专利名称：免疫色谱法的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型的免疫色谱法。
背景技术：
近年来将血液作为被验试样使用的免疫色谱制品增加。可是，当将全血原样地免疫色谱展开时，通常给免疫色谱展开带来障碍。于是，必须预先从全血分离血浆或血清，除掉血球成分等。作为血浆/血清分离法，最一般的方法是离心分离法。可是，离心分离法需要离心设备，一般的临床医疗在诊断室使用的情况少。另外，也有使用过滤器分离血浆的方法(例如血浆过滤器；富士胶片公司)，但与离心分离法同样，需要时间，而且需要进一步的成本。另外，为了不引起堵塞、不使之溶血并确保必要量的血浆量，需要增大血浆过滤器的过滤面积，因此需要大量的全血。
于是，最近，开发了在免疫色谱带自身上设置了各种血浆/血清分离垫的方法。具体讲为这样的方法在免疫色谱带的全血样品供给部正下方设置上述分离垫，使血球成分保持在上述分离垫上，使血球成分短时间不流出到免疫色谱展开膜上，另一方面使血浆成分先行地向免疫色谱展开膜展开。
上述方法均在防止全血中的红血球破裂，不使之溶血就分离血浆成分上下了工夫。例如，血球捕捉膜使用了羧甲基纤维素膜的特开2002-214236号公报(专利文献1)、使用了丙醇和/或丙烯酰胺的特开2002-350428号公报(专利文献2)、或者使用了亲水性烧结多孔物质的专利第2940990号说明书(专利文献3)等很多的专利被申请或注册。均在防止溶血上有优点。原因是，当溶血作用时，包含免疫色谱展开膜的判定部分的膜全体着色变红，结果判定变得非常困难。
免疫色谱法以外，公知的是特意用表面活性剂等使全血溶血的试剂(日本光电セルタックケミ)，另外，还公知溶血式测定法(专利文献4)，但那些测定体系由于红色不影响到测定，因此没有问题。可是，使用了以特征为染色成为红色的胶体金免疫色谱法为首，使用各种显色或着色底材、目视进行结果判定的、免疫色谱法的试剂，溶血导致的红色着色成为致命的问题。于是，为了实施在红血球不破碎或溶血的缓和条件下在血浆分离垫上保持血球成分的办法，大多情况下需要时间直到免疫色谱展开。另外，该展开的血浆量大大影响到全血试样的粘性，因此也大多损害定量性。而且，根据全血试样的粘性等基质的影响，血浆的分离溶出速度大大不同的情况也多。因此，不计量全血试样滴下后的时间，而是特意计量血浆分离垫进行的血浆分离后的展开时间，进行那之后的染色度的修正测定的设备(俄国)也被销售。
而且，将血球成分长时间、完全地保持在血浆分离垫上在技术上难，血球成分某种程度下可达到免疫色谱展开膜。因此，如酶免疫色谱法等那样将被验试样进行免疫色谱展开后，进一步展开除被验试样液之外的、例如洗净液和酶基质液等时，从血浆分离垫渗出并到达免疫色谱展开膜的血球成分，阻碍后面展开的上述成分的展开，结果不能采用正常的免疫色谱法测定。
另一方面，虽是特殊的例子，但采用测定红血球上的抗原的免疫色谱法，使用孔径非常大的免疫色谱展开膜(5-100μm)，并不破坏红血球的原样状态下展开免疫色谱展开膜的试剂(专利文献5)是公知的。可是，这也与上述通常的免疫色谱法等同样，以不破坏红血球成分为特征。
免疫色谱法，其简便、迅速且廉价的方面是大的优点，使用费事的离心分离机的方法、和使用高价的血浆分离预过滤器预先分离的方法是损害免疫色谱法的长处的。在该点上，预先设置在免疫色谱带上的血浆分离垫是不负其所望的，但在迅速性和再现性上仍有改善余地，另外，例如如酶免疫色谱法那样从被验试样之后流动别的液体的方法时难以适用。
专利文献1特开2002-214236号公报专利文献2特开2002-350428号公报专利文献3专利第2940990号说明书专利文献4特开平10-221334号公报专利文献5特开2000-111555号公报发明内容这样，以血液(全血)为试样的免疫色谱法时，过去采取这样的方法预先进行血清血浆分离、或者在免疫色谱带上使用血浆分离垫延迟血球成分在免疫色谱带上展开。均实施了以不破坏全血中的红血球、不使红色色素流出为前提的办法。可是，预先进行血清血浆分离的方法在工夫和成本上不利点多，另外，在免疫色谱带上使用了血浆分离垫的方法由于全血试样的粘性在测定时间等再现性上有问题，特别是在随后展开被验试样之外的液体的部分的免疫色谱法中，应用难。
