专利名称：超敏c反应蛋白检测方法及超敏c反应蛋白检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于医学免疫领域，涉及C反应蛋白检测方法，还涉及超敏C反应蛋白检测 试齐U盒。
背景技术：
C 反应蛋白(C-reactive protein，CRP)，1930 年 Tillet 和 Francis 在急性大叶 性肺炎患者血清中发现能在钙离子存在时与肺炎球菌C多糖起沉淀反应而得名，是人类重 要的急性期反应蛋白，急性期浓度可升高上千倍。人类C反应蛋白是由肝脏产生，由五个相 同的亚基以非共价键形成环状五聚体。C反应蛋白目前已经作为医院常规检测项目，可以在很多疾病诊断上作为辅助判 断依据。C反应蛋白在炎症开始6-12小时浓度增高，24-48小时即可达到峰值，随着疾病的 好转其浓度可迅速恢复至正常水平，因此可用于监测病情、评估抗生素疗效等方面。临床上 采用普通C反应蛋白检测试剂盒对C反应蛋白进行检测，虽可以使用全血作为检测样本，但 检测范围一股在3-200mg/L左右，最低检测限一股在3-5mg/L左右，灵敏度较低。在儿科感染性疾病中，由于新生儿的C反应蛋白水平通�：艿停贸９鍯反应蛋白 的检测反应不出微小的变化；在心血管疾病诊断方面，CRP < lmg/L为低危险性，l_3mg/L为 中度危险性，> 3mg/L为高危险性；因此普通C反应蛋白检测试剂盒无法用于新生儿感染性 疾病及心脑血管疾病方面的诊断和预测。近年来，随着检测技术的进步，C反应蛋白检测技术也得到了提高，于是出现了超 敏C反应蛋白这一概念。超敏C反应蛋白检测方法具有很好的灵敏度，能检测出较低的C 反应蛋白含量，因此能用于新生儿感染性疾病及心脑血管疾病方面的诊断和预测，同时在 冠心病、中风、周围血管栓塞等疾病诊断和预测中发挥着重要的作用，甚至被认为是心血管 疾病危险评估的“金标准”。部分学者认为超敏C反应蛋白可以作为心血管疾病(例如心 肌梗塞)危险评估的一项独立指标。首先，目前超敏C反应蛋白检测试剂盒都是采用血清或血浆样本进行检测，需要 静脉取血且采血量大，样本使用前还需离心，无法直接采用手指微量全血作为检测样本，检 测速度慢，因此不能很好的满足医院急诊和门诊快速诊断的要求，需要改进；再者，感染性 疾病时机体产生的炎症反应使得C反应蛋白浓度大大的升高，严重时可达200mg/L或更高， 此时如果使用最高检测限一股在15-20mg/L左右的超敏C反应蛋白检测试剂盒检测，则需 要事先对样本进行一系列稀释，即浪费试剂，又操作繁琐；现有超敏C反应蛋白检测试剂盒 检测范围�。皇视糜诟腥拘约膊〉募觳猓枰慕�。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测速度快、检测范围宽的超敏C反应蛋白检测方法， 本发明的另一目的是提供一种可以直接使用全血作为样本、检测速度快、检测范围宽的超 敏C反应蛋白检测试剂盒。
超敏C反应蛋白检测方法，包括如下步骤a、建立散射值与多个C反应蛋白标准品的散射值_浓度对应数据库将多个已知 不同浓度的C反应蛋白标准品分别与处理缓冲液Rl试剂混勻制得抗原标准液，然后将乳 胶抗体R2试剂加入抗原标准液、同时用特定蛋白分析仪测定标准品散色值，从而建立散射 值_浓度对应数据库；b、测定待检样品的散色值将待检样品与处理缓冲液Rl试剂混勻制得抗原液，然 后将乳胶抗体R2试剂加入抗原液、同时用特定蛋白分析仪测定待检样品的散色值；c、查询C反应蛋白浓度将b步骤测定的散色值与散射值-浓度对应数据库对照， 查询得知C反应蛋白浓度；其中，乳胶抗体R2试剂中包括兔抗人C反应蛋白抗体或羊抗人C反应蛋白抗体致 敏的苯乙烯乳胶。进一步的，所述处理缓冲液Rl试剂包括如下组分0. 005% 0. 05%的十二烷 基硫酸钠(SDS)、0· 225% 0. 9% 的 NaCl.O. 078% 0. 312% 的 NaH2PO4. 2Η20、0· 715% 2. 86%的Na2HPO4. 12Η20、0. 09% 0. 的叠氮钠。处理缓冲液中的十二烷基硫酸钠成份 属于阴离子表面活性剂，浓度使用过高会抑制抗原抗体的凝集反应，有文献报导使用0. 5% 浓度的十二烷基硫酸钠溶血，溶血效果好但会抑制接下来的抗原抗体反应，本发明采用的 浓度范围，即可以达到快速溶血的目的，又不会抑制抗原抗体反应。