专利名称：一种荧光定量rt-pcr检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法
技术领域：
:本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法，属疫苗质量检测技术领域。
背景技术：
:猪痕(Classicalswine fever, CSF)是由猪痕病毒(Classical swine fevervirus, CSFV)引起的一种急性、发热性、高度接触性的病毒性传染病。是养猪业的一种毁灭性传染�。负醣榧叭澜纾劳雎矢叽�80% 90%，国际动物卫生组织将猪瘟列入A类法定传染病之一。目前，疫苗接种仍然是预防和控制猪瘟的重要手段，在20世纪50年代中期，中国学者通过将猪瘟石门系强毒在兔体上连续传几百代后培育成功了一株猪瘟兔化弱毒疫苗。该疫苗是国际公认的最安全有效的弱毒疫苗，在我国乃至全球得到广泛应用，在1976年在由联合国粮农组织和欧共体召开的专家会议上，专家一致认为中国创制的猪瘟兔化弱毒疫苗的应用对控制和消灭欧洲的猪瘟做出了重大贡献。经历了半个世纪的风雨洗礼，该疫苗的地位和价值至今无可动摇。国内使用猪瘟兔化弱毒疫苗，使猪瘟大规模流行得到了有效的控制，但猪瘟局部地区流行仍时有发生，防治猪瘟仍然是我国养猪业的重要任务。疫苗病毒抗原含量的高低是疫苗质量的关键指标。传统的检验方法主要是通过疫苗注射后检测免疫动物血清·来确定疫苗效价，如使用兔体定型热反应法、ELISA、免疫过氧化酶单层实验、血清中和实验等，但随着生物技术的快速发展，这些方法已经越来越凸显出其劣势:如免疫动物后才能确定疫苗的质量，需时长，操作过程繁琐、由于动物个体差异导致准确度低等，无法满足现有的需要。各疫苗厂家生产的猪瘟兔化弱毒疫苗的效果存在一定差异，因此，建立Taqman荧光定量RT-PCR技术来检测猪瘟兔化弱毒疫苗的病毒含量，具有极其重要的意义
发明内容
:本发明的目的在于提供一种省时、省力，特异性高、重复性好、敏感度高的荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法。本发明的荧光定量RT-PCR检测猪蓝耳病弱毒疫苗病毒含量的方法的步骤如下:1、通过生物学软件DNAstar比对GenBank数据库中登录的中国国内测序的6株猪瘟兔化弱毒的毒株全序列，最终选择登录号为AF091507的基因序列，并在其高度保守区5'端开放阅读框区域设计一对标准品引物(SEQ ID N0.USEQ ID N0.2)以及一对定量用引物(SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4)和一条探针(SEQ ID N0.5)。引物及探针详情如表1-1和表1-2。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2用于构建标准浓度的质粒；SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4扩增包含于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2扩增产物片段之内的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒cDNA ； SEQ ID NO:5为Taqman荧光探针，在其5’端标记报告荧光基团FAM，3’标记猝灭荧光基团TAMRA，用于建立荧光定量PCR标准曲线及检测未知样品；表1-1标准品引物相关参数Tabl-1 Parameters of the Standard Primer
权利要求
1.一种荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法，包括用于实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟病弱毒疫苗病毒含量的特异性引物、标准质粒的制备及建立标准曲线、确定实验的成立标准、确定阳性或阴性的判定标准，其具体特征如下: (I)引物特征: SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2能特异性扩增猪瘟兔化弱毒疫苗病毒的cDNA，扩增产物大小为197bp，用于构建标准浓度的质粒； SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4能特异性扩增包含于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2扩增产物片段之内的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒cDNA，扩增产物大小为143bp，SEQ ID NO:5为Taqman荧光探针，在其5’端标记报告荧光基团FAM，3’标记猝灭荧光基团TAMRA，用于建立荧光定量PCR标准曲线及检测未知样品； (2 )标准曲线的建立方法: 提取猪瘟兔化弱毒疫苗的RNA，并反转录为cDNA，作为模板；以SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2为引物，进行PCR扩增；将扩增产物纯化回收，连接到PMD19-T载体上，转化到感受态细胞DH5 α内，提取质粒DNA，获得猪瘟兔化弱毒疫苗检测用的标准浓度质粒； 将制备的标准质粒作10倍梯度稀释 ，以稀释液为模板，进行荧光定量PCR，采集荧光信号，使用Bio-Rad iQ5软件绘制出实时荧光定量标准曲线，并获得其产物Tm值； (3)实验成立标准: 若阳性对照的Ct值< 32，阴性对照的Ct值> 35，电脑绘制的标准曲线各点相关度大于95%，反应效率在80% 120%之间，则说明实验数据准确、有效，实验成立； (4)判定阳性或阴性的标准: 在实验成立的前提下，待测样品的Ct值< 35，判为阳性；待测样品的Ct值> 35则判为阴性。
全文摘要
本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法, 属疫苗质量监测技术领域。本发明方法包括特异性引物及Taqman荧光探针的设计、RNA提取、cDNA制备、标准质粒构建、Taqman荧光定量PCR检测标准曲线的建立、有效性验证和结果判定。设计合成了两对引物，均能特异性扩增猪瘟兔化弱毒病毒的cDNA，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2扩增产物大小为197bp，用于构建标准浓度的质粒，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4扩增产物大小为143bp，包含于前述扩增产物197bp之内,加入荧光探针SEQ ID NO.5用于Taqman荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量。本发明方法检测灵敏度高，检测时间短，能同时进行大批量的样本分析，具有良好的敏感性、特异性、重复性，适用于各品牌猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的测定。
文档编号G01N21/64GK103224996SQ20131012340
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月10日 优先权日2013年4月10日
发明者张以芳, 马志亮, 范斌, 柴俊, 孙亭亭, 邹丰才, 刘岳, 柳桐, 杨洁 申请人:云南农业大学
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