因此，本发明的课题在于，提供通过用迅速简便的方法处理全血试样，然后全血试样溶血，并与即使免疫色谱展开膜暂时地着色成红色也没有影响的免疫色谱法组合，从而能够迅速简便且廉价地分析全血试样的免疫色谱法。
上述课题能够采用本发明的免疫色谱法解决，本发明的免疫色谱法，其特征在于，包括(1)在使全血溶血的同时，实施色谱展开可能化处理，配制来源于全血的试样的工序(以下称为源于全血的试样配制工序)；(2)使在上述工序中得到的源于全血的试样在免疫色谱展开膜上展开的工序(以下称为展开工序)；及(3)接着，通过在免疫色谱展开膜上展开洗净液，来去除免疫色谱展开膜上的来源于红血球的红色色素的工序(以下称为红色色素去除工序)。
根据本发明的优选方案，上述色谱展开可能化处理是将比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分可溶化、去除、或者小粒化的处理。
根据本发明的更优选的方案，通过使全血和表面活性剂接触，在使全血溶血的同时，将比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分可溶化，由此配制源于全血的试样。
根据本发明的另一优选方案，通过使全血通过过滤器，在使全血溶血的同时，将比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分去除，由此配制源于全血的试样。
根据本发明的再一优选的方案，通过将全血进行声波处理或高压破碎处理，在使全血溶血的同时，将比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分小粒化，由此配制源于全血的试样。
根据本发明的又一优选的方案，通过使全血和有机溶剂接触，在使全血溶血的同时，将比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分可溶化，由此配制源于全血的试样。
另外，本发明涉及一种免疫色谱法用试剂盒，其特征在于，包含(1)免疫色谱用带、及(2)含有表面活性剂的全血稀释液，上述全血稀释液中的上述表面活性剂的浓度，在用上述全血稀释液稀释全血配制免疫色谱用试样时，是全血溶血的浓度。
发明效果根据本发明的免疫色谱法，不需要在原有的方法中必需的不使全血试样溶血上花工夫，通过简便的全血试样处理和免疫色谱展开，廉价、而且不易受全血粘性的偏差的影响的、将全血试样作为被验试样的简便且短时间的免疫色谱测定是可能的。
实施发明的最佳方案在本发明方法中，将全血溶血(例如通过红血球的溶解或破碎而进行)，通过将例如比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分例如可溶化或小粒化、或者消除，使源于全血的试样不堵塞免疫色谱展开膜的孔并展开，与上述源于全血的试样接续，通过展开别的液体试样，通过冲洗免疫色谱展开膜上的红色溶血成分(主要是血色素)，能够解决上述课题。
通常免疫色谱法所利用的展开膜的孔径为2-20μm左右，但通过将直径约8μm左右的红血球、该值以上的大的白血球、或者稍小的血小板等的血球成分、和来源于磷脂和血纤维蛋白的凝聚体等使用例如表面活性剂溶解的同时可溶化，能够使之不堵塞上述膜中的孔并展开。上述源于全血的试样将免疫色谱展开膜着色成红色，但例如通过用洗净液、和酶法的情况下的基质液等冲洗上述溶血了的源于全血的红色成分，能够除掉红色成分，能够观察通过免疫反应及酶反应等而着色的本来的目标染色线。本发明是基于这样的知识见解的发明。
在本发明方法的源于全血的试样配制工序中，配制源于全血的试样的方法，只要能够使全血溶血，而且能够实施色谱展开可能化处理，就并无特别限定。
在本说明书中，“色谱展开可能化处理”意指后述的展开工序中的在免疫色谱展开膜上能够进行色谱展开的处理，更具体讲，虽并不限定于此，但意指将比免疫色谱展开膜的孔径(优选孔径的下限值)大的全血中成分[例如各种血球成分(例如红血球、白血球、或者血小板等)、溶血后的血球膜(包括红血球膜、各种白血球膜、及血小板膜等)、或者来源于血纤维蛋白或磷脂等的凝聚块等]等例如可溶化、去除、或者小粒化的处理。
作为配制源于全血的试样的方法，例如可举出使用表面活性剂的方法、使用过滤器的方法、利用声波处理或高压破碎处理的方法、使用有机溶剂的方法等。在源于全血的试样配制工序中，可将这些方法中任意一个单独或组合2种以上而实施。
