专利名称：具有α－糖苷酶抑制活性的龙血竭提取物及其制剂的质量控制方法
技术领域：
本发明涉及一种具有α-糖苷酶抑制活性的龙血竭提取物及其制剂的质量控制方法，其中包括鉴别法和含量测定方法，属新药质量检测控制方法技术领域。
背景技术：
糖尿病是以血糖升高为临床特点的代谢内分泌疾病。糖尿病可分为I型和II型，对于II型糖尿病的治疗，α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类具有降低餐后血糖、调节并改善糖代谢异常的有效药物之一。
本课题组在大量实验的基础上，以抑制α-糖苷酶生物活性功能为指导，从龙血竭全粉中有针对性地提取分离得到了具有很强α-糖苷酶抑制活性的降血糖提取物，该提取物对实验动物体内降血糖试验的良好结果，为取得具有自主知识产权的降血糖中药新药奠定了基础。
为了完善龙血竭提取物及其制剂的临床前研究成果，保证具有α-糖苷酶抑制活性的龙血竭提取物及其制剂的质量，本课题组研究并建立了龙血竭提取物及其制剂的质量控制方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种具有α-糖苷酶抑制活性的龙血竭降血糖提取物及其制剂的质量控制方法。
本发明的质量控制方法包括鉴别方法和含量测定方法。
1.具有α-糖苷酶抑制活性的龙血竭提取物的质量控制方法之一--鉴别法A.高效液相色谱鉴别法以剑叶龙血素A(4’-羟基-2，6-二甲氧基双氢查耳酮)、剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4‘-羟苄基)色原烷]和龙血素B(4‘-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)为高效液相色谱鉴别法的对照品；a.供试品溶液配制取本品细粉适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含本品0.05-0.5mg的溶液，并经微孔(0.45μm)滤膜滤过；
b.对照品溶液的配制精密称取对照品剑叶龙血素A适量，加甲醇制成每1ml含0.001-0.005mg的溶液作为对照品剑叶龙血素A溶液；精密称取对照品剑叶龙血素B适量，加甲醇制成每1ml含0.001-0.005mg的溶液作为对照品剑叶龙血素B溶液；精密称取对照品龙血素B适量，加甲醇制成每1ml含0.0001-0.001mg的溶液作为对照品龙血素B溶液；精密称取剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B适量，加甲醇制成每1ml含剑叶龙血素A 0.001-0.005mg、剑叶龙血素B 0.001-0.005mg和龙血素B 0.0001-0.001mg的混合溶液作为混合对照品溶液；c.色谱条件与系统适用性试验上述三种对照品溶液及其混合溶液，用高效液相色谱仪测定，色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为(30-40)∶(4-6)∶(66-54)乙腈-甲醇-磷酸二氢钾(0.05mol/L)水溶液洗脱，检测波长为280nm，理论塔板数按剑叶龙血素A，剑叶龙血素B，龙血素B峰计算，各不低于3000，三种对照品与相邻峰的分离度≥1.5；d.鉴别步骤分别精密吸取对照品溶液、对照品混合溶液与供试品溶液各2-30μl，注入高效液相色谱仪测定，得各自色谱图，确定剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B各自的保留时间，在供试品色谱图中与上述三种对照品相应色谱的保留时间处出现色谱峰，相对应的色谱峰保留时间的相对误差不超过2％，且供试品中剑叶龙血素B∶剑叶龙血素A∶龙血素B峰面积之比为(0.5-2.0)∶(4-6)∶(0.5-2.5)；B.薄层色谱鉴别法以7，4’-二羟基黄酮、剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4‘-羟苄基)色原烷]和龙血素B(4‘-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)为薄层色谱鉴别法的对照品；a.供试品溶液的配制取供试品细粉适量，加甲醇溶解，制成每1ml含本品0.5-2.0mg的溶液，作为供试品溶液；b.7，4’-二羟基黄酮薄层色谱鉴别取7，4’-二羟基黄酮对照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作为对照品溶液。用薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液2-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上以(18-25)∶1醋酸乙酯-甲醇为展开剂，展开后，晾干，置于紫外光365nm波长处检视，在供试品薄层色谱中，与对照品相应色谱的斑点位置上显相同颜色的荧光斑点；c.剑叶龙血素B薄层色谱鉴别取剑叶龙血素B对照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作为对照品溶液。用薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液2-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，(1-5)∶2醋酸乙酯-石油醚为展开剂，展开后，晾干，置于紫外光254nm波长处检视，在供试品薄层色谱中，与对照品相应色谱的斑点位置上显相同颜色的荧光斑点；d.龙血素B薄层色谱鉴别取龙血素B对照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作为对照品溶液。用薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液2-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上以(0.5-2.0)∶1丙酮-石油醚为展开剂，展开后，晾干，置于紫外光254nm波长处检视，在供试品薄层色谱中，与对照品相应色谱的斑点位置上显相同颜色的荧光斑点。
