速率为10mV/S ；所述台式数字万用表采用华谊24位精 度的MS8050型数字万用表。每一种微生物细胞都有其特定的氧化电位，当外界施加电位超过微生物细胞的氧 化电位时，并且微生物细胞单纯处于外界施加的电位之中时，微生物细胞就会产生与外界 的电子交换，从而导致微生物细胞因失去电子被氧化。细菌氧化反应的主体是菌体内的辅 酶A，其与电极反应、并在氧化反应时释放电子，从而形成新的电流，成为电流曲线上的峰 谷，进一步，本发明中的所有“峰谷”可以仅仅是峰。因此，将细菌介于电极之间，当施加电 位超过微生物细胞，即所述细菌，的氧化电位时，发生氧化反应，所述细菌的菌体内的辅酶A 被氧化形成双聚体辅酶A，同时释放电子。细菌的氧化反应主要与菌体内辅酶A等成分相关，活的细菌含有辅酶A，而在死菌 体内活性辅酶A的含量会大幅度下降。因此，可以推理，活的细菌置于氧化反应实验模型， 当外界施加电位超过细菌的氧化电位时，细菌就会发生氧化反应，辅酶A氧化形成双聚体 辅酶A，同时释放电子；并且氧化反应时释放电子形成新的电流，形成伏安图谱电流曲线上 的峰电流，其对应于所述的峰谷。而死菌体因基本不含有细菌氧化反应的主体，即活性辅酶 A，死菌体置于氧化反应实验模型，当外界施加电位超过细菌的氧化电位时，基本不发生上 述的氧化反应，也不会因氧化反应时释放电子形成新的电流，伏安图谱电流曲线上不会有 峰谷形成。本发明将细菌与药物混合并作用后，把细菌置于氧化反应实验模型装置中，当外 界施加电位超过细菌的氧化电位时，观察细菌是否发生氧化反应，伏安图谱电流曲线上的 是否形成峰谷，就可以判断细菌的死活，即能够判断细菌对药物的敏感性。优选地，本发明以吸光度差值比较法，测定大肠埃希氏菌菌体内辅酶A的含量为 0. 21 士0. 07nmol/108cells，灭活后，辅酶 A 的含量仅为 0. 03士0. 02nmol/108cells。同样， 对于枯草芽孢杆菌、链球菌、葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、乳酸杆菌等菌种，发现死菌体内活性 辅酶A的含量均大幅度下降。进一步，表1示出了不同菌种的有关细菌的氧化电位。表1 不同菌种的氧化电位 进一步，本发明还涉及一种将细菌氧化反应的相关理论应用于细菌药敏实验，从 而能够基于细菌氧化反应来进行细菌药敏试验的新方法。所述方法，是在使用细菌氧化反 应实验模型的基础上，把经过药物处理的细菌6置于所述工作电极3表面，在工作电极3与 对极4间输入所述阶梯形递增电压，当施加的所述电压超过细菌6的氧化电位时，观察细菌 6是否发生氧化反应、及所述氧化反应的程度，从而检测出该细菌是否已死亡、部分死亡或 完全存活，即能够判断该药物对细菌6是属于敏感、中度敏感或无效。因细菌的氧化电位一般在0. 00-1. 00V之间，因此工作电极与对极之间输入的所 述阶梯形递增电压的范围一般设定为0. 00-1. 00V。工作电极与对极之间输入的所述阶梯形 递增电压的递增速率以伏安图谱的清晰度为准，优选地，设定为5-50mV/S。以所述递增速率 被设定为5mV/s为例，0. 00-1. 00V递增电压的输入时间为全程200s ；以所述递增速率设定 为50mV/s为例，0. 00-1. 00V递增电压的输入时间为20s。因此在20至200秒以内，便可以 判断电极间细菌是否发生氧化反应、以及所述氧化反应的程度，即能够判断细菌6对该药 物的敏感性。下面进一步说明如何将细菌固定在工作电极表面。本发明将菌液数滴滴于孔径0. 45 y m的纸质滤膜7上，并迅速进行负压抽滤，进一 步，所述的负压抽滤可以采用普通的实验用负压抽滤器。从而使细菌阻留在所述硝酸纤维 纸质滤膜7上，并将纸质滤膜附着在工作电极3的表面。菌液中的液体成分，即细菌的保存 液，采用医学实验中常用的细菌保存液，优选地，所述保存液为PH7. 0的0. lmol/1磷酸缓冲 液。另外，为增加硝酸纤维纸质滤膜7在电极表面的附着力，特别地，所述电极主要是指工 作电极3、也包括对极，使用4，4’ -bipyridine等电极修饰剂滴在所述工作电极3上，即平 面石墨电极上，从而使所述工作电极3的表面完全湿润。