进一步的，所述乳胶抗体R2试剂包括如下组分0. 1% 0. 5%兔抗人C反应蛋白 抗体或羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶、0. 2 % 0. 8 %的甘氨酸、0. 09 % 0. 1 % 的叠氮钠。进一步的，a步骤测定标准品散色值采用定时散射比浊法，即于乳胶抗体R2试剂 加入抗原标准液后第M秒读取此时间段的最低散射值Si，第N秒后读取散射值S2，标准品 散色值为S2与Sl的差值；b步骤测定散色值采用定时散射比浊法，即于乳胶抗体R2试剂 加入抗原液后第M秒读取此时间段的最低散射值S3，第N秒后读取散射值S4,散色值为S4 与 S3 的差值；45 > = M > = 10 ;150 > = N > = 60。进一步的，所述待检样品为手指末梢全血、抗凝静脉全血、血清或血浆，优选全血。进一步的，步骤a、步骤b中，特定蛋白分析仪测定散色值时均采用单波长光进行 检测；更进一步的，所述单波长光的波长为630nm 690nm。进一步的，检测温度为30°C 37°C。超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液Rl试剂和乳胶抗体R2试剂，乳胶抗 体R2试剂包括兔抗人C反应蛋白抗体或羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶。进一步的，所述处理缓冲液Rl试剂包括如下组分0. 005% 0.05%的十二烷 基硫酸钠(SDS)、0· 225% 0. 9% 的 NaCl.O. 078% 0. 312% 的 NaH2PO4. 2Η20、0· 715% 2. 86% 的 Na2HPO4. 12Η20、0· 09% 0. 的叠氮钠。进一步的，所述乳胶抗体R2试剂包括如下组分0. 1% 0. 5%兔抗人C反应蛋白 抗体或羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶、0. 2% 0. 8%的甘氨酸0. 5%、0. 09% 0. 的叠氮钠。本发明所要解决的问题在于提供一种以定时散射比浊法为检测原理，可直接使用 手指末梢全血或抗凝静脉全血作为待检样品，无需预先对全血样本进行预处理，就可直接进行检测，大大提高了检测速度，简化了操作步骤。再则，本发明的检测范围为0. 5-350mg/ L，超宽的检测范围使得对感染性疾病及心脑血管疾病方面的诊断和预测成为可能。
图1是C反应蛋白标准品测定标准曲线；图2是试剂测试质控品的稀释线性试验图；图3是试剂测试全血样本的稀释线性试验图；图4是本发明中试剂与现有技术的血清C反应蛋白试剂测定样本的相关图。
具体实施例方式实施例1手指末梢全血超敏C反应蛋白检测方法，包括如下步骤a、建立散射值与多个C反应蛋白标准品的散射值_浓度对应数据库采用定时散 射比浊法测定多个C反应蛋白标准品的散射值；将多个2 μ 1已知不同浓度的C反应蛋白 标准品分别与600 μ 1处理缓冲液Rl试剂混勻后，制得抗原标准液，然后将60 μ 1乳胶抗体 R2试剂加入抗原标准液、同时用特定蛋白分析仪测定标准品散色值，检测时特定蛋白分析 仪采用波长为630nm光；检测时于乳胶抗体R2试剂加入抗原标准液后第30秒读取此时间 段的最低散射值Si，第90秒后读取散射值S2，标准品散色值为S2与Sl的差值，根据多个 标准品散色值与多个C反应蛋白标准品浓度，建立散射值与多个C反应蛋白标准品的散射 值_浓度对应数据库——即图1所示的C反应蛋白标准品测定标准曲线。b、测定手指末梢全血的散色值将2 μ 1手指末梢全血与600 μ 1处理缓冲液Rl 试剂混勻10秒后，可见溶液变为红色清亮，制得抗原液，然后将60 μ 1乳胶抗体R2试剂加 入抗原液、同时用特定蛋白分析仪测定标准品散色值，检测时特定蛋白分析仪采用波长为 630nm光；检测时于乳胶抗体R2试剂加入抗原标准液后第30秒读取此时间段的最低散射 值S3，第90秒后读取散射值S4，散色值为S4与S3的差值3194。c、查询C反应蛋白浓度将b步骤测定的散色值3194与图1对照，查询得知C反 应蛋白浓度为155mg/L。