2.具有α-糖苷酶抑制活性的龙血竭提取物的质量控制方法之二----含量测定法以龙血素B(4‘-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)、7，4’-二羟基黄酮和剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4‘-羟苄基)色原烷]为含量测定的对照品。分别代表查耳酮、黄酮和黄烷等黄酮类化合物。前两者用紫外分光光度法后者用荧光分析法进行含量测定；a.供试品溶液的配制取供试品细粉适量，精密称定，加甲醇配制成每1ml含本品1-2mg，摇匀，精密量取1.0ml，置于25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液；b.对照品龙血素B和7，4’-二羟基黄酮标准溶液的浓度与吸收度线性回归方程的获取(1)龙血素B标准溶液的浓度与吸收度线性回归方程的获取精密称取龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.05-1.00mg的对照品溶液，摇匀，精密量取1.0ml、.0ml、3.0ml、4.0ml和5.0ml，分别置于25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；组成不同浓度x的标准系列溶液，用分光光度法在275nm波长处分别测定标准系列溶液相应的吸收度y，求得吸收度y与浓度x的线性回归方程以及相关系数r，r不低于0.99；(2)7，4’-二羟基黄酮标准溶液的浓度与吸收度线性回归方程的获取精密称取7，4’-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.05-1.00mg的对照品溶液，摇匀；精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml和4.0ml分别置于25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；组成不同浓度x的标准系列溶液，用分光光度法在330nm波长处，分别测定标准系列溶液相应的吸收度y，求得吸收度y与浓度x的线性回归方程以及相关系数r，r不低于0.99；c.对照品剑叶龙血素B标准溶液的浓度与荧光强度线性回归方程的获取；剑叶龙血素B标准溶液的浓度与荧光强度线性回归方程的获取精密称取剑叶龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.01-0.05mg的对照品溶液，摇匀，精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml和4.0ml，分别置于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，组成不同浓度x的标准系列溶液。用荧光分析法分析。在激发波长320nm、发射波长355nm处，分别测定标准系列溶液相应的荧光强度y，求得荧光强度y与浓度x的线性回归方程以及相关系数r，r不低于0.99；d.含量测定步骤用分光光度法，在275nm和330nm波长处测定供试品溶液的吸收值，分别从各自的线性回归方程中，求得龙血素B与7，4’-二羟基黄酮的重量；用荧光分析法在激发波长320nm发射波长355nm处测定供试品溶液的荧光强度，在剑叶龙血素线性回归方程中求得剑叶龙血素B的重量；本品以龙血素B、7，4’-二羟基黄酮和剑叶龙血素B三者重量之和计算，含量不少于总称量的50％。
3.具有α-糖苷酶抑制活性的龙血竭提取物制剂胶囊的质量控制方法之一---鉴别法A.高效液相色谱鉴别法以剑叶龙血素A(4’-羟基-2，6-二甲氧基双氢查耳酮)、剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4‘-羟苄基)色原烷]和龙血素B(4‘-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)为高效液相色谱鉴别法的对照品；a.试品溶液配制取本品胶囊内容物细粉适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含本品0.05-0.5mg的溶液，滤过，弃初滤液，取续滤液并再经微孔(0.45μm)滤膜滤过；b.对照品溶液的配制精密称取对照品剑叶龙血素A适量，加甲醇制成每1ml含0.001-0.005mg的溶液作为对照品剑叶龙血素A溶液；精密称取对照品剑叶龙血素B适量，加甲醇制成每1ml含0.001-0.005mg的溶液作为对照品剑叶龙血素B溶液；精密称取对照品龙血素B适量，加甲醇制成每1ml含0.0001-0.001mg的溶液作为对照品龙血素B溶液；精密称取剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B适量，加甲醇制成每1ml含剑叶龙血素A 0.001-0.005mg、剑叶龙血素B 0.001-0.005mg和龙血素B 0.0001-0.001mg的混合溶液作为混合对照品溶液；c.色谱条件与系统适用性试验上述三种对照品溶液及其混合溶液，用高效液相色谱仪测定，色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为(30-40)∶(4-6)∶(66-54)乙腈-甲醇-磷酸二氢钾(0.05mol/L)水溶液洗脱，检测波长为280nm，理论塔板数按剑叶龙血素A，剑叶龙血素B，龙血素B峰计算，各不低于3000，三种对照品与相邻峰的分离度≥1.5；d.鉴别步骤分别精密吸取对照品溶液、对照品混合溶液与供试品溶液各2-30μl，注入高效液相色谱仪测定，得各自色谱图，确定剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B各自的保留时间，在供试品色谱图中与上述三种对照品相应色谱的保留时间处出现色谱峰，相对应的色谱峰保留时间的相对误差不超过2％，且供试品中剑叶龙血素B∶剑叶龙血素A∶龙血素B峰面积之比为(0.5-2.0)∶(4-6)∶(0.5-2.5)；B.