专利名称：双捕获法检测IgM、IgG抗体的胶体金层析条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种利用免疫测定法检测特异性IgM、IgG抗体的层析条及其制备技术，具体地说，涉及一种借助胶体金标记显色的免疫层析反应对特异性IgM、IgG抗体进行联合检测的层析条及其制备方法。
背景技术：
免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)和免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)是人或动物体内最重要的两种抗体。一种抗原(细菌或病毒等)进入机体后，最早出现的免疫球蛋白是IgM抗体，之后出现IgG抗体。尽管在某些情况下还可能出现IgA抗体，由于其临床意义同IgG基本相同，并且IgA含量很低，在临床检测中的实际意义不大，因而在临床检测中一般不予以区分。通过检测机体内IgM、IgG抗体的存在，可以诊断人或动物对特定抗原的免疫反应状态。血清内若检测出特异性IgM抗体，表明有近期感染的发生，但IgM抗体半衰期较短，IgM的检测阴性并不能证明机体未受到感染，有时还需要检测半衰期较长，含量更高的IgG抗体，以明确诊断。
目前检测特异性IgM、IgG抗体主要采用单独检测再综合分析的方法，先采用常规的ELISA法、双抗原夹心法或胶体金免疫层析等方法对IgM和IgG抗体分别进行检测，然后综合分析两次的检测结果以诊断疾�。霾僮鞴谭彼觯觳獠还环奖憧旖�。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种胶体金层析条，采用双捕获法通过一次操作过程即可联合检测特异性IgM、IgG抗体，从而简化操作过程，实现快速检测的目的。
本发明的技术方案如下一种双捕获法检测IgM、IgG抗体的胶体金层析条，所述层析条在PVC背板上一端顺次相互搭接地贴附有样品垫、复合物垫、硝基纤维素膜，另一端贴附有吸收垫；所述复合物垫为涂覆有抗原-胶体金复合物的玻璃纤维素膜，其特征在于所述硝基纤维素膜上包含三条包被线，分别包被有抗IgGγ链抗体、抗IgMμ链抗体、与抗原相应的抗体。
本发明还提供了所述胶体金层析条的制备方法，包括以下步骤(1)制备抗IgMμ链抗体、抗IgGγ链抗体、与抗原相应的抗体采用常规制法制备抗IgMμ链抗体、抗IgGγ链抗体以及与已知抗原相应的动物抗体，浓度分别为1mg/ml～3mg/ml、3mg/ml～5mg/ml、2mg/ml～6mg/ml；(2)制备抗原-胶体金复合物采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按照20μg/ml～80μg/ml比例加入纯化的已知抗原，经封闭、离心处理后，取沉淀稀释至A530值为1～3，备用；(3)取硝基纤维素膜贴在PVC背板中间，将抗IgMμ链抗体、抗IgGγ链抗体、与抗原相应的抗体分开包被在硝基纤维素膜上；将抗原-胶体金复合物涂覆在玻璃纤维素膜上制备复合物垫；(4)在PVC背板上一端顺次相互搭接地贴附有样品垫、复合物垫、硝基纤维素膜，另一端贴附吸收垫；(5)将PVC背板及其贴附的材料切成适宜宽度的层析条。
所制备的抗IgMμ链抗体可以为单克隆或多克隆抗体。
所制备的抗IgGγ链抗体可以为单克隆或多克隆抗体。
所述抗原-胶体金复合物可以喷涂、敷涂或浸泡的方式涂覆在玻璃纤维素膜上。
所述硝基纤维素膜在包被抗IgMμ链抗体、抗IgGγ链抗体、与抗原相应的抗体后可以进行封闭处理，以减少非特异性反应。
所述层析条在制备完成后可以装入塑料板卡内。
本发明的胶体金层析条，以胶体金作为标记物，采用双捕获法测定IgM抗体与IgG抗体，通过一次操作即可联合检测出特异性IgM、IgG抗体，简化了操作过程，且检测结果的总体符合率较高。
具体实施例方式
实施例1检测抗人巨细胞病毒(HCMV)的IgM、IgG抗体1、检测人巨细胞病毒(HCMV)IgM、IgG抗体的胶体金层析条的制备方法(1)采用动物免疫法制备浓度为5mg/ml的兔抗HCMV抗体，采用单克隆抗体制备法分别制备浓度为2mg/ml的鼠抗人IgMμ链单克隆抗体、浓度为4mg/ml的鼠抗人IgGγ链单克隆抗体，备用。
(2)制备抗原-胶体金复合物采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按照60μg/ml比例加入纯化的HCMV抗原，经封闭、离心处理后，取沉淀稀释至A530值2.5，备用。