下面通过实施例对本发明进行详细的说明。实施例1临床扩散法和稀释法药敏实验结果表明大肠埃希氏菌(K9512)株对一般浓度抗 生素Ampicillin敏感，其最低有效浓度为5 u g/ml。取所述大肠埃希氏菌(K9512)液2ml各3份，菌体经离心分离；其中第1份置浓度 为50 y g/ml的抗生素Ampicillin中，混合反应30min，菌体经离心分离、洗净后，将第1份 大肠埃希氏菌保存于0. 1M磷酸缓冲液(pH7. 0)中；取第2份大肠埃希氏菌(K9512)液2ml， 菌体经离心分离后置浓度为5 u g/ml的抗生素Ampicillin中，混合反应30min，再将菌体经 离心分离、洗净后，将第2份大肠埃希氏菌保存于0. 1M磷酸缓冲液(pH7.0)中；取第3份大 肠埃希氏菌(K9512)液2ml不与抗生素Ampicillin混合，菌体经离心分离、洗净后直接保 存于0. 1M磷酸缓冲液(pH7. 0)中。以下操作请参照图2。首先，取第3份保存于0. 1M磷酸缓冲液的大肠埃希氏菌菌液数滴于孔径0. 45 y m 的纸质滤膜上，迅速负压抽滤从而使细菌阻留在硝酸纤维纸质滤膜7上，将所述纸质滤 膜7膜附着在工作电极3的表面；工作电极3和对极4之间以10mV/S的递增速率输入0. 00-1. 00V电压，随着电压升高，其对应电流也相应增大；但电极间施加电压在0. 72V(vs. SCE，即以SCE为参比电极)。附近出现电流的峰谷(a曲线)。同样取第2份保存于0. 1M磷酸缓冲液的大肠埃希氏菌菌液数滴于孔径0. 45 y m 的纸质滤膜7上，迅速负压抽滤使细菌阻留在硝酸纤维纸质滤膜7上，将纸质滤膜7附着在 工作电极3表面；电极间以10mV/S的递增速率输入0. 00-1. 00V电压，随着电压升高，其对 应电流也相应增大；电极间施加电压在0. 72V(vs. SCE,即以SCE为参比电极)附近也出现 电流的峰谷(b曲线)，只是电流的峰值降低。再取第1份保存于0. 1M磷酸缓冲液的大肠埃希氏菌菌液数滴于孔径0. 45 y m的 纸质滤膜7上，迅速负压抽滤使细菌阻留在硝酸纤维纸质滤膜7上，将纸质滤膜7附着在工 作电极3表面；电极间以10mV/S的递增速率输入0. 00-1. 00V电压，随着电压升高，其对应 电流也相应增大；但电极间施加电压在0. 72V(vs. SCE,即以SCE为参比电极)附近未出现 电流的峰谷(c曲线)。图2所示，可以得出结论，第1份保存于0. 1M磷酸缓冲液的大肠埃希氏菌，在其 氧化电位0. 72V(vs. SCE,即以SCE为参比电极)附近未出现电流的峰谷，是死菌体；因此 浓度为50iig/ml的抗生素Ampicillin对大肠埃希氏菌(K9512)是有效的，即敏感的；第 3份保存于0. 1M磷酸缓冲液的大肠埃希氏菌，在其氧化电位0.72V(vs.SCE)附近出现电流 的峰谷(a曲线)，是活菌；第2份保存于0. 1M磷酸缓冲液的大肠埃希氏菌，在其氧化电位 0. 72V(vs. SCE)附近出现电流的峰谷(a2曲线)，虽电流的峰值降低，说明仍有大量活菌存 在，表明浓度为5iig/ml的抗生素Ampicillin对大肠埃希氏菌(K9512)轻度敏感。实施例2根据临床扩散法结果，取对抗生素Erythromycin敏感、Ampicillin中度敏感的大 肠埃希氏菌(K9510)液2ml各3份，菌体经离心分离，其中第1份置浓度为50 y g/ml的抗 生素Erythromycin中，混合反应30min，菌体经离心分离、洗净后，将第1份大肠埃希氏菌保 存于0. 1M磷酸缓冲液(pH7.0)中；取第2份大肠埃希氏菌(K9510)液2ml，菌体离心分离 后，置浓度为50 u g/ml的抗生素Ampici 11 in中，混合反应30min，菌体离心分离、洗净后，将 第2份大肠埃希氏菌保存于0. 1M磷酸缓冲液(pH7. 0)中。第3份大肠埃希氏菌(K9510) 液2ml不与抗生素混合反应，菌体离心分离、洗净后，直接保存于0. 1M磷酸缓冲液(pH7. 0) 中。将所述3份菌液标本分别取液数滴于孔径0. 