薄层色谱鉴别法以7，4’-二羟基黄酮、剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4‘-羟苄基)色原烷]和龙血素B(4‘-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)为薄层色谱鉴别法的对照品；a.供试品溶液配制取本品胶囊中内容物细粉适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含本品0.05-0.5mg的溶液，滤过，弃初滤液，取续滤液；b.7，4’-二羟基黄酮薄层色谱鉴别取7，4’-二羟基黄酮对照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作为对照品溶液。用薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液2-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上以(18-25)∶1醋酸乙酯-甲醇为展开剂，展开后，晾干，置于紫外光365nm波长处检视，在供试品薄层色谱中，与对照品相应色谱的斑点位置上显相同颜色的荧光斑点；c.剑叶龙血素B薄层色谱鉴别取剑叶龙血素B对照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作为对照品溶液。用薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液2-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，(1-5)∶2醋酸乙酯-石油醚为展开剂，展开后，晾干，置于紫外光254nm波长处检视，在供试品薄层色谱中，与对照品相应色谱的斑点位置上显相同颜色的荧光斑点；d.龙血素B薄层色谱鉴别取龙血素B对照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作为对照品溶液。用薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液2-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上以(0.5-2.0)∶1丙酮-石油醚为展开剂，展开后，晾干，置于紫外光254nm波长处检视，在供试品薄层色谱中，与对照品相应色谱的斑点位置上显相同颜色的荧光斑点。
4.具有α-糖苷酶抑制活性的龙血竭提取物制剂胶囊的质量控制方法之二----含量测定法以龙血素B(4‘-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)、7，4’-二羟基黄酮和剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4‘-羟苄基)色原烷]为含量测定的对照品。分别代表查耳酮、黄酮和黄烷等黄酮类化合物。前两者用紫外分光光度法后者用荧光分析法进行含量测定；a.供试品溶液的配制取本品胶囊内容物适量，精密称定，加甲醇配制成每1ml含本品1-2mg，滤过，弃初滤液，取续滤液1.0ml，置于25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液。
b.对照品龙血素B和7，4’-二羟基黄酮标准溶液的浓度与吸收度线性回归方程的获取(1)龙血素B标准溶液的浓度与吸收度线性回归方程的获取精密称取龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.05-1.00mg的对照品溶液，摇匀，精密量取1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml和5.0ml，分别置于25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；组成不同浓度x的标准系列溶液，用分光光度法在275nm波长处分别测定标准系列溶液相应的吸收度y，求得吸收度y与浓度x的线性回归方程以及相关系数r，r不低于0.99；(2)7，4’-二羟基黄酮标准溶液的浓度与吸收度线性回归方程的获取精密称取7，4’-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.05-1.00mg的对照品溶液，摇匀；精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml和4.0ml分别置于25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；组成不同浓度x的标准系列溶液，用分光光度法在330nm波长处，分别测定标准系列溶液相应的吸收度y，求得吸收度y与浓度x的线性回归方程以及相关系数r，r不低于0.99；c.对照品剑叶龙血素B标准溶液的浓度与荧光强度线性回归方程的获�。唤Ｒ读谺标准溶液的浓度与荧光强度线性回归方程的获取精密称取剑叶龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.01-0.05mg的对照品溶液，摇匀，精密量取0.5ml1、1.0ml、2.0ml、3.0ml和4.0ml，分别置于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，组成不同浓度x的标准系列溶液。用荧光分析法分析。在激发波长320nm、发射波长355nm处，分别测定标准系列溶液相应的荧光强度y，求得荧光强度y与浓度x的线性回归方程以及相关系数r，r不低于0.99；d.含量测定步骤用分光光度法，在275nm和330nm波长处测定供试品溶液的吸收值，分别从各自的线性回归方程中，求得龙血素B与7，4’-二羟基黄酮的重量；用荧光分析法在激发波长320nm发射波长355nm处测定供试品溶液的荧光强度，在剑叶龙血素线性回归方程中求得剑叶龙血素B的重量；本品每粒胶囊内容物以龙血素B、7，4‘-二羟基黄酮和剑叶龙血素B三者之和计算，三者重量之和不少于[每粒胶囊内容物标示量×(1-药剂辅料％)]的50％。