(3)包被鼠抗人IgMμ链单克隆抗体、鼠抗人IgGγ链单克隆抗体、兔抗HCMV抗体取硝基纤维素膜贴于PVC背板中间，设定划膜机涂覆参数为1μl/cm。取5mg/ml的兔抗HCMV抗体1.5ml、4mg/ml的鼠抗人IgGγ链单克隆抗体1.5ml、2mg/ml的鼠抗人IgMμ链单克隆抗体1.5ml，分别接到划膜机的A、B、C管道接口。将贴有硝基纤维素膜的PVC背板置于划膜机的往复运动平台上。开启划膜机，在硝基纤维素膜上涂覆兔抗HCMV抗体、鼠抗人IgGγ链单克隆抗体、鼠抗人IgMμ链单克隆抗体，在37℃干燥2小时。将背板置于1％聚乙二醇溶液中浸泡30分钟，晾干，37℃干燥2小时。
(4)将抗原-胶体金复合物涂覆在玻璃纤维素膜上设定划膜机喷涂参数为30.0μl/cm，将抗原-胶体金复合物连接到划膜机的D管道接口。取30cm×12cm的玻璃纤维素膜放置往复运动平台上。开启划膜机，在玻璃纤维素膜上喷涂抗原-胶体金复合物制成复合物垫，37℃干燥2小时。
(5)在PVC背板上一端顺次相互搭接地贴上复合物垫和样品垫，另一端贴上吸收垫，将PVC背板及其贴附的材料切成4mm宽层析条。将层析条放入塑料板卡内，用压卡机压实。
当加入被检测样品后，通过层析作用，样品和抗原-胶体金复合物向吸收垫一端移动。当样品通过抗IgMμ链抗体包被处时，IgM抗体与抗IgMμ链抗体结合，其中含有的针对特异性抗原的IgM抗体与抗原-胶体金复合物结合，在该处显示一条紫红色条带。如果被检测样品中含有针对特异性抗原的IgG抗体，当其移动到抗IgGγ链抗体包被处时，特异性IgG抗体既与抗IgGγ链抗体结合，也与抗原-胶体金复合物结合，在此处显示一条紫红色条带。抗原-胶体金复合物移动到与其相应抗体的包被处时，与抗体结合显示一条紫红色条带。
实际检测时，若在抗IgMμ链抗体包被处显示紫红色条带，表明被检测样品中含有针对特异性抗原的IgM抗体，判定为阳性结果；若在抗IgGγ链抗体包被处显示紫红色条带，表明被检测样品中含有针对特异性抗原的IgG抗体，判定为阳性结果；若在抗IgMμ链抗体和抗IgGγ链抗体包被处均显示紫红色条带，表明被检测样品中含有针对特异性抗原的IgM抗体和IgG抗体，判定为阳性结果；否则表明被检测样品中不含有针对特异性抗原的IgM抗体、IgG抗体，判定为阴性结果。在针对特异性抗原的抗体包被处显示紫红色条带，提示该检测系统的检测结果有效；如果该处没有显示紫红色条带，表明该检测系统失效，检测结果无效。
2、检测抗人巨细胞病毒(HCMV)IgM、IgG抗体的检测结果应用制备的胶体金层析条对临床诊断明确的抗HCMV IgG阳性血清278份和阴性血清2197份进行了检测，并与间接法ELISA试剂单独检测抗HCMV IgG的结果进行了对比，结果分别示于表1和表2。
表1胶体金层析条对抗HCMV IgG临床血清的检测结果 表2胶体金与ELISA检测抗HCMV IgG的结果比较 由表1数据可计算得到约登指数为261/(261+17)+2195/(2+2195)-1＝0.94，说明检测结果与样品真实情况的总体符合率很高。由表2数据可计算得到本发明检测结果与ELISA检测结果的总体符合率为(262+2192)/2475×100％＝99.2％，这表明两种检测方法检测抗人巨细胞病毒(HCMV)IgG具有高度一致性。
应用制备的胶体金层析条对临床诊断明确的抗HCMV IgM阳性血清153份和阴性血清1569份进行了检测，并与捕获法ELISA试剂单独检测抗HCMV IgM抗体的结果进行了对比，结果分别示于表3和表4。
表3胶体金层析条对抗HCMV IgM临床血清的检测结果 表4胶体金与ELISA检测抗HCMV IgM的结果比较 由表3数据可计算得到约登指数为141/(141+12)+1568/(1+1568)-1＝0.92，说明检测结果与样品真实情况的总体符合率很高。由表4数据可计算得到本发明检测结果与ELISA检测结果的总体符合率为(143+1566)/1722×100％＝99.2％，这表明两种检测方法检测抗人巨细胞病毒(HCMV)IgM具有高度一致性。
以上分析结果表明，本发明联合检测抗人巨细胞病毒IgM、IgG抗体的胶体金层析条与单独检测IgG或IgM抗体的ELISA试剂具有相似的检测结果，本发明的检测结果能够符合实际检测工作的需要。
