专利名称：芪蛭通络胶囊的质量控制方法
技术领域：
本发明涉及一种用于治疗中风后遗症的中药药物，特别是涉及该药物的质量控制方法。
背景技术：
芪蛭通络胶囊为益气，活血，通络类用药。适用于中风恢复期后遗症表现为半身不遂，肢体麻木，口眼歪斜，语言不利，身体倦怠者的辅助治疗。其现执行标准为国家药品监督管理局标准(试行)，在该质量标准中制定了以下内容。I)取本品，置显微镜下观察:体壁碎片黄色或棕色，有圆形毛窝，直径5-32 μ m，有的具长短不一的刚毛。背腹肌纤维呈长条形或长披针形，多已折断，直径20-33 μ m,多单根散离，偶有数根成束，弯曲或局部扭曲，壁较厚，有时局部膨大或不均匀增厚，无色或淡棕色，胞腔多数明显，有时见棕褐色内容物。体壁碎片无色，表面有极细的菌丝体。石细胞类圆形或长方形，壁一面菲薄。2)取本品内容物5g，加硅藻土 3g，充分混匀，加甲醇30ml，超声处理20分钟，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加水30ml使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次20ml，水溶液备用，合并乙醚提取液，挥去乙醚，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液。另取水蛭对照药材1.5g，力口甲醇10ml，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取供试品溶液3μ 1、对照药材溶液2μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(40:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在100°C加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。3)取鉴别2)项下乙醚提取后的水溶液，用水饱和的正丁醇振摇提取3次(20ml、10ml、10ml)，合并正丁醇提取液，用氨试液提取3次，每次15ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水3ml使溶解，加于DlOl型大孔吸附树脂柱(内径2cm，长12cm)上，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30ml洗脱，弃去40%乙醇洗脱液，继用70%乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每Iml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取供试品溶液10 μ 1、对照品溶液4μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在100°C加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。4)取黄苗甲苷、人参阜苷Rgl对照品，加甲醇分别制成每Iml含lmg、2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述对照品溶液各2 μ 1、鉴别3)项下的供试品溶液4 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(8:1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于100°C加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点及荧光斑点。5)取本品内容物10g，加乙醚30ml，超声处理10分钟，滤过，滤液挥干，残渣加三氯甲烷Iml使溶解，作为供试品溶液。另取川芎对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取供试品溶液5 μ 1、对照药材溶液I μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(9:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。6)取本品内容物5g，加水20ml，超声处理5分钟，离心，取上清液，加稀盐酸调节PH至2，加乙酸乙酯20ml，振摇提取，提取液置水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取丹参对照药材0.5g，加水适量，煎煮半小时，滤过，滤液浓缩至约10ml，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取供试品溶液2 μ 1、对照药材溶液I μ 1，分别点于是一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(8:1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏后，放置过夜，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色荧光斑点。7)检查，应符合胶囊剂项下有关的各项规定。8)含量测定取装量差异项下内容物，研细，混匀，取约10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，回收甲醇至干，残渣趁热用水40ml溶解，转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取3次，依次为20ml、15ml、10ml，弃去乙醚液，水液继用水饱和的正丁醇提取四次，每次15ml。合并正丁醇液，用0.5%氢氧化钠溶液洗涤3次，每次20ml，弃去碱液，用正丁醇饱和的水洗涤至中性(每次20ml，2-3次)，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每Iml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，精密吸取供试品溶液10μ 1、对照品溶液2μ I与4μ 1，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(65:35:10) 10°C以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。喷以10%硫酸乙醇溶液，在100°C加热至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层色谱法进行扫描，波长:λ s=520nm, λ R=650nm,测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值,计算，即得。本品每�：栖渭总�(C41H68O14)不得少于0.060mg。上述质量标准存在着比较严重的缺陷:首先，该标准对于主要药物有效成分含量的定量测定不完善；其次，进行化学鉴别的组成药物数量较少。中药制剂质量稳定、可控和具有生产可重复性是药物具有药理和临床结果可重复性的前提保证，中药质量能否得到控制以及中药质量标准是否科学化，是影响中药产业化的重要制约因素。质量可控性是药品评价的重要指标，质量标准则是药品质量可控性的具体体现。