本发明的质量控制方法的几点说明(1)鉴别法包括高效液相色谱鉴别法和薄层色谱鉴别法，具体检测鉴别时，可采用两种鉴别方法中之任一个。
(2)含量测定法为分光光度法和荧光分析法的联合测定方法。
(3)在本发明质量控制方法中所涉及的对照品及龙血竭提取物供试品皆经过60℃减压干燥至恒重预处理操作步骤。
(4)本发明质量控制方法适用于龙血竭提取物制剂的质量控制。
具体实施例方式
现将龙血竭提取物及其制剂的各种质量控制方法具体叙述于后。
实施例1具有α-糖苷酶抑制活性的龙血竭提取物的高效液相色谱鉴别法以剑叶龙血素A(4’-羟基-2，6-二甲氧基双氢查耳酮)、剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4‘-羟苄基)色原烷]和龙血素B(4‘-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)为高效液相色谱鉴别法的对照品。
(1)供试品溶液配制取本品细粉10mg，精密称定，加甲醇制成每1ml含本品0.1mg的溶液，并经微孔(0.45μm)滤膜滤过。
(2)对照品溶液的配制精密称取对照品剑叶龙血素A适量，加甲醇制成每1ml含0.002mg的溶液作为对照品剑叶龙血素A溶液；精密称取对照品剑叶龙血素B适量，加甲醇制成每1ml含0.002mg的溶液作为对照品剑叶龙血素B溶液；精密称取对照品龙血素B适量，加甲醇制成每1ml含0.0005mg的溶液作为对照品龙血素B溶液；精密称取剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B适量，加甲醇制成每1ml含剑叶龙血素A 0.002mg、剑叶龙血素B 0.002mg和龙血素B 0.0005mg的混合溶液作为混合对照品溶液。
(3)色谱条件与系统适用性试验上述三种对照品溶液及其混合溶液，照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定，色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为30∶5∶65乙腈-甲醇-磷酸二氢钾(0.05mol/L)水溶液洗脱，检测波长为280nm，理论塔板数按剑叶龙血素A计算为11000，按剑叶龙血素B计算为4500，按龙血素B峰计算为9100，各不低于3000。三种对照品与相邻峰的分离度最少为1.7。
(4)鉴别步骤分别精密吸取对照品溶液、对照品混合溶液与供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定，得各自色谱图，确定剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B各自的保留时间，在供试品色谱图中与上述三种对照品相应色谱的保留时间处出现色谱峰，相对应的色谱峰保留时间的相对误差不超过2％，且供试品中剑叶龙血素B∶剑叶龙血素A∶龙血素B峰面积之比应为1∶5.5∶1.2。
实施例2具有α-糖苷酶抑制活性的龙血竭提取物的薄层鉴别法以7，4’-二羟基黄酮、剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4‘-羟苄基)色原烷]和龙血素B(4‘-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)为薄层色谱鉴别法的对照品。
(1)供试品溶液配制取供试品细粉适量，加甲醇使解，制成每1ml含本品1.0mg的溶液，作为供试品溶液。
(2)7，4’-二羟基黄酮薄层色谱鉴别取7，4’-二羟基黄酮对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取对照品溶液和供试品溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上以20∶1醋酸乙酯-甲醇为展开剂，展开后，晾干，置于紫外光365nm波长检视，在供试品薄层色谱中，与对照品相应色谱的斑点位置上显相同颜色的荧光斑点。
(3)剑叶龙血素B薄层色谱鉴别取剑叶龙血素B对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以3∶2醋酸乙酯-石油醚为展开剂，展开后，晾干，置于紫外光254nm波长检视，在供试品薄层色谱中，与对照品相应色谱的斑点位置上显相同颜色的荧光斑点。
(4)龙血素B薄层色谱鉴别取龙血素B对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上以1∶1丙酮-石油醚为展开剂，展开后，晾干，置于紫外光254nm波长检视，在供试品薄层色谱中，与对照品相应色谱的斑点位置上显相同颜色的荧光斑点。
实施例3具有α-糖苷酶抑制活性的龙血竭提取物的含量测定以龙血素B(4‘-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)、7，4’-二羟基黄酮和剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4‘-羟苄基)色原烷]为含量测定的对照品。分别代表查耳酮、黄酮和黄烷等黄酮类化合物。前两者用紫外分光光度法后者用荧光分析法进行定量测定。
(1)供试品溶液的配制取本品细粉30mg，精密称定，加甲醇配制成每1ml含本品1.0mg，摇匀，精密量取1.0ml，置于25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液。