45 y m的纸质滤膜7上，迅速负压抽 滤使细菌6阻留在硝酸纤维纸质滤膜7上，将纸质滤膜7附着在工作电极3的表面；电极间 以10mV/S的递增速率输入0. 00-1. 00V电压，获取其伏安图谱如图3所示。其中，第1份标本的伏安图谱(c曲线)，在其氧化电位0.72V(vs.SCE)附近未出 现电流的峰谷，是死菌体；因此浓度为50 y g/ml的抗生素Erythromycin对大肠埃希氏菌 (K9510)是有效的，即敏感的。第3份保存于0.1M磷酸缓冲液的大肠埃希氏菌，在其氧化 电位0. 72V(vs. SCE)附近出现电流的峰谷(a曲线)，表明是活菌。第2份标本的伏安图谱 (b曲线)，在其氧化电位0.72V(vs.SCE)附近电流的峰谷平坦，与标本3相比，判断为中度 敏感。以上实施例表明，利用细菌的氧化反应来进行细菌药敏试验切实可行，其结果与 临床扩散法一致，并可在较短的时间内判断细菌的药物敏感性。
权利要求
一种利用细菌的氧化反应判断细菌对药物的敏感性的装置，包括虚拟电压信号发生器、计算机、工作电极和对极；经过所述药物处理的所述细菌附着在所述工作电极上；其特征在于所述电压信号发生器与计算机连接，并能在所述计算机的控制下向工作电极和对极之间施加在预定电压范围内变化的电压；同时，所述计算机对流过所述工作电极和对极之间的电流进行采样，从而得到所述电压与所述电流之间的伏安图谱；当所述伏安图谱出现至少一个峰谷时，表明所述细菌对所述药物不敏感；如果没有出现峰谷，那么表明所述细菌对所述药物敏感。
2.如权利要求1所述的装置，其特征在于所述电压信号发生器采用虚拟仪器的方式 构建。
3.如权利要求1或2所述的装置，其特征在于所述电压信号发生器输出阶梯形变化 的电压。
4.如权利要求3所述的装置，其特征在于所述阶梯形变化的电压的变化范围为 0. 00-1. OOVo
5.如权利要求3或4所述的装置，其特征在于所述阶梯形变化的电压的递增速率为 5-50mV/so
6.如权利要求1-5任一项所述的装置，其特征在于所述细菌以通过负压抽滤的方式 被附着到纸质滤膜上，然后再将所述纸质滤膜贴到工作电极上的方式被附着到所述工作电 极上。
7.如权利要求1-6任一项所述的装置，其特征在于所述峰谷的峰值大时表明所述细 菌对所述药物的敏感性低，所述峰谷的峰值低时表明所述细菌对所述药物的敏感性高。
8.一种利用细菌的氧化反应判断细菌对药物的敏感性的方法，其特征在于将经过所 述药物处理的所述细菌置于电极的表面；然后向所述电极施加在预定电压范围内变化的电 压，并记录流过所述电极的电流，从而得到所述电压与所述电流之间的伏安图谱；当所述伏 安图谱出现至少一个峰谷时，表明所述细菌对所述药物不敏感；如果没有出现峰谷，那么表 明所述细菌对所述药物敏感。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述在预定范围内变化的电压为阶梯形变 化的电压。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述阶梯形变化的电压的变化范围为 0. 00-1. OOV且其递增速率为5-50mV/s。
全文摘要
本发明涉及一种利用细菌的氧化反应判断细菌对药物的敏感性的装置，包括虚拟电压信号发生器、计算机、工作电极和对极；经过所述药物处理的所述细菌附着在所述工作电极上；其特征在于所述电压信号发生器与计算机连接，并能在所述计算机的控制下向工作电极和对极之间施加在预定电压范围内变化的电压；同时，所述计算机对流过所述工作电极和对极之间的电流进行采样，从而得到所述电压与所述电流之间的伏安图谱。本发明中的所述装置和方法将经药物处理后的菌置于工作电极表面，在电极间施加扫描电压，当所述扫描电压达到所述细菌的氧化电位时，其菌体内的辅酶A参与氧化反应而释放电子，从而能够根据伏安图谱上是否有峰谷来判断细菌对药物的敏感性。
文档编号G01N27/48GK101852765SQ20101016548
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月6日 优先权日2010年5月6日
发明者解宇, 郑瑾 申请人:解宇