发明内容
本发明的目的是提供一种上述芪蛭通络胶囊的质量控制方法，以确保生产的药品质量稳定可控。本发明提供的芪蛭通络胶囊的质量控制方法适合于由以下原料药制备而成的药物:黄芪、水蛭、人参、麦冬、五味子、当归、川芎、毛冬青、赤芍、鸡血藤、丹参、制何首乌、红花、泽兰、土鳖虫、地龙、僵蚕、郁金、姜黄、全蝎、天麻、肉桂、羌活、猪牙皂、胆南星、冰片。所述质量控制方法包括鉴别方法和含量测定方法。其中，所述鉴别方法包括如下鉴别:
1)取所述药物内容物5g，加硅藻土3g，充分混匀，加甲醇30ml，超声处理20分钟，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加水30ml使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次20ml，水溶液备用，合并乙醚提取液，挥去乙醚，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液；另取水蛭对照药材1.5g，加甲醇IOml，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至Iml，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液3μ 1、对照药材溶液2μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷:甲醇=40:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在100°C加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
2)取I)项下乙醚提取后的水溶液，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，3次分别为20ml、IOml、IOml，合并正丁醇提取液，用氨试液提取3次，每次15ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水3ml使溶解，加于内径2cm，长12cm的DlOl型大孔吸附树脂柱上，以水50ml洗脱，弃去水液,再用40%乙醇30ml洗脱，弃去40%乙醇洗脱液，继用70%乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加乙醇制成每Iml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10 μ 1、对照品溶液4μ I,分别点于同一娃胶G薄层板上，以三氯甲烧:乙酸乙酯:甲醇:甲酸=40:5:10:0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在100°C加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
3)取黄芪甲苷、人参皂苷Rgl对照品，加甲醇分别制成每Iml含lmg、2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述对照品溶液各2 μ 1、2)项下供试品溶液4 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇:冰醋酸:水=8:1:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在100°C加热至斑点显色清晰，分别置日光及365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点及荧光斑点；
4)取所述药物内容物10g，加乙醚30ml，超声处理10分钟，滤过，滤液挥干，残渣加三氯甲烷Iml使溶解，作为供试品溶液；另取川芎对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5 μ 1、对照药材溶液I μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷:乙酸乙酯=9:1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
5)取所述药物内容物5g，加水20ml，超声处理5分钟，离心，取上清液，加稀盐酸调节PH至2，加乙酸乙酯20ml，振摇提取，提取液置水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取丹参对照药材0.5g，加水适量，煎煮半小时，滤过，滤液浓缩至约10ml，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液2 μ 1、对照药材溶液I μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷:丙酮:甲酸=8:1:1为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏后，放置过夜，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
6)取所述药物内容物5g，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液；另取土鳖虫对照药材lg，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液2 μ 1、对照药材溶液5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯:二氯甲烷:丙酮=5:5:0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸试液，105°C加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑
占.7)取所述药物内容物20g，加乙醇40ml，冷浸20分钟，时时振�。斯艘夯痈桑右掖糏ml使溶解，作为供试品溶液；另取肉桂对照药材2g，同法制成对照药材溶液；再取桂皮醛对照品，加乙醇制成每Iml含1μ I的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液15 μ 1、对照药材溶液2 μ 1、对照品溶液2 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60_90°C石油醚:乙酸乙酯=17:3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