(2)对照品龙血素B和7，4’-二羟基黄酮标准溶液浓度与吸收度线性回归方程的获取龙血素B标准溶液的浓度与吸收度线性回归方程的获取取龙血素B对照品10mg，加甲醇制成每1ml含0.1mg的对照品溶液，摇匀，精密量取1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml和5.0ml，分别置于25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；组成不同浓度x的标准系列溶液。照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VD)在波长275nm处分别测定标准系列溶液相应的吸收度y，求得吸收度y与浓度x的线性回归方程以及相关系数r，r不低于0.99。
7，4’-二羟基黄酮标准溶液的浓度与吸收度线性回归方程的获取取7，4’-二羟基黄酮对照品10mg，加甲醇制成每1ml含0.1mg的对照品溶液，摇匀；精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml和4.0ml分别置于25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；组成不同浓度x的标准系列溶液。照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V)在330nm波长处，分别测定标准系列溶液相应的吸收度y，求得吸收度y与浓度x的线性回归方程以及相关系数r，r不低于0.99。
(3)对照品剑叶龙血素B标准溶液浓度与荧光强度线性回归方程的获取剑叶龙血素B标准溶液的浓度与荧光强度线性回归方程的获取取剑叶龙血素B对照品10mg，加甲醇制成每1ml含0.02mg的对照品溶液，摇匀，精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml，3.0ml和4.0ml，分别置于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，组成不同浓度x的标准系列溶液。照荧光分析法(中国药典2000年版二部附录IVE)分析。在激发波长320nm、发射波长355nm处，分别测定标准系列溶液相应的荧光强度y，求得荧光强度y与浓度x的线性回归方程以及相关系数r，r不低于0.99。
(4)含量测定步骤照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V)，在275nm和330nm波长处测定供试品溶液的吸收值，分别从各自的线性回归方程中，求得龙血素B与7，4’-二羟基黄酮的质量；照荧光分析法(中国药典2000年版二部附录IVE)，在激发波长320nm发射波长355nm处测定供试品溶液的荧光强度，在剑叶龙血素线性回归方程中求得剑叶龙血素B的质量。
本品以7，4’-二羟基黄酮、龙血素B、剑叶龙血素B三者之和计算，含量为15.5mg不少于15mg。[注称量(30mg)×50％＝15mg]。
实施例4具有α-糖苷酶抑制活性的龙血竭提取物胶囊的高效液相色谱鉴别方法以剑叶龙血素A(4’-羟基-2，6-二甲氧基双氢查耳酮)、剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4‘-羟苄基)色原烷]和龙血素B(4‘-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)为高效液相色谱鉴别法的对照品。
(1)供试品溶液配制取本品胶囊中内容物细粉适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含本品0.1mg的溶液，滤过，弃初滤液，取续滤液并再经微孔(0.45μm)滤膜滤过。
(2)对照品溶液的配制与实施例1项下的“(2)对照品溶液的配制”相同。
(3)色谱条件与系统适用性试验与实施例1项下的“(3)色谱条件与系统适用性试验”相同。
(4)鉴别步骤与实施例1项下的“(4)鉴别步骤相同。
实施例5具有α-糖苷酶抑制活性的龙血竭提取物胶囊的薄层色谱鉴别方法以7，4’-二羟基黄酮、剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4‘-羟苄基)色原烷]和龙血素B(4‘-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)为薄层色谱鉴别法的对照品。
(1)供试品溶液配制取本品胶囊中内容物细粉适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含本品1.0mg的溶液，滤过，弃初滤液，取续滤液。
(2)7，4’-二羟基黄酮薄层色谱鉴别与实施例2项下的“(2)7，4’-二羟基黄酮薄层色谱鉴别”相同。
(3)剑叶龙血素B薄层色谱鉴别与实施例2项下的“(3)剑叶龙血素B薄层色谱鉴别”相同。
(4)龙血素B薄层色谱鉴别与实施例2项下的“(4)龙血素B薄层色谱鉴别”相同。
实施例6具有α-糖苷酶抑制活性的龙血竭提取物胶囊的含量测定方法以龙血素B(4‘-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)、7，4’-二羟基黄酮和剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4‘-羟苄基)色原烷]为含量测定的对照品。分别代表查耳酮、黄酮和黄烷等黄酮类化合物。前两者用紫外分光光度法后者用荧光分析法进行定量测定。
(1)供试品溶液的配制取本品胶囊内容物30mg，精密称定，置于25ml容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃初滤液，取续滤液1.0ml，置于25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
(2)对照品龙血素B和7，4’-二羟基黄酮标准溶液浓度与吸收度线性回归方程的获取与实施例3项下的“(2)对照品龙血素B和7，4’-二羟基黄酮标准溶液浓度与吸收度线性回归方程的获取”相同。
(3)对照品剑叶龙血素B标准溶液浓度与荧光强度线性回归方程的获取与实施例3项下的“(3)对照品剑叶龙血素B标准溶液浓度与荧光强度线性回归方程的获取”相同。