实施例2检测抗风疹病毒(RV)的IgM、IgG抗体采用与实施例1类似的方法制备检测抗风疹病毒(RV)IgM、IgG抗体的胶体金层析条。应用制备的胶体金层析条对临床诊断明确的抗RV IgG阳性血清568份和阴性血清1563份进行了检测，并与间接法ELISA试剂单独检测抗RV IgG的结果进行了对比，结果分别示于表5和表6。
表5胶体金层析条对抗RV IgG临床血清的检测结果 表6胶体金与ELISA检测抗RV IgG的结果比较 由表5数据可计算得到约登指数为534/(534+34)+1562/(1+1562)-1＝0.94，说明检测结果与样品真实情况的总体符合率很高。由表6数据可计算得到本发明检测结果与ELISA检测结果的总体符合率为(539+1560)/2131×100％＝98.5％，这表明两种检测方法检测抗RV IgG具有高度一致性。
应用制备的胶体金层析条对临床诊断明确的抗RV IgM阳性血清136份和阴性血清1968份进行了检测，并与捕获法ELISA试剂单独检测抗RV IgM抗体的结果进行了对比，结果分别示于表7和表8。
表7胶体金层析条对抗RV IgM临床血清的检测结果 表8胶体金与ELISA检测抗RV IgM的结果比较 由表7数据可计算得到约登指数为127/(127+9)+1966/(2+1966)-1＝0.93，说明检测结果与样品真实情况的总体符合率很高。由表8数据可计算得到本发明检测结果与ELISA检测结果的总体符合率为(129+1966)/2104×100％＝99.6％，这表明两种检测方法检测抗RV IgM具有高度一致性。
以上分析结果表明，本发明联合检测风疹病毒IgM、IgG抗体的胶体金层析条与单独检测IgG或IgM抗体的ELISA试剂具有相似的检测结果，本发明的检测结果能够符合实际检测工作的需要。
实施例3检测抗单纯疱疹病毒(HV)的IgM、IgG抗体采用与实施例1类似的方法制备检测抗单纯疱疹病毒(HV)IgM、IgG抗体的胶体金层析条。应用制备的胶体金层析条对临床诊断明确的抗HV IgG阳性血清326份和阴性血清1863份进行了检测，并与间接法ELISA试剂单独检测抗HV IgG的结果进行了对比，结果分别示于表9和表10。
表9胶体金层析条对抗HV IgG临床血清的检测结果
表10胶体金与ELISA检测抗HV IgG的结果比较 由表9数据可计算得到约登指数为304/(304+22)+1862/(1+1862)-1＝0.93，说明检测结果与样品真实情况的总体符合率很高。由表10数据可计算得到本发明检测结果与ELISA检测结果的总体符合率为(308+1856)/2189×100％＝98.9％，这表明两种检测方法检测抗HV IgG具有高度一致性。
应用制备的胶体金层析条对临床诊断明确的抗HV IgM阳性血清132份和阴性血清1836份进行了检测，并与捕获法ELISA试剂单独检测抗HV IgM抗体的结果进行了对比，结果分别示于表11和表12。
表11胶体金层析条对抗HV IgM临床血清的检测结果 表12胶体金与ELISA检测抗HV IgM的结果比较 由表11数据可计算得到约登指数为123/(123+9)+1835/(1+1835)-1＝0.93，说明检测结果与样品真实情况的总体符合率很高。由表12数据可计算得到本发明检测结果与ELISA检测结果的总体符合率为(125+1830)/1968×100％＝99.3％，这表明两种检测方法检测抗HV IgM具有高度一致性。
以上分析结果表明，本发明联合检测单纯疱疹病毒IgM、IgG抗体的胶体金层析条与单独检测IgG或IgM抗体的ELISA试剂具有相似的检测结果，本发明的检测结果能够符合实际检测工作的需要。
实施例4检测抗弓形体(Tox)的IgM、IgG抗体采用与实施例1类似的方法制备检测弓形体(Tox)IgM、IgG抗体的胶体金层析条。应用制备的胶体金层析条对临床诊断明确的抗Tox IgG阳性血清368份和阴性血清1769份进行了检测，并与间接法ELISA试剂单独检测抗Tox IgG的结果进行了对比，结果分别示于表13和表14。
表13胶体金层析条对抗Tox IgG临床血清的检测结果 表14胶体金与ELISA检测抗Tox IgG的结果比较 由表13数据可计算得到约登指数为349/(349+19)+1768/(1+1768)-1＝0.95，说明检测结果与样品真实情况的总体符合率很高。由表14数据可计算得到本发明检测结果与ELISA检测结果的总体符合率为(348+1766)/2137×100％＝98.9％，这表明两种检测方法检测抗Tox IgG具有高度一致性。