8)取所述药物内容物5g，加三氯甲烷30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液挥干，加氯仿Iml使溶解，作为供试品溶液；另取冰片对照药材适量，加三氯甲烷制成每Iml含IOmg的对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10 μ 1、对照药材溶液6 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷:乙酸乙酯=17:3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸试液，105°C加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
9)取所述药物内容物5g，加乙酸乙酯20ml、浓盐酸0.5ml，超声处理20分钟，滤过，滤液挥干，加乙酸乙酯Iml使溶解，作为供试品溶液；另取何首乌对照药材0.1g,同法制成对照药材溶液；再取大黄素对照品，加甲醇制成每Iml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液15 μ 1、对照药材溶液5 μ 1、对照品溶液2 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯:乙酸乙酯:甲酸=20:2:1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。所述含量测定方法包括黄芪甲苷、丹参素和芍药苷含量的测定。本发明具体以下述薄层扫描法测定所述黄芪甲苷的含量:
1)对照品溶液的制备:精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每Irnl含0.5mg的对照品溶液；
2)供试品溶液的制备:取所述药物内容物，研细，混匀，取10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，回收甲醇至干，残渣趁热用水40ml溶解，转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取3次，每次用量分别为20、15、IOml，弃去乙醚液，水液继用水饱和的正丁醇提取4次，每次15ml，合并正丁醇液，用0.5%氢氧化钠溶液洗涤3次，每次20ml，弃去碱液，用正丁醇饱和的水洗涤至中性，弃去水洗液，正丁醇蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
3)精密吸取供试品溶液10μ 1、对照品溶液2 μ I与4 μ 1，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷:甲醇:水=65:35:10混合溶液10°C以下放置过夜的下层溶液为展开齐U，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在100°C加热至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，以波长XS=520nm、λ R=650nm进行扫描，测量供试品吸收度的积分值与对照品吸收度的积分值，计算，即得。本发明具体以下述高效液相色谱法测定所述丹参素的含量:
I)色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以1%冰醋酸:甲醇=94:6为流动相；检测波长280nm ;理论板数按丹参素钠峰计算不低于3000 ；
2)对照品溶液的制备:精密称取丹参素钠对照品，加50%甲醇制成每Iml含0.135mg丹参素的对照品溶液；
3)供试品溶液的制备:取所述药物内容物，研细，混匀，取4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入2%盐酸溶液50ml，密塞，称定重量，功率150W、频率40kHz超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用2%盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，加入氯化钠5g，摇匀，离心，精密量取上清液25ml，置分液漏斗中，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次用量分别为50、30、20、20ml，合并乙酸乙酯液，回收乙酸乙酯至干，残渣用50%甲醇溶解，转移至IOml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用0.45 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
4)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ1，注入液相色谱仪，测定，即得。本发明具体以下述高效液相色谱法测定所述芍药苷的含量:
1)色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈:0.1%磷酸=16:84为流动相；检测波长230nm,理论板数按苟药苷峰计算不低于3000 ；
2)对照品溶液的制备:精密称取芍药苷对照品，加50%甲醇制成每Iml含0.1mg的对照品溶液；
3)供试品溶液的制备:取所述药物内容物，研细，混匀，取4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，功率150W、频率40kHz超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
4)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。本发明建立了芪蛭通络胶囊的质量控制方法，所建立的方法中，药材的鉴别方法成熟可行，专属性强，阴性无干扰，含量测定方法操作容易，精密度高，重现性好，使用本发明的质量控制方法能够精确、稳定地控制芪蛭通络胶囊的药物质量，以适应药物的工业化稳定生产。