使用表面活性剂的方法，通过使采血的全血和表面活性剂接触，在使全血溶血的同时，将比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分可溶化，由此配制源于全血的试样。使用表面活性剂的方法，通过比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分被表面活性剂可溶化，即使在后述的展开工序中也不会堵塞免疫色谱展开膜的孔并能够使源于全血的试样展开。
表面活性剂是具有易聚集在两种物质间的界面的性质，显著改变该两种物质间的界面的性质的物质。为了具有这样的性质，表面活性剂分子包含亲油基和亲水基的相反的性质的部分。能在本发明中使用的表面活性剂如果为具有这样性质的物质就能使用，例如按离子型的分类而言的非离子表面活性剂、阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、或者两性离子表面活性剂均可使用。
作为非离子表面活性剂，具体地例如可举出聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基烯丙基醚、聚氧乙烯衍生物、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基胺、或者烷基链烷醇酰胺等。
作为阴离子性表面活性剂，具体地例如可举出脂肪酸盐、烷基硫酸酯盐、烷基苯磺酸盐、烷基萘磺酸盐、或者烷基磺琥珀酸盐等。
作为阳离子性表面活性剂，具体地例如可举出烷基胺盐、或者季铵盐等。
作为两性离子表面活性剂，具体地例如可举出烷基内铵盐、胺氧化物、或者二甲基胺基丙磺酸等。
而且，在上述分类之外，还作为膜蛋白质可溶化剂可知，例如，具有类固醇骨架的胆酸钠或脱氧胆酸钠等也是能在本发明中使用的表面活性剂。
在本发明方法中，可将这些表面活性剂单独只使用1种，或者组合2种以上而使用，但并不限定于这里例举的表面活性剂。另外，也可考虑与辅助的处理、例如使盐类、尿素、和/或有机溶剂共存、或者后述的过滤处理(通过过滤器)或者声波处理或高压破碎处理并用的方法。
在适用这些各种表面活性剂时，可适时设定使用的浓度。能具体地适用的浓度因使用的表面活性剂而不同，但添加表面活性剂至使用的表面活性剂具有的细胞微胶粒(セルミセル)浓度附近、或者细胞微胶粒浓度以上的条件能够很好地使用。以下将这些浓度调整了的表面活性剂称为表面活性剂液，但表面活性剂液中的表面活性剂浓度也取决于该表面活性剂的特性，但当浓度过高时，粘性比全血本身还高，与全血的混合难，有时给全血中成分的可溶化带来阻碍。另外，相反地当表面活性剂液中的表面活性剂浓度过低时，全血中成分的可溶化慢，或者不能可溶化，结果有时未完成正常的免疫色谱展开。
具体讲，单独使用分类为非离子性表面活性剂的聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯之一的聚氧乙烯单月桂酸酯(商品名Tween20；Sigma公司制)时，作为溶血反应系中的最终浓度(以下同样)，能够在达到优选2-30％、更优选3-20％、进一步优选10-20％的范围使用。
单独使用分类为非离子性表面活性剂的聚氧乙烯烷基醚之一的聚乙二醇单-对-异辛基苯基酯(商品名TritonX-100；Sigma公司制)时，能够在达到优选0.1-30％、更优选0.3-20％、进一步优选0.5-10％的范围使用。
单独使用分类为非离子性表面活性剂的聚氧乙烯烷基醚之一的聚氧乙烯月桂基醚(商品名エマルゲン108；花王公司制)等时，能够在达到优选0.01-20％、更优选1-20％、进一步优选2.5-10％的范围使用。
单独使用分类为阴离子表面活性剂的烷基硫酸酯盐之一的十二烷基硫酸钠时，能够在达到优选0.01-20％、更优选0.05-7％、进一步优选0.05-5％、特别优选0.1-2.5％的范围使用。
单独使用分类为阳离子表面活性剂的季铵盐之一的氯化蜜亚胺基(パラミチル)三甲基铵[商品名PB40(氯化蜜亚胺基三甲基铵的40％溶液)；日本油脂公司制]时，能够在达到优选0.1-30％、更优选0.3-20％、进一步优选0.5-5％的范围使用。
分别单独使用分类成为两性表面活性剂的硬脂酰内铵盐(商品名アンヒト-ル86B；花王公司制)或者3-[(3-コラミド丙基)二甲基胺基]丙磺酸(商品名CHAPS；同仁化学公司制)时，能够在达到优选0.1-30％、更优选0.3-20％、进一步优选0.5-10％的范围使用。