(4)含量测定步骤含量测定步骤与实施例3项下的“(4)含量测定步骤”相同。本品每粒胶囊内容物以7，4‘-二羟基黄酮，龙血素B与剑叶龙血素B三者之和计算，三者重量之和为171mg，大于167mg[注胶囊内容物标示量(370mg)×(1-10％)×50％＝166.5mg]。
权利要求
1.具有α-糖苷酶抑制活性的龙血竭提取物的质量控制方法之一---鉴别法A.高效液相色谱鉴别法以剑叶龙血素A(4’-羟基-2，6-二甲氧基双氢查耳酮)、剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4’-羟苄基)色原烷]和龙血素B(4’-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)为高效液相色谱鉴别法的对照品；a.供试品溶液配制取本品细粉适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含本品0.05-0.5mg的溶液，并经微孔(0.45μm)滤膜滤过；b.对照品溶液配制精密称取对照品剑叶龙血素A适量，加甲醇制成每1ml含0.001-0.005mg的溶液作为对照品剑叶龙血素A溶液；精密称取对照品剑叶龙血素B适量，加甲醇制成每1ml含0.001-0.005mg的溶液作为对照品剑叶龙血素B溶液；精密称取对照品龙血素B适量，加甲醇制成每1ml含0.0001-0.001mg的溶液作为对照品龙血素B溶液；精密称取剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B适量，加甲醇制成每1ml含剑叶龙血素A 0.001-0.005mg、剑叶龙血素B 0.001-0.005mg和龙血素B0.0001-0.001mg的混合溶液作为混合对照品溶液；c.色谱条件与系统适用性试验上述三种对照品溶液及其混合溶液，用高效液相色谱仪测定，色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为(30-40)∶(4-6)∶(66-54)乙腈-甲醇-磷酸二氢钾(0.05mol/L)水溶液洗脱，检测波长为280nm，理论塔板数按剑叶龙血素A，剑叶龙血素B，龙血素B峰计算，各不低于3000，三种对照品与相邻峰的分离度≥1.5；d.鉴别步骤分别精密吸取对照品溶液、对照品混合溶液与供试品溶液各2-30μl，注入高效液相色谱仪测定，得各自色谱图，确定剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B各自的保留时间，在供试品色谱图中与上述三种对照品相应色谱的保留时间处出现色谱峰，相对应的色谱峰保留时间的相对误差不超过2％，且供试品中剑叶龙血素B∶剑叶龙血素A∶龙血素B峰面积之比为(0.5-2.0)∶(4-6)∶(0.5-2.5)；B.薄层色谱鉴别法以7，4’-二羟基黄酮、剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4’-羟苄基)色原烷]和龙血素B(4’-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)为薄层色谱鉴别法的对照品；a.供试品溶液的配制取供试品细粉适量，加甲醇溶解，制成每1ml含本品0.5-2.0mg的溶液，作为供试品溶液；b.7，4’-二羟基黄酮薄层色谱鉴别取7，4’-二羟基黄酮对照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作为对照品溶液。用薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液2-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上以(18-25)∶1醋酸乙酯-甲醇为展开剂，展开后，晾干，置于紫外光365nm波长处检视，在供试品薄层色谱中，与对照品相应色谱的斑点位置上显相同颜色的荧光斑点；c.剑叶龙血素B薄层色谱鉴别取剑叶龙血素B对照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作为对照品溶液。用薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液2-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，(1-5)∶2醋酸乙酯-石油醚为展开剂，展开后，晾干，置于紫外光254nm波长处检视，在供试品薄层色谱中，与对照品相应色谱的斑点位置上显相同颜色的荧光斑点；d.龙血素B薄层色谱鉴别取龙血素B对照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作为对照品溶液。用薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液2-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上以(0.5-2.0)∶1丙酮-石油醚为展开剂，展开后，晾干，置于紫外光254nm波长处检视，在供试品薄层色谱中，与对照品相应色谱的斑点位置上显相同颜色的荧光斑点。
2.具有α-糖苷酶抑制活性的龙血竭提取物的质量控制方法之二---含量测定法以龙血素B(4’-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)、7，4’-二羟基黄酮和剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4’-羟苄基)色原烷]为含量测定的对照品。分别代表查耳酮、黄酮和黄烷等黄酮类化合物。前两者用紫外分光光度法后者用荧光分析法进行含量测定；a.供试品溶液的配制取供试品细粉适量，精密称定，加甲醇配制成每1ml含本品1-2mg，摇匀，精密量取1.0ml，置于25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液；b.