为得到较为准确的检测结果，检测过程中保持温度恒定在37°C。其中处理缓冲液Rl试剂包括如下组分十二烷基硫酸钠(SDS)O. 01%、NaCl 0. 9%, NaH2PO4. 2H20 0. 156%, Na2HPO4. 12Η20 1· 43%、叠氮钠 0· 09%。其中乳胶抗体R2试剂包括如下组分兔抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶 0. 2%、甘氨酸0. 5%、叠氮钠0. 09%。实施例1提供的超敏C反应蛋白检测方法同样适用于抗凝静脉全血、血清或血浆 的C反应蛋白检测。取2 μ 1抗凝静脉全血或1. 2 μ 1血清或1. 2 μ 1血浆采用实施例1中 的试剂及方法均能得到准确的结果。实践中，在保证检测参数相同的情况下，步骤a中的散射值_浓度对应数据库完全 可以应用于步骤b中的浓度，也就是说步骤b可以省略步骤a，此时检测实践只需90秒即可 完成浓度检测。而目前市场上的普通和超敏C反应蛋白检测试剂盒在检测时一股需要采用 双波长进行检测，而且需要先进行试剂空白的测定，然后再加入乳胶抗体进行浓度检测，操作较为繁琐，整个测试一股最少需要3分钟以上才能完成。实施例2精密度验证实施例取具有溯源性的高值质控物、低值质控物各一份，对每份质控 物进行10次检测，将共10次检测结果计算平均值、标准差和变异系数。结果见表1 表 1 由表1中变异系数可知，本发明提供的C反应蛋白检测方法具有较高的精密度。实施例3准确度验证实施例取具有溯源性的血清高值质控物、血清低值质控物各一份，用 试剂分别进行检测，各检测5次，计算平均值，与质控物靶值进行对照。结果见表2 表2 由表2数据可知，本发明提供的C反应蛋白检测方法具有较高的准确度。实施例4试剂线性试验取一已知浓度的具有溯源性的标准品或质控物，浓度应尽量高，用生理盐水对样本进行稀释，每点测定3次，取平均值，结果与预期浓度作回归直线，计算出 回归系数r的平方，结果见表3及图2 表3 由表3及图2可知，r2 = 0. 9998，说明本发明提供的C反应蛋白检测方法的稀释 线性好。实施例5灵敏度的检测试验取具有朔源性的质控品稀释至检测范围下限附近进行测定， 重复测定3次，计算平均值，与质控物靶值进行对照。结果见表4 表 4 由表4数据可知，本发明提供的C反应蛋白检测方法具有较高的灵敏度。实施例6人全血样本经不同倍数稀释后分别检测C反应蛋白浓度，全血样本稀释线性图见 图3。由图3可知，样本经过一系列稀释后，测得的CRP实测值与CRP理论值相比偏差微小。实施例7图4显示了本发明中试剂和现有技术的血清C反应蛋白试剂测定样本的相关图。 其中X轴表示本试剂测定结果，Y轴表示现有技术试剂测定结果，相关系数r2 = 0. 9981，回 归方程为y = 0. 9209X-0. 5405。由图4可知本发明样本检测结果与现有技术产品检测结果 相比，结果无明显差异。
实施例8超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液Rl试剂、乳胶抗体R2试剂、C反应 蛋白标准品；其中处理缓冲液Rl试剂包括如下组分十二烷基硫酸钠(SDS)O. 005%, NaCl 0. 45%, NaH2PO4. 2H20 0. 078%, Na2HPO4. 12H20 0. 715%、叠氮钠 0. 09%。其中乳胶抗体 R2 试剂包括如下组分兔抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶0. 2%、甘氨酸0. 5%、叠氮钠 0. 09%。实施例9超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液Rl试剂、乳胶抗体R2试剂、C反应 蛋白标准品；其中处理缓冲液Rl试剂包括如下组分十二烷基硫酸钠(SDS)O. 005%, NaCl 0. 225%, NaH2PO4. 2H20 0. 156%, Na2HPO4. 12Η20 1· 43%、叠氮钠 0· 09%。其中乳胶抗体 R2试剂包括如下组分兔抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶0. 5%、甘氨酸0. 2%、叠 氮钠0. 09%。