另外，即使是比上述浓度范围低的浓度，通过组合多种的表面活性剂，也能够得到与上述条件同样的效果。例如将按实施例1所记载的那样，单独使用时采用0.1％浓度(作为溶血反应系中的最终浓度)不能够可溶化、免疫色谱染色、及展开的5种表面活性剂(エマルゲン108、Triton X-100、Tween20、アンヒト-ル86B、及CHAPS)，按实施例3所记载的那样，分别各以0.1％浓度计5种类混合，由此能够可溶化、免疫色谱染色、及展开。
相反，即使是比上述浓度范围高的浓度，例如预先用水等稀释而销售的表面活性剂的场合，也能够得到与上述条件同样的效果。例如聚乙二醇、单-对-异辛基苯基酯以10％水溶液的形态被命名为例如“表面活性剂X”而销售的场合，当将该表面活性剂X不稀释等而原样与全血等量混合而使用时，虽表面活性剂X的最终浓度达到50％，但其实质上得到与Triton X-100的最终浓度5％品同样的效果。
另外，稀释表面活性剂的溶剂未必需要是100％的水溶液，即使是含有有机溶剂的溶剂也能使之溶血、使之免疫色谱展开。例如，上述PB40是氯化蜜亚胺基三甲基铵的40％溶液，在溶剂中存在着20-30％的异丙醇。
而且，根据例如全血试样的前处理、上述的辅助方法的组合、进而免疫色谱测试的特性，优选浓度大幅度不同，因此并不限定于这里举出的表面活性剂。
将上述表面活性剂液与全血混合的比率，对正常的免疫色谱展开来说也是重要的因素。首先，当表面活性剂液的比率过低时，全血中成分未充分可溶化，有时损害正常的免疫色谱展开。而且，为了使展开时间更短、并稳定地进行，优选提高表面活性剂液的比例。可是，另一方面，当表面活性剂液的比例过高时，相对于全血比率下降，结果有时测定灵敏度减弱。可适用的比率因使用的表面活性剂种类或浓度而不同，但表面活性剂液相对于全血的量优选为1/10倍量以上。
表面活性剂液的浓度和与全血的混合比率，除了上面所述的影响以外，还有时对免疫色谱上的反应给予损害，或者提高源于非特异染色的本底。因此，根据测定方法、测定项目、或者测定时间等个别地选定最佳的表面活性剂种类、浓度、与全血的混合比率、或者混合时间为好。
另外，根据表面活性剂的种类，也有即使是能免疫色谱展开的浓度，也损害在免疫色谱上引起的抗原抗体反应等的各种结合反应、酶反应、或者胶体金等的形状的情况。因此，在决定其最佳浓度时，优选在各免疫色谱法和/或各测定项目中，一个一个地研讨充分的最佳条件。
使用过滤器的方法，通过使采集的全血通过过滤器，在使全血溶血的同时，去除比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分，由此配制源于全血的试样。在使用过滤器的方法中，比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分被过滤器去除，由此即使在后述的展开工序中也不会堵塞免疫色谱展开膜的孔并能够使源于全血的试样展开。
作为能够在本发明方法的源于全血的试样配制工序中使用的过滤器，例如可举出注射过滤器。从采血管通过适当的注射器、例如1mL容量注射器(テルモ公司)抽吸全血，使上述注射器的端头啮合注射过滤器，通过施加压力，能够用注射过滤器过滤注射器中的全血。通过过滤时的压力作用，血球等被破碎，比过滤器的孔径大的块、例如被破碎的红血球的膜断片、和类脂物等的凝聚块被去除，只有比过滤器孔径小的粒子被回收到滤液中。优选过滤器的孔径比免疫色谱展开膜的孔径(优选孔径的下限值)�。缑庖呱渍箍さ目拙镀骄滴�5μm时，优选过滤器的孔径小于5μm。另外，免疫色谱展开膜的孔尺寸为5-8μm时，优选过滤器的孔径为5μm以下。上述孔尺寸表示包括全部孔径的大致80％的范围，过滤器孔径意指最大孔径。
利用声波处理或高压破碎处理的方法，通过将采集的全血进行声波处理或高压破碎处理，在使全血溶血的同时，将比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分小粒化，由此配制源于全血的试样。在该方法中，比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分通过声波处理或高压破碎处理而被小粒化，由此即使在后述的展开工序中也不会堵塞免疫色谱展开膜的孔并能够使源于全血的试样展开。