对照品龙血素B和7，4’-二羟基黄酮标准溶液的浓度与吸收度线性回归方程的获取(1)龙血素B标准溶液的浓度与吸收度线性回归方程的获取精密称取龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.05-1.00mg的对照品溶液，摇匀，精密量取1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml和5.0ml，分别置于25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；组成不同浓度的标准系列溶液，用分光光度法在275nm波长处分别测定标准系列溶液相应的吸收度y，求得吸收度y与浓度x的线性回归方程以及相关系数r，r不低于0.99；(2)7，4’-二羟基黄酮标准溶液的浓度与吸收度线性回归方程的获取精密称取7，4’-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.05-1.00mg的对照品溶液，摇匀；精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml和4.0ml分别置于25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；组成不同浓度x的标准系列溶液，用分光光度法在330nm波长处，分别测定标准系列溶液相应的吸收度y，求得吸收度y与浓度x的线性回归方程以及相关系数r，r不低于0.99；c.对照品剑叶龙血素B标准溶液的浓度与荧光强度线性回归方程的获�。痪艹迫〗Ｒ读谺对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.01-0.05mg的对照品溶液，摇匀，精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml和4.0ml，分别置于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，组成不同浓度x的标准系列溶液。用荧光分析法分析。在激发波长320nm、发射波长355nm处，分别测定标准系列溶液相应的荧光强度y，求得荧光强度y与浓度x的线性回归方程以及相关系数r，r不低于0.99；d.含量测定步骤用分光光度法，在275nm和330nm波长处测定供试品溶液的吸收值，分别从各自的线性回归方程中，求得龙血素B与7，4’-二羟基黄酮的重量；用荧光分析法在激发波长320nm发射波长355nm处测定供试品溶液的荧光强度，在剑叶龙血素线性回归方程中求得剑叶龙血素B的重量；本品以龙血素B、7，4’-二羟基黄酮和剑叶龙血素B三者重量之和计算，含量不少于总称量的50％。
3.具有α-糖苷酶抑制活性的龙血竭提取物制剂胶囊的质量控制方法之一---鉴别法A.高效液相色谱鉴别法以剑叶龙血素A(4’-羟基-2，6-二甲氧基双氢查耳酮)、剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4’-羟苄基)色原烷]和龙血素B(4’-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)为高效液相色谱鉴别法的对照品；a.供试品溶液配制取本品胶囊内容物细粉适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含本品0.05-0.5mg的溶液，滤过，弃初滤液，取续滤液并再经微孔(0.45μm)滤膜滤过；b.对照品溶液的配制精密称取对照品剑叶龙血素A适量，加甲醇制成每1ml含0.001-0.005mg的溶液作为对照品剑叶龙血素A溶液；精密称取对照品剑叶龙血素B适量，加甲醇制成每1ml含0.001-0.005mg的溶液作为对照品剑叶龙血素B溶液；精密称取对照品龙血素B适量，加甲醇制成每1ml含0.0001-0.001mg的溶液作为对照品龙血素B溶液；精密称取剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B适量，加甲醇制成每1ml含剑叶龙血素A 0.001-0.005mg、剑叶龙血素B 0.001-0.005mg和龙血素B 0.0001-0.001mg的混合溶液作为混合对照品溶液；c.色谱条件与系统适用性试验上述三种对照品溶液及其混合溶液，用高效液相色谱仪测定，色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为(30-40)∶(4-6)∶(66-54)乙腈-甲醇-磷酸二氢钾(0.05mol/L)水溶液洗脱，检测波长为280nm，理论塔板数按剑叶龙血素A，剑叶龙血素B，龙血素B峰计算，各不低于3000，三种对照品与相邻峰的分离度≥1.5；d.鉴别步骤分别精密吸取对照品溶液、对照品混合溶液与供试品溶液各2-30μl，注入高效液相色谱仪测定，得各自色谱图，确定剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B各自的保留时间，在供试品色谱图中与上述三种对照品相应色谱的保留时间处出现色谱峰，相对应的色谱峰保留时间的相对误差不超过2％，且供试品中剑叶龙血素B∶剑叶龙血素A∶龙血素B峰面积之比为(0.5-2.0)∶(4-6)∶(0.5-2.5)；B.薄层色谱鉴别法以7，4’-二羟基黄酮、剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4’-羟苄基)色原烷]和龙血素B(4’-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)为薄层色谱鉴别法的对照品；a.供试品溶液配制取本品胶囊中内容物细粉适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含本品0.5-2.0mg的溶液，滤过，弃初滤液，取续滤液；b.7，4’-二羟基黄酮薄层色谱鉴别取7，4’-二羟基黄酮对照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作为对照品溶液。用薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液2-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上以(18-25)∶1醋酸乙酯-甲醇为展开剂，展开后，晾干，置于紫外光365nm波长处检视，在供试品薄层色谱中，与对照品相应色谱的斑点位置上显相同颜色的荧光斑点；c.剑叶龙血素B薄层色谱鉴别取剑叶龙血素B对照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作为对照品溶液。用薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液2-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，(1-5)∶2醋酸乙酯-石油醚为展开剂，展开后，晾干，置于紫外光254nm波长处检视，在供试品薄层色谱中，与对照品相应色谱的斑点位置上显相同颜色的荧光斑点；d.龙血素B薄层色谱鉴别取龙血素B对照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作为对照品溶液。用薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液2-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上以(0.5-2.0)∶1丙酮-石油醚为展开剂，展开后，晾干，置于紫外光254nm波长处检视，在供试品薄层色谱中，与对照品相应色谱的斑点位置上显相同颜色的荧光斑点。
4.具有α-糖苷酶抑制活性的龙血竭提取物制剂胶囊的质量控制方法之二---含量测定法以龙血素B(4’-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)、7，4’-二羟基黄酮和剑叶龙血素B[6-羟基-7-甲氧基-3-(4’-羟苄基)色原烷]为含量测定的对照品。分别代表查耳酮、黄酮和黄烷等黄酮类化合物。前两者用紫外分光光度法后者用荧光分析法进行含量测定；a.供试品溶液的配制取本品胶囊内容物适量，精密称定，加甲醇配制成每1ml含本品1-2mg，滤过，弃初滤液，取续滤液1.0ml，置于25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液；b.对照品龙血素B和7，4’-二羟基黄酮标准溶液的浓度与吸收度线性回归方程的获取(1)龙血素B标准溶液的浓度与吸收度线性回归方程的获取精密称取龙血素B对照品适量，加甲醇制成每lml含0.05-1.00mg的对照品溶液，摇匀，精密量取1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml和5.0ml，分别置于25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；组成不同浓度x的标准系列溶液，用分光光度法在275nm波长处分别测定标准系列溶液相应的吸收度y，求得吸收度y与浓度x的线性回归方程以及相关系数r，r不低于0.99；(2)7，4’-二羟基黄酮标准溶液的浓度与吸收度线性回归方程的获取精密称取7，4’-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成每lml含0.05-1.00mg的对照品溶液，摇匀；精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml和4.0ml分别置于25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；组成不同浓度x的标准系列溶液，用分光光度法在330nm波长处，分别测定标准系列溶液相应的吸收度y，求得吸收度y与浓度x的线性回归方程以及相关系数r，r不低于0.99；c.对照品剑叶龙血素B标准溶液的浓度与荧光强度线性回归方程的获取剑叶龙血素B标准溶液的浓度与荧光强度线性回归方程的获取精密称取剑叶龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.01-0.05mg的对照品溶液，摇匀，精密量取0.5ml，1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml和5.0ml，分别置于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，组成不同浓度x的标准系列溶液。用荧光分析法分析。在激发波长320nm、发射波长355nm处，分别测定标准系列溶液相应的荧光强度y，求得荧光强度y与浓度x的线性回归方程以及相关系数r，r不低于0.99；d.含量测定步骤用分光光度法，在275nm和330nm波长处测定供试品溶液的吸收值，分别从各自的线性回归方程中，求得龙血素B与7，4’-二羟基黄酮的重量；用荧光分析法在激发波长320nm发射波长355nm处测定供试品溶液的荧光强度，在剑叶龙血素线性回归方程中求得剑叶龙血素B的重量；A.本品每粒胶囊内容物以龙血素B、7，4’-二羟基黄酮和剑叶龙血素B三者之和计算，三者重量之和不少于[每粒胶囊内容物标示量×(1-药剂辅料％)]的50％。
全文摘要
本发明涉及一种具有α－糖苷酶抑制活性的龙血竭降血糖提取物及其制剂的质量控制方法。其中包括鉴别法和含量测定法，属新药质量检测控制方法技术领域。本发明质量控制方法中的鉴别法包括高效液相鉴别法和薄层色谱鉴别法；质量控制方法中的含量测定法是采用分光光度法和荧光分析法的联合测定的方法。本发明的质量控制方法，对血竭提取物的其他制剂也同样适用。
文档编号G01N33/15GK1745803SQ20051002823
公开日2006年3月15日 申请日期2005年7月28日 优先权日2005年7月28日
发明者吕敬慈, 雍克岚, 陈旭, 刘培培, 周晓惠, 顾慧娟, 栾梅, 张天宝 申请人:上海大学
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