实施例10超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液Rl试剂、乳胶抗体R2试剂、C反应 蛋白标准品；其中处理缓冲液Rl试剂包括如下组分十二烷基硫酸钠(SDS)O. 01%, NaCl 0. 9%, NaH2PO4. 2H20 0. 078%, Na2HPO4. 12Η20 0· 715%、叠氮钠 0· 1 %。其中乳胶抗体 R2 试 剂包括如下组分兔抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶0.3%、甘氨酸0.8%、叠氮钠 0.1%。实施例11超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液Rl试剂、乳胶抗体R2试剂、C反应 蛋白标准品；其中处理缓冲液Rl试剂包括如下组分十二烷基硫酸钠(SDS)O. 01%, NaCl 0. 45%, NaH2PO4. 2H20 0. 312%, Na2HPO4. 12Η20 2· 86%、叠氮钠 0· 1 %。其中乳胶抗体 R2 试 剂包括如下组分兔抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶0.3%、甘氨酸0.5%、叠氮钠 0.1%。实施例12超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液Rl试剂、乳胶抗体R2试剂、C反应 蛋白标准品；其中处理缓冲液Rl试剂包括如下组分十二烷基硫酸钠(SDS)O. 01%, NaCl 0. 225%,NaH2PO4. 2Η20 0. 156%,Na2HPO4. 12Η20 1. 43%、叠氮钠 0. 09%。其中乳胶抗体 R2 试剂包括如下组分羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶0. 2%、甘氨酸0. 5%、叠氮钠 0. 09%。实施例13超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液Rl试剂、乳胶抗体R2试剂、C反应 蛋白标准品；其中处理缓冲液Rl试剂包括如下组分十二烷基硫酸钠(SDS)O. 02%, NaCl 0. 9%,NaH2PO4. 2Η20 0. 156%,Na2HPO4. 12Η20 1. 43%、叠氮钠 0· 09%。其中乳胶抗体 R2 试 剂包括如下组分羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶0. 5%、甘氨酸0. 2%、叠氮钠 0. 09%。实施例14超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液Rl试剂、乳胶抗体R2试剂、C反应 蛋白标准品；其中处理缓冲液Rl试剂包括如下组分十二烷基硫酸钠(SDS)O. 02%, NaCl0. 45%, NaH2PO4. 2H20 0. 156%, Na2HPO4. 12H20 1. 43%、叠氮钠 0. 1%0 其中乳胶抗体 R2 试 剂包括如下组分羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶0. 3%、甘氨酸0. 8%、叠氮钠 0.1%。实施例15超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液Rl试剂、乳胶抗体R2试剂、C反应 蛋白标准品；其中处理缓冲液Rl试剂包括如下组分十二烷基硫酸钠(SDS)O. 05%, NaCl 0. 9%, NaH2PO4. 2H20 0. 312%, Na2HPO4. 12Η20 2· 86%、叠氮钠 0· 1 %。其中乳胶抗体 R2 试 剂包括如下组分羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶0. 3%、甘氨酸0. 5%、叠氮钠 0.1%。
权利要求