作为能够在本发明方法的源于全血的试样配制工序中采用的声波处理，可举出在通常的细胞破碎中使用的超声波处理。另外，作为高压破碎处理，例如可举出使用压力负荷设备(例如French压力机等)的方法。French压力机通过一方面对试样施加高的压力，一方面回收一部分试样时将压力急剧减少从而能够进行细胞破碎，对全血中的比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分的破碎分散也有效。
除此之外，如果能够使全血溶血，并将上述全血中成分可溶化、小粒化、或者去除，则源于全血的试样的配制方法并无特别限定。
作为能够在源于全血的试样配制工序中使用的有机溶剂，只要是能够使全血溶血、而且能够将比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分可溶化的有机溶剂就无特别限定。作为上述有机溶剂，例如可举出酮类(例如丙酮等)、醇类(例如甲醇、乙醇、或者2-丙醇等)或者乙腈等。上述有机溶剂的使用浓度，在表面活性剂中与先前叙述的同样，例如可根据有机溶剂的种类或各种条件(例如与全血的混合条件、或者免疫色谱法或测定方法的实施条件等)而适宜确定。
本发明方法中的展开工序，除了使用在上述源于全血的试样配制工序中得到的试样以外，可与通常的免疫色谱法中的展开工序同样地实施。在本展开工序中使用的源于全血的试样，由于对免疫色谱展开膜的孔有堵塞可能性的全血中成分预先被可溶化、去除、或小粒化，因此不会堵塞免疫色谱展开膜的孔，能够免疫色谱展开。
但是，在该原样状态下从破碎的全血中的红血球溶出的红色色素将免疫色谱展开膜着色成红色，观察判定线的染色等是困难的。于是，展开了源于全血的试样后，本发明方法的红色色素去除工序通过展开别的液体，从免疫色谱展开膜上排除上述红色色素。
该红色色素去除用液体，只要是通过在免疫色谱展开膜上展开，冲走红色色素而能够将之去除的液体，就无特别限定。作为上述红色色素去除用液体，例如能够使用只冲走红色成分的单独的洗净液(例如水或缓冲液等)，或者例如如部分的酶免疫色谱法等那样，随后展开酶显色基质的体系时，将上述基质液兼用作为红色色素去除用液体，也能够起冲走上述红色成分的作用。
上述红色色素去除用液体，只要在充分展开源于全血的试样的时候能够去除红色色素，其展开的开始并无特别限定。例如，一般是在源于全血的试样展开开始后，开始红色色素去除用液体的展开，但通过研究展开开始位置，也能够在即将将源于全血的试样开始展开之前开始红色色素去除用液体的展开。
本发明的免疫色谱法用试剂盒，至少包含(1)免疫色谱用带、及(2)含有表面活性剂的全血稀释液。作为上述表面活性剂，能够使用能在本发明方法的源于全血的试样配制工序中使用的表面活性剂。上述全血稀释液中的表面活性剂的浓度，在用全血稀释液稀释全血配制免疫色谱用试样(即源于全血的试样)时，只要是全血溶血的浓度就无特别限定。
全血稀释液能够根据要求进一步含有与被验试样(即全血)中的分析对象物质特异地结合的结合物质(例如抗体或抗原等)、和/或用于试剂稳定化的稳定化剂(例如蛋白质、糖、或者高分子化合物等)。
实施例以下通过实施例具体地说明本发明，但这些实施例并不限定本发明的范围。
实施例1在本实施例中，按照以下所示的顺序使用表面活性剂配制溶血及可溶化了的全血试样，采用酶免疫色谱法测定了特异IgE。
(1)酶免疫色谱法用带的制备将硝基纤维素膜(HF180；孔尺寸5-8μm；ミリポア公司制)切断成5mm×25mm的尺寸。在距膜的一端(上游方向)15mm的位置上将螨变应原(ダニアレルゲン)提取蛋白质水溶液(ヤケヒョウヒダニ提取物；グリア公司制)[浓度1mg/mL；用5mmol/L硼酸缓冲液(pH8.5)稀释后透析了的水溶液]涂布成宽1mm的直线状。
原样地在室温下静置1小时，接着在37℃静置30分钟，将ダニ提取蛋白质固定化。保存在二氧化硅凝胶干燥器内，在室温下干燥一夜，由此制备了螨变应原固定化膜。
(1-2)酶标识化抗IgE抗体的配制将抗人IgE鼠单克隆抗体进行了胃蛋白酶处理后，采用2-巯基乙基胺还原，通过凝胶过滤配制了纯化Fab’段片1mg。
另一方面，与此区别，将牛小肠碱性磷酸酯酶2mg用磷酸缓冲液稀释使得达到2mg/mL之后，透析，加入配制成7.5mmol/L的N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基硫代)丙酸酯(SPDP)100μL。使之在4℃反应5小时后，用磷酸缓冲液透析，配制了引入吡啶基二硫代丙酸酯(PDP)的碱性磷酸酯酶。