应用制备的胶体金层析条对临床诊断明确的抗Tox IgM阳性血清132份和阴性血清1836份进行了检测，并与捕获法ELISA试剂单独检测抗Tox IgM抗体的结果进行了对比，结果分别示于表15和表16。
表15胶体金层析条对抗Tox IgM临床血清的检测结果
表16胶体金与ELISA检测抗Tox IgM的结果比较 由表15数据可计算得到约登指数为202/(202+14)+1583/(3+1583)-1＝0.93，说明检测结果与样品真实情况的总体符合率很高。由表16数据可计算得到本发明检测结果与ELISA检测结果的总体符合率为(205+1581)/1802×100％＝99.1％，这表明两种检测方法检测抗ToxIgM具有高度一致性。
以上分析结果表明，本发明联合检测抗弓形体IgM、IgG抗体的胶体金层析条与单独检测IgG或IgM抗体的ELISA试剂具有相似的检测结果，本发明的检测结果能够符合实际检测工作的需要。
权利要求
1.一种双捕获法检测IgM、IgG抗体的胶体金层析条，所述层析条在PVC背板上一端顺次相互搭接地贴附有样品垫、复合物垫、硝基纤维素膜，另一端贴附有吸收垫；所述复合物垫为涂覆有抗原-胶体金复合物的玻璃纤维素膜，其特征在于所述硝基纤维素膜上包含三条包被线，分别包被有抗IgGγ链抗体、抗IgMμ链抗体、与抗原相应的抗体。
2.一种制备权利要求1所述胶体金层析条的方法，包括以下步骤(1)制备抗IgMμ链抗体、抗IgGγ链抗体、与抗原相应的抗体采用常规制法制备抗IgMμ链抗体、抗IgGγ链抗体以及与已知抗原相应的动物抗体，浓度分别为1mg/ml～3mg/ml、3mg/ml～5mg/ml、2mg/ml～6mg/ml；(2)制备抗原-胶体金复合物采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按照20μg/ml～80μg/ml比例加入纯化的已知抗原，经封闭、离心处理后，取沉淀稀释至A530值为1～3，备用；(3)取硝基纤维素膜贴在PVC背板中间，将抗IgMμ链抗体、抗IgGγ链抗体、与抗原相应的抗体分开包被在硝基纤维素膜上；将抗原-胶体金复合物涂覆在玻璃纤维素膜上制备复合物垫；(4)在PVC背板上一端顺次相互搭接地贴附有样品垫、复合物垫、硝基纤维素膜，另一端贴附吸收垫；(5)将PVC背板及其贴附的材料切成适宜宽度的层析条。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所制备的抗IgMμ链抗体为单克隆或多克隆抗体。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所制备的抗IgGγ链抗体为单克隆或多克隆抗体。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述抗原-胶体金复合物以喷涂、敷涂或浸泡的方式涂覆在玻璃纤维素膜上。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述硝基纤维素膜在包被抗IgMμ链抗体、抗IgGγ链抗体、与抗原相应的抗体后还可以进行封闭处理。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述层析条在制备完成后装入塑料板卡内。
全文摘要
本发明提供一种双捕获法检测IgM、IgG抗体的胶体金层析条及其制备技术。该层析条以胶体金作为标记物，在PVC背板上一端顺次相互搭接地贴附有样品垫、复合物垫、硝基纤维素膜，另一端贴附有吸收垫；所述复合物垫为涂覆有抗原－胶体金复合物的玻璃纤维素膜，其特征在于所述硝基纤维素膜上包含三条包被线，分别包被有抗IgGγ链抗体、抗IgMμ链抗体、与抗原相应的抗体。本发明的层析条采用双捕获法测定IgM抗体、IgG抗体，通过一次操作即可联合检测出特异性IgM、IgG抗体，简化了操作过程，且检测结果能够符合实际检测工作的需要。
文档编号G01N33/549GK101067626SQ200710106178
公开日2007年11月7日 申请日期2007年6月8日 优先权日2007年6月8日
发明者陈廷友, 王健, 王志新, 张秀杰 申请人:北京英诺特生物技术有限公司
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