具体实施例方式实施例1:芪蛭通络胶囊的制备。处方:黄芪325g、水蛭130g、人参130g、麦冬32.5g、五味子65g、当归65g、川芎65g、毛冬青325g、赤芍65g、鸡血藤65g、丹参65g、制何首乌162.5g、红花32.5g、泽兰32.5g、土鳖虫32.5g、地龙32.5g、僵蚕6.5g、郁金65g、姜黄32.5g、全蝎13g、天麻13g、肉桂13g、羌活32.5g、猪牙皂6.5g、胆南星13g、冰片13g。制法:以上二十六味，除冰片外，水蛭、土鳖虫、肉桂、全蝎、僵蚕、胆南星粉碎成细粉，过筛，混匀；其余黄芪等十九味，加水煎煮二次，第一次加水10倍量，第二次加水5倍量，每次煎煮2小时，煎煮过程中同时收集挥发油，挥发油用β-环糊精包合后备用；合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20-1.25 (80°C )的清膏，加入水蛭等细粉，混匀，低温干燥后，粉碎成细粉，再与冰片和挥发油β -环糊精包合物配研，过筛，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。性状:本品为胶囊剂，内容物为黄棕色的粉末；气香，味咸、辛、凉、微苦。功能主治:益气，活血，通络。适用于中风恢复期后遗症表现为半身不遂，肢体麻木，口眼歪斜，语言不利，身体倦怠者的辅助治疗。
规格:每粒装0.5g。用法用量:口服，一次4粒，一日2次，早饭前晚饭后各服一次或遵医嘱。贮藏:密封，置阴凉通风干燥处。实施例2:水蛭的薄层鉴别。取实施例1药物内容物5g,加娃藻土 3g,充分混勻，加甲醇30ml,超声处理20分钟，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加水30ml使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次20ml，水溶液备用，合并乙醚提取液，挥去乙醚，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液。另取水蛭对照药材1.5g，加甲醇10ml，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液3 μ 1、对照药材溶液2^1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(40: I)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在100°C加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。实施例3:赤芍的薄层鉴别。取实施例2中乙醚提取后的水溶液，用水饱和的正丁醇振摇提取3次(20ml，10ml,IOml )，合并正丁醇提取液，用氨试液提取3次，每次15ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水3ml使溶解，加于DlOl型大孔吸附树脂柱(内径2cm，长12cm)上，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30ml洗脱，弃去40%乙醇洗脱液，继用70%乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每Iml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10 μ 1、对照品溶液4 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40: 5: 10: 0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在100°C加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。 实施例4:黄芪与人参的薄层鉴别。取黄苗甲苷、人参阜苷Rgl对照品，加甲醇分别制成每Iml含lmg、2mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述对照品溶液各2 μ 1、实施例3的供试品溶液4 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(8: I: I)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在100°C加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点及荧光斑点。实施例5:川芎的薄层鉴别。取实施例1药物内容物10g，加乙醚30ml，超声处理10分钟，滤过，滤液挥干，残渣加三氯甲烷Iml使溶解，作为供试品溶液。另取川芎对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液5 μ 1、对照药材溶液 μ ，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(9: I)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。实施例6:丹参的薄层鉴别。取实施例1药物内容物5g，加水20ml，超声处理5分钟，离心，取上清液，加稀盐酸调节pH至2，加乙酸乙酯20ml，振摇提�。崛∫褐盟∩险舾桑性蛹状�2ml使溶解，作为供试品溶液。另取丹参对照药材0.5g，加水适量，煎煮半小时，滤过，滤液浓缩至约10ml，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液2 μ 1、对照药材溶液I μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(8: I: I)为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏后，放置过夜，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。实施例7:土鳖虫的薄层鉴别。取实施例1药物内容物5g，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液。另取土鳖虫对照药材lg，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液2 μ 1、对照药材溶液5μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-二氯甲烷-丙酮(5: 5: 0.5)为展开齐IJ，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸试液，105°C加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。 实施例8:肉桂的薄层鉴别。取实施例1药物内容物20g，加乙醇40ml，冷浸20分钟，时时振�。斯艘夯痈桑右掖糏ml使溶解，作为供试品溶液。另取肉桂对照药材2g，同法制成对照药材溶液。