将上述抗IgE抗体Fab’和上述引PDP的碱性磷酸酯酶等量混合各1mL后，添加了1mol/L羟基胺40μL。使之在4℃反应3天后，使用凝胶过滤柱(TSKgel G3000SW；东ソ-公司制)进行凝胶过滤，去除未反应的抗IgE抗体Fab’及引PDP的碱性磷酸酯酶，制备了酶标识化抗IgE抗体水溶液。
(1-3)酶标识化抗体垫的制备将在实施例1(1-2)中配制的酶标识化抗IgE抗体水溶液，抗体量1μg，用含有5.0％蔗糖的5mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)稀释后，将该稀释液10μL涂布在切断成为5mm×5mm的吸收垫(PREMl420；ポ-ル公司制)上，在二氧化硅凝胶干燥器内在室温下减压(≤100mmHg)干燥一夜，由此制备了酶标识化抗体垫。
(1-4)试样添加垫的制备将玻璃纤维垫切断成为5mm×l8mm，浸在含有0.5％蔗糖、0.2％Tween20、及0.1％聚乙烯醇(聚合度＝约500)的水溶液中后，去除过剩的水溶液，风干，制备了试样添加垫。
(1-5)吸收垫的制备将纤维素垫(AP25；Millipore公司制)切断成为5mm×20mm的尺寸，制成吸收垫。
(1-6)免疫色谱用带的制备在切断成为5mm×60mm的尺寸的塑料粘着片(BioDot制)上，关于展开方向，从上游侧向下游侧，按在实施例1(1-4)中制备的试样添加垫、在实施例1(1-3)中制备的AP标识化抗体垫、在实施例l(1-1)中制备的螨变应原固定化膜、及在实施例1(1-5)中制备的吸收垫的顺序分别与邻接其两端的构件重合lmm左右并粘贴，由此制备了免疫色谱用带。
(2)溶血及可溶化处理了的全血试样的配制和免疫色谱测定(2-1)表面活性剂液的配制配制去离子水、生理盐水(150mmol/L氯化钠液)、10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5，150mmol/L氯化钠)，另外，将TritonX-100(Sigma工业株式会社)、Tween20(Sigma公司制)、十二烷基硫酸钠、エマルゲン108(花王公司制)、PB40(日本油脂公司制)、アンヒト-ル86B(花王公司制)、或者CHAPS(同仁化学公司制)用上述磷酸缓冲液配制成分别达到0.2、1.0、5.0、或者20％浓度。
(2-2)全血与表面活性剂液的等量混合试样的制备和溶血观察制备了将用装入肝素抗凝固剂的采血管采集的人的全血和上述各种浓度表面活性剂液等量混合各100μL的试样。混合10分钟后进行目视观察，调查了有无溶血。这里所说的溶血是指红血球膜被可溶化，红血球中的血色素等红色成分溶出，由此变成更透明色的状态。
(2-3)酶免疫色谱测定将上述免疫色谱用带，使试样添加垫在下方而插入到预先分注了将上述全血溶血可溶化了50μL的试样的微量培养板孔中，竖立着，通过毛细管现象使检体色谱展开。然后，从上述色谱展开开始经过10分钟后，再使200μL的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP；ベ-リンガ-マンハイム公司制)水溶液色谱展开。
作为上述检体，使用了检体1(螨特异的IgE＝0IU/mL)、检体2(螨特异的IgE＝3IU/mL)、及检体3(螨特异的IgE＝10IU/mL)。各检体中的螨特异的IgE量是用过去的定量测定法(アラスタット特异IgE抗体测定试剂盒；ヤトロン公司销售，美国DPC公司制)测定的值，用国际标准单位IU/mL表述。
色谱展开结束后，目视判定变应原(ダニアレルゲン)固相化区域(1mm宽带)的着色程度，结果示于表1-表8。表1-表8及后述的表9-表19所示的各记号“-、“±”、“+”、及“++”分别意指无着色、微弱的着色、明确的着色、及强的着色。表中的表面活性剂浓度表示在实施例1(2-2)中使用的表面活性剂液的浓度，溶血反应系中的表面活性剂的最终浓度是表所示的浓度的1/2。
表1
表2
表3
表4
表5
表6
表7
表8
实施例2在本实施例中按照以下所示的顺序使用表面活性剂配制溶血可溶化了的全血试样，采用胶体金免疫色谱法测定了特异IgE。