超敏C反应蛋白检测方法，其特征是，包括如下步骤a、建立散射值与多个C反应蛋白标准品的散射值-浓度对应数据库将多个已知不同浓度的C反应蛋白标准品分别与处理缓冲液R1试剂混匀制得抗原标准液，然后将乳胶抗体R2试剂加入抗原标准液、同时用特定蛋白分析仪测定标准品散色值，从而建立散射值-浓度对应数据库；b、测定待检样品的散色值将待检样品与处理缓冲液R1试剂混匀制得抗原液，然后将乳胶抗体R2试剂加入抗原液、同时用特定蛋白分析仪测定待检样品的散色值；c、查询C反应蛋白浓度将b步骤测定的散色值与散射值-浓度对应数据库对照，查询得知C反应蛋白浓度；其中，乳胶抗体R2试剂中包括兔抗人C反应蛋白抗体或羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶。
2.根据权利要求1所述的超敏C反应蛋白检测方法，其特征是所述处理缓冲液Rl 试剂包括如下组分0. 005% 0. 05%的十二烷基硫酸钠(SDS)、0· 225% 0. 9%的NaCl、 0. 078% 0. 312% 的 NaH2PO4. 2Η20、0· 715% 2. 86% 的 Na2HPO4. 12Η20、0· 09% 0. 的叠氮钠。
3.根据权利要求1所述的超敏C反应蛋白检测方法，其特征是所述乳胶抗体R2试剂 包括如下组分0. 0. 5%兔抗人C反应蛋白抗体或羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙 烯乳胶、0. 2% 0. 8%的甘氨酸、0. 09% 0. 的叠氮钠。
4.根据权利要求1所述的超敏C反应蛋白检测方法，其特征是a步骤测定标准品散色 值采用定时散射比浊法，即于乳胶抗体R2试剂加入抗原标准液后第M秒读取此时间段的最 低散射值Si，第N秒后读取散射值S2，标准品散色值为S2与Sl的差值；b步骤测定散色值 采用定时散射比浊法，即于乳胶抗体R2试剂加入抗原液后第M秒读取此时间段的最低散射 值S3，第N秒后读取散射值S4，散色值为S4与S3的差值；45 > = M > = 10 ； 150 > = N > =60。
5.根据权利要求1所述的超敏C反应蛋白检测方法，其特征是所述待检样品为手指 末梢全血、抗凝静脉全血、血清或血浆。
6.根据权利要求1所述的超敏C反应蛋白检测方法，其特征是检测温度为30°C 37 °C。
7.根据权利要求1 6任意一项所述的超敏C反应蛋白检测方法，其特征是步骤a、 步骤b中，特定蛋白分析仪测定散色值时均采用单波长光进行检测。
8.根据权利要求1 6任意一项所述的超敏C反应蛋白检测方法，其特征是所述单 波长光的波长为630nm 690nm。
9.超敏C反应蛋白检测试剂盒，包括处理缓冲液Rl试剂和乳胶抗体R2试剂，其特征 是乳胶抗体R2试剂包括兔抗人C反应蛋白抗体或羊抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳 胶。
10.根据权利要求9所述的超敏C反应蛋白检测试剂盒，其特征是所述处理缓冲液Rl 试剂包括如下组分0. 005% 0. 05%的十二烷基硫酸钠(SDS)、0· 225% 0. 9%的NaCl、 0. 078% 0. 312% 的 NaH2PO4. 2Η20、0· 715% 2. 86% 的 Na2HPO4. 12Η20、0· 09% 0. 的叠氮钠。
11.根据权利要求9或10所述的超敏C反应蛋白检测试剂盒，其特征是所述乳胶抗 体R2试剂包括如下组分0. 0. 5%兔抗人C反应蛋白抗体或羊抗人C反应蛋白抗体 致敏的苯乙烯乳胶、0. 2% 0. 8%的甘氨酸、0. 09% 0. 的叠氮钠。
全文摘要
本发明涉及医学免疫领域，提供了一种超敏C反应蛋白检测方法，该方法直接以手指末梢全血或抗凝静脉全血作为待检样品，以兔抗人C反应蛋白抗体致敏的苯乙烯乳胶为抗体，采用定时散射比浊法进行C反应蛋白浓度检测，这种检测方法操作简便、检测速度快、检测范围宽、检测灵敏度高，从而实现了对感染性疾病及心脑血管疾病等多方面的诊断和预测。
文档编号G01N33/68GK101881777SQ201010213990
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者余嘉陵, 杨青, 郑筱雯, 陈明峰 申请人:深圳市国赛生物技术有限公司
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