再取桂皮醛对照品，加乙醇制成每Iml含1μ I的对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液15 μ 1、对照药材溶液2 μ 1、对照品溶液2 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60-90°C)-乙酸乙酯(17: 3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。实施例9:冰片的薄层鉴别。取实施例1药物内容物5g，加三氯甲烷30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液挥干，加氯仿Iml使溶解，作为供试品溶液。另取冰片对照药材适量，加三氯甲烷制成每Iml含IOmg的对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10 μ 1、对照药材溶液6 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(17: 3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸试液，105°C加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。实施例10:何首乌的薄层鉴别。取实施例1药物内容物5g，加乙酸乙酯20ml、浓盐酸0.5ml，超声处理20分钟，滤过，滤液挥干，加乙酸乙酯Iml使溶解，作为供试品溶液。另取何首乌对照药材0.1g,同法制成对照药材溶液。再取大黄素对照品，加甲醇制成每Iml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液15 μ 1、对照药材溶液5 μ 1、对照品溶液2 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20: 2: I)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。实施例11:黄芪甲苷含量的测定。参照原标准，以薄层扫描法测定黄芪中的黄芪甲苷含量。取实施例1药物内容物，研细，混匀，取约10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，回收甲醇至干，残渣趁热用水40ml溶解，转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取3次，依次为20、15、10ml，弃去乙醚液，水液继用水饱和的正丁醇提取4次，每次15ml，合并正丁醇液，用0.5%氢氧化钠溶液洗涤3次，每次20ml，弃去碱液，用正丁醇饱和的水洗涤至中性(每次20ml，2-3次)，弃去水洗液，正丁醇蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每Iml含0.5mg的对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，精密吸取供试品溶液10 μ 1、对照品溶液2 μ I与4 μ 1，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(65: 35: 10)10°C以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在100°C加热至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B薄层扫描法)进行扫描，波长:λ S=520nm, λ R=650nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。每�：栖我曰栖渭总�(C41H68O14)计，不少于0.06mgo实施例11:丹参素含量的测定。原质量标准中仅采用薄层扫描法测定黄芪中黄芪甲苷的含量，为进一步准确控制芪蛭通络胶囊质量，依据芪蛭通络胶囊功能主治及药材投药量，选择丹参与赤芍两味药材，采用HPLC法对其有效成分进行含量测定，其中丹参选择丹参素为指标，赤芍选择芍药苷为指标。1、仪器与试药。Agilent高效液相色谱仪，AgilentllOO化学工作站；KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；电子天平(德国赛多利斯BP211D);甲醇为色谱纯(天津市四友精细化学品有限公司);水为双蒸水；其它化学试剂均为分析纯；丹参素钠对照品(供含测用，批号:110855-200809)由中国药品生物制品检定所提供。2、色谱条件。色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，4.6mm X 250mm ;柱温:室温；流动相:1%冰醋酸-甲醇(94: 6);流速检测波长280nm。理论板数按丹参素钠峰计算应不低于3000。3、对照品溶液的制备。精密称取丹参素钠对照品，加50%甲醇制成每Iml含0.15mg的溶液(相当于每Iml含丹参素0.135mg)，即得。4、供试品溶液的制备。取芪蛭通络胶囊内容物，研细，混匀，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸溶液(I — 50) 50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率150W，频率40kHz) 30分钟，放冷，再称定重量，用盐酸溶液(I — 50)补足减失的重量，摇匀，加入氯化钠5g，摇匀，离心，精密量取上清液25ml，置分液漏斗中，用乙酸乙酯振摇提取4次(50，30，20，20ml),合并乙酸乙酯液，回收乙酸乙酯至干，残渣用50%甲醇溶解，转移至IOml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μ m)滤过，取续滤液，即得。5、丹参素含量的测定。
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。制剂每�：げ我缘げ嗡�(C9HltlO5)计，不得少于0.15mg。6、阴性样品试验。按芪蛭通络胶囊处方制备不含丹参的阴性制剂，按供试品溶液制备方法进行提取、测定。在确定的色谱条件下，分别记录丹参素对照品、供试品及阴性对照品的色谱图，图谱结果表明:在与丹参素钠保留时间的相对应处，阴性对照品色谱图中无色谱峰出现，即在确定的测定条件下，制剂处方中其他药味对丹参的测定无干扰。7、线性关系的考察。精密称取丹参素钠对照品，加50%甲醇制成每Iml含0.1633mg的溶液。分别精密吸取1、2.5、5、10、15、20μ I进样，依法测定(见表1)，以丹参素钠(μ g)为横坐标，峰面积积分值(A)为纵坐标计算得回归方程:y=648.67x-3.5208，r=l。表明丹参素钠含量在
0.1633 μ g-3.2666 μ g范围内具有良好的线性关系。
权利要求