(1)胶体金免疫色谱用带的制备(1-1)变应原固定化膜的制备按照实施例1(1-1)中记载的那样，在硝基纤维素膜上将螨变应原提取蛋白质水溶液涂布成宽1mm的直线状，制备了螨变应原固定化膜。
(1-2)胶体金标识化抗IgE抗体的配制将抗人IgE鼠单克隆抗体用磷酸缓冲液(2mmol/L，pH7.0)稀释使之达到0.1mg/mL后，透析。接着，一边搅拌胶体金悬浮液(GOLDCOLLOID 20；British BioCell International制)100mL，一边缓慢滴加上述抗人IgE鼠单克隆抗体水溶液10mL，在室温下搅拌10分钟。再一边搅拌一边缓慢滴加10％牛血清白蛋白(A-7888；Sigma公司制；以下称为BSA)水溶液10mL后，在室温下再搅拌10分钟。向该水溶液中加入含有5％蔗糖和0.2％Tween20的水溶液15mL，混合后，在10℃以16000×g离心分离1小时，去除上清。
将沉淀的胶体金标识化抗体再悬浮于100mL含有0.5％蔗糖和0.02％Tween20的硼砂缓冲液(pH8.0)中，在10℃以16000×g离心分离1小时，去除上清。进一步地，将沉淀的胶体金标识化抗体再悬浮于100mL含有0.5％蔗糖和0.02％Tween20的硼砂缓冲液(pH8.0)中，在10℃以16000×g离心分离1小时，去除上清。最后，将沉淀的胶体金标识化抗体再悬浮于100mL含有0.5％蔗糖和0.02％Tween20的硼砂缓冲液(pH8.0)中后，进行浓度调整使得粒子密度达到约1013/mL(波长520nm下的吸光度＝约14)，制成胶体金标识化抗IgE抗体悬浮液。
(1-3)胶体金标识化抗体垫的制备代替酶标识化抗IgE抗体水溶液，使用在实施例2(1-2)中配制的胶体金标识化抗IgE抗体悬浮液，除此以外重复实施例1(1-3)的操作，由此制备了胶体金标识化抗体垫。
(1-4)免疫色谱用带的制备代替酶标识化抗体垫，使用在实施例2(1-3)中配制的胶体金标识化抗体垫，除此以外重复实施例1(1-6)的操作，由此制备了胶体金免疫色谱用带。
(2)溶血及可溶化处理了的全血试样的配制和免疫色谱测定(2-1)表面活性剂液配制和与全血的混合及溶血观察与实施例1(2-1)同样地配制各种溶液，与实施例1(2-2)同样地制备将人的全血和上述各种溶液各100μL等量混合的试样，调查了有无溶血。
(2-2)胶体金免疫色谱测定代替酶法免疫色谱带，使用在实施例2(1-4)中制备的胶体金免疫色谱用带，代替5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP；ベ-リンガ-マンハイム公司制)水溶液，使磷酸缓冲液色谱展开，除此以外重复实施例1(2-3)的操作，由此进行了胶体金免疫色谱法的展开。
色谱展开结束后，目视判定变应原固相化区域(1mm宽带)的着色程度，结果示于表9-表16中。
表9
表10
表11
表12
表13
表14
表15
表16
实施例3在本实施例中按照以下所示的顺序使用以等浓度含有5种表面活性剂的表面活性剂混合液配制溶血可溶化了的全血试样，采用酶免疫色谱法测定了特异IgE。
(1)酶法免疫色谱用带的制备通过重复实施例1(1)中记载的操作，制备了酶法免疫色谱带。
(2)表面活性剂混合液的配制、与全血的混合、及溶血观察在分别以等浓度(0.04、0.2、1、或4％浓度)含有5种表面活性剂(Triton X-100、Tween20、エマルゲン108、アンヒト-ル86B、及CHAPS)的前提下使用10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5，150mmol/L氯化钠)配制浓度不同的4种表面活性剂混合液(作为各混合液中的5种表面活性剂的总浓度，为0.2、1.0、5.0、或20％浓度)。与实施例1(2-2)同样地制备将人的全血和上述表面活性剂混合液等量混合各100μL的试样，调查了有无溶血。
(3)酶法免疫色谱测定与实施例1(2-3)中记载的方法同样地进行免疫色谱测定，进行了目视判定。表17表示出结果。表中的表面活性剂浓度是在实施例3(2)中使用的表面活性剂混合液中的5种的各表面活性剂的各自的浓度。
表16
实施例4在本实施例中按照以下所示的顺序使用注射过滤器配制在使全血溶血的同时，去除了比过滤器的孔径大的全血中成分的源于全血的试样，采用酶免疫色谱法测定了特异IgE。
(1)酶法免疫色谱用带的制备通过重复实施例1(1)中记载的操作，制备了作为硝基纤维素膜使用HF180(孔尺寸5-8μm)的免疫色谱带。另外，代替上述HF180使用HF240(孔尺寸3-5μm)，除此以外通过重复实施例1(1)中记载的操作，也制备了作为硝基纤维素膜使用HF240(孔尺寸3-5μm)的免疫色谱带。上述孔尺寸表示包括全部孔径的大致80％的范围。
(2)过滤器处理了的全血试样的配制和免疫色谱测定(2-1)由各种注射过滤器得到的全血过滤液的配制将用装有抗凝固剂(肝素)的采血管采集的人全血用5μm过滤器(ザルトリウス公司)、3μm过滤器(アドバンテック公司)、1.2μm过滤器(ザルトリウス公司)、0.8μm过滤器(アドバンテック公司)、或者0.2μm过滤器(アドバンテック公司)过滤，回收了其滤液。过滤后，目视进行观察，调查了有无溶血。各过滤器的上述孔径意指最大孔径。
(2-2)酶免疫色谱测定使用在实施例4(1)中配制的2种的酶免疫色谱用带，用实施例1(2-3)中记载的方法使上述各种滤液进行免疫色谱展开。
然后，按照实施例1(2-3)中记载的那样，再使5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP；ベ-リンガ-マンハイム公司制)200μL色谱展开。检体使用了与实施例1(2-3)中记载的检体同等的检体。
色谱展开结束后，目视判定变应原固相化区域(1mm宽带)的着色程度，结果示于表18及表19中。
表18
表19
产业上的实用性本发明的免疫色谱法能够适用于全血试样的分析的用途中。
以上按特定的方案说明了本发明，但本领域人员不言自明的变形和改良包括在本发明的范围中。
权利要求
1.一种免疫色谱法，其特征在于，包括(1)在使全血溶血的同时，实施色谱展开可能化处理，由此配制来源于全血的试样的工序；(2)使在上述工序中得到的源于全血的试样在免疫色谱展开膜上展开的工序；及(3)接着，通过在免疫色谱展开膜上展开洗净液，从而去除免疫色谱展开膜上的来源于红血球的红色色素的工序。
2.根据权利要求1所述的免疫色谱法，其中，上述色谱展开可能化处理是将比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分可溶化、去除、或者小粒化的处理。
3.根据权利要求2所述的免疫色谱法，其中，通过使全血和表面活性剂接触，在使全血溶血的同时，将比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分可溶化，由此配制源于全血的试样。
4.根据权利要求2所述的免疫色谱法，其中，通过使全血通过过滤器，在使全血溶血的同时，将比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分去除，由此配制源于全血的试样。
5.根据权利要求2所述的免疫色谱法，其中，通过将全血进行声波处理或高压破碎处理，在使全血溶血的同时，将比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分小粒化，由此配制源于全血的试样。
6.根据权利要求2所述的免疫色谱法，其中，通过使全血和有机溶剂接触，在使全血溶血的同时，将比免疫色谱展开膜的孔径大的全血中成分可溶化，由此配制源于全血的试样。
7.一种免疫色谱法用试剂盒，其特征在于，包含(1)免疫色谱用带、及(2)含有表面活性剂的全血稀释液，上述全血稀释液中的上述表面活性剂的浓度，在用上述全血稀释液稀释全血配制免疫色谱用试样时，是全血溶血的浓度。
全文摘要
公开了一种免疫色谱法，其包括(1)在使全血溶血的同时，实施色谱展开可能化处理，由此配制来源于全血的试样的工序；(2)使在上述工序中得到的源于全血的试样在免疫色谱展开膜上展开的工序；及(3)接着，通过在免疫色谱展开膜上展开洗净液，从而去除免疫色谱展开膜上的来源于红血球的红色色素的工序。根据上述免疫色谱法，能够迅速简便且廉价地分析全血试样。
文档编号G01N33/48GK1795384SQ200480014759
公开日2006年6月28日 申请日期2004年5月26日 优先权日2003年5月27日
发明者小野哲也, 藤井隆行, 杉山和之, 黑田隆, 川村雅英 申请人:株式会社三菱化学药得论
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