1.芪蛭通络胶囊的质量控制方法，所述芪蛭通络胶囊是由以下原料药制备而成的药物:黄芪、水蛭、人参、麦冬、五味子、当归、川芎、毛冬青、赤芍、鸡血藤、丹参、制何首乌、红花、泽兰、土鳖虫、地龙、僵蚕、郁金、姜黄、全蝎、天麻、肉桂、羌活、猪牙皂、胆南星、冰片，所述质量控制方法中的鉴别方法包括如下鉴别: 1)取所述药物内容物5g，加硅藻土3g，充分混匀，加甲醇30ml，超声处理20分钟，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加水30ml使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次20ml，水溶液备用，合并乙醚提取液，挥去乙醚，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液；另取水蛭对照药材1.5g，加甲醇IOml，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至Iml，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液3μ 1、对照药材溶液2μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷:甲醇=40:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在100°C加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点； 2)取I)项下乙醚提取后的水溶液，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，3次分别为20ml、IOml、IOml，合并正丁醇提取液，用氨试液提取3次，每次15ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水3ml使溶解，加于内径2cm，长12cm的DlOl型大孔吸附树脂柱上，以水50ml洗脱，弃去水液,再用40%乙醇30ml洗脱，弃去40%乙醇洗脱液，继用70%乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加乙醇制成每Iml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10 μ 1、对照品溶液4μ I,分别点于同一娃胶G薄层板上，以三氯甲烧:乙酸乙酯:甲醇:甲酸=40:5:10:0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在100°C加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点； 3)取黄芪甲苷、人参皂苷Rgl对照品，加甲醇分别制成每Iml含lmg、2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述对照品溶液各2 μ 1、2)项下供试品溶液4 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇:冰醋酸:水=8:1:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在100°C加热至斑点显色清晰，分别置日光及365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点及荧光斑点； 4)取所述药物内容物10g，加乙醚30ml，超声处理10分钟，滤过，滤液挥干，残渣加三氯甲烷Iml使溶解，作为供试品溶液；另取川芎对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5 μ 1、对照药材溶液I μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷:乙酸乙酯=9:1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点； 5)取所述药物内容物5g，加水20ml，超声处理5分钟，离心，取上清液，加稀盐酸调节PH至2，加乙酸乙酯20ml，振摇提取，提取液置水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取丹参对照药材0.5g，加水适量，煎煮半小时，滤过，滤液浓缩至约10ml，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液2 μ 1、对照药材溶液I μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷:丙酮:甲酸=8:1:1为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏后，放置过夜，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点； 其特征在于所述质量控制方法中的鉴别方法还包括如下鉴别: 6)取所述药物内容物5g，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液；另取土鳖虫对照药材lg，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液2 μ 1、对照药材溶液5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯:二氯甲烷:丙酮=5:5:0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸试液，105°C加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑占.7)取所述药物内容物20g，加乙醇40ml，冷浸20分钟，时时振摇，滤过，滤液挥干，加乙醇Iml使溶解，作为供试品溶液；另取肉桂对照药材2g，同法制成对照药材溶液；再取桂皮醛对照品，加乙醇制成每Iml含1μ I的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液·15 μ 1、对照药材溶液2 μ 1、对照品溶液2 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60_90°C石油醚:乙酸乙酯=17:3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点； 8)取所述药物内容物5g，加三氯甲烷30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液挥干，加氯仿Iml使溶解，作为供试品溶液；另取冰片对照药材适量，加三氯甲烷制成每Iml含IOmg的对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10 μ 1、对照药材溶液6 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷:乙酸乙酯=17:3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸试液，105°C加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点； 9)取所述药物内容物5g， 加乙酸乙酯20ml、浓盐酸0.5ml，超声处理20分钟，滤过，滤液挥干，加乙酸乙酯Iml使溶解，作为供试品溶液；另取何首乌对照药材0.1g,同法制成对照药材溶液；再取大黄素对照品，加甲醇制成每Iml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液15 μ 1、对照药材溶液5 μ 1、对照品溶液2 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯:乙酸乙酯:甲酸=20:2:1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2.根据权利要求1所述的芪蛭通络胶囊的质量控制方法，其特征在于所述质量控制方法中的含量测定方法包括黄芪甲苷含量、丹参素含量和芍药苷含量的测定。
3.根据权利要求2所述的芪蛭通络胶囊的质量控制方法，其特征在于以下述薄层扫描法测定所述黄芪甲苷的含量: 1)对照品溶液的制备:精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每Iml含0.5mg的对照品溶液； 2)供试品溶液的制备:取所述药物内容物，研细，混匀，取10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，回收甲醇至干，残渣趁热用水40ml溶解，转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取3次，每次用量分别为20、15、IOml，弃去乙醚液，水液继用水饱和的正丁醇提取4次，每次15ml，合并正丁醇液，用0.5%氢氧化钠溶液洗涤3次，每次20ml，弃去碱液，用正丁醇饱和的水洗涤至中性，弃去水洗液，正丁醇蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液； 3)精密吸取供试品溶液10μ 1、对照品溶液2 μ I与4 μ 1，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷:甲醇:水=65:35:10混合溶液10°C以下放置过夜的下层溶液为展开齐U，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在100°C加热至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，以波长XS=520nm、λ R=650nm进行扫描，测量供试品吸收度的积分值与对照品吸收度的积分值，计算，即得。
4.根据权利要求2所述的芪蛭通络胶囊的质量控制方法，其特征在于以下述高效液相色谱法测定所述丹参素的含量: 1)色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以1%冰醋酸:甲醇=94:6为流动相；检测波长280nm ;理论板数按丹参素钠峰计算不低于3000 ； 2)对照品溶液的制备:精密称取丹参素钠对照品，加50%甲醇制成每Iml含0.135mg丹参素的对照品溶液； 3)供试品溶液的制备:取所述药物内容物，研细，混匀，取4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入2%盐酸溶液50ml，密塞，称定重量，功率150W、频率40kHz超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用2%盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，加入氯化钠5g，摇匀，离心，精密量取上清液25ml，置分液漏斗中，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次用量分别为50、30、20、20ml，合并乙酸乙酯液，回 收乙酸乙酯至干，残渣用50%甲醇溶解，转移至IOml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用0.45 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得； 4)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.根据权利要求2所述的芪蛭通络胶囊的质量控制方法，其特征在于以下述高效液相色谱法测定所述芍药苷的含量: 1)色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈:0.1%磷酸=16:84为流动相；检测波长230nm,理论板数按苟药苷峰计算不低于3000 ； 2)对照品溶液的制备:精密称取芍药苷对照品，加50%甲醇制成每Iml含0.1mg的对照品溶液； 3)供试品溶液的制备:取所述药物内容物，研细，混匀，取4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，功率150W、频率40kHz超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得； 4)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ1，注入液相色谱仪，测定，即得。
全文摘要
本发明公开了芪蛭通络胶囊的质量控制方法，分别以薄层色谱法鉴别药物中的水蛭、赤芍、黄芪、人参、川芎、丹参、土鳖虫、肉桂、冰片和何首乌，以薄层扫描法测定药物中的黄芪甲苷含量，以液相色谱法测定药物中的丹参素和芍药苷含量。本发明建立的质量控制方法中，药材鉴别方法成熟可行，专属性强，阴性无干扰，含量测定方法操作容易，精密度高，重现性好，使用本发明的质量控制方法能够精确、稳定地控制药物的质量，以适应药物的工业化稳定生产。
文档编号G01N30/02GK103197027SQ201310110680
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月1日 优先权日2013年4月1日
发明者王六贵, 吕建英 申请人:山西振东开元制药有限公司
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