专利名称：一种重组巴西坚果过敏原与突变体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及ー种重组巴西坚果过敏原与突变体及其制备方法和应用。
背景技术：
巴西坚果(Brazil nut),属王蕊科巴西坚果属(Family Lecythidaceae),热带常绿果树，大乔木。巴西坚果果仁含硫氨基酸、脂肪、胡萝卜素、维生素类物质含量非常丰富。近几年来，巴西坚果的销售量不断上升，在欧洲和北美拥有巨大的市场份额，年销售量超过33亿美元，在中国市场也不断増加，但是它是ー个过敏原，相比鸡蛋和牛奶等其它过敏原，坚果引起的过敏反应常常是永久的。巴西坚果过敏的临床症状严重，即便食入微量的巴西坚果过敏原食物，也可引发强烈的过敏反应，在公共卫生和食品安全领域中备受关注。另ー 方面，由于交叉过敏的普遍性与复杂性存在，巴西坚果过敏与其他类型的过敏存在严重的交叉反应，也増加了其过敏发生的概率。目前，治疗过敏性疾病主要方法有I)利用抗组胺药物以及类固醇药物可以缓解症状，但是不能彻底根除并且还有可能会带来副作用。2)特异性免疫治疗，被认为是过敏性疾病唯一针对病因的治疗方法，已得到普遍共识。而目前进行特异性免疫治疗主要是采用过敏原浸提液，如此ー来另ー个问题却异常突出由于提取物成分复杂，而且还含有大量非特异性抗原，致使标准化困难，严重影响了治疗效果和临床应用规范；同吋，由于过敏原性的存在，即使是采用单纯的标准化过敏原进行免疫治疗也有一定的风险。采用生物化学分离和纯化技术可以获得较纯过敏原，但是这种方法纯化工艺复杂且产量低，要消耗大量人カ和财力，因此其广泛应用受到了较大的限制。相比较而言，利用基因工程技术，通过定点突变的方法获得低过敏原性或无过敏原性的重组巴西坚果过敏原的突变体，在一定程度上可从源头上降低治疗过程中的风险，同时能够保留巴西坚果过敏原的生物学活性。另外，重组过敏原的生产条件稳定，且标准化程序简单，有利于广泛应用于临床的诊断和治疗。因此，重组弱化过敏原将是ー种很好的替代方法，有广阔的发展前景。
发明内容
本发明的目的在于针对上述存在的问题及天然巴西坚果过敏原提取液的不足，在克隆表达重组巴西坚果过敏原的基础上，利用生物信息学软件分析巴西坚果过敏原的抗原表位，突变ー个或多个抗原性高的位点，从而获得低过敏原性的巴西坚果过敏原突变体，期望能够安全高效地应用于过敏性疾病的治疗。本发明的另ー个目的是提供一种编码上述重组巴西坚果过敏原及其突变体的基因。本发明的另ー个目的是提供ー种含有上述基因的重组质粒载体。本发明的另ー个目的是提供ー种含有上述基因转化的重组表达宿主。
本发明的另ー个目的是提供ー种上述重组巴西坚果过敏原及其突变体的制备方法。本发明的另ー个目的是提供一种重组巴西坚果过敏原用作药物或者诊断试剂的制备方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
本发明的重组巴西坚果过敏原，是天然存在的巴西坚果过敏原衍生的非天然存在的变异体，其核酸序列经密码子优化后，人工合成全长的重组巴西坚果过敏原基因。采用生物信息学软件分析其抗原表位，针对ー个或多个抗原性指数高的位点进行有目的的置換，获得重组巴西坚果过敏原突变体的基因，使其在保持原有生物学活性和空间结构的基础上，能够有效地降低重组巴西坚果过敏原的过敏原性。然后利用大肠杆菌表达系统，在人工控制的条件下，获得高纯度的重组巴西坚果过敏原及其突变体蛋白。与天然巴西坚果过敏原相比，该重组蛋白突变体与特异性IgE的结合性能明显减少，可安全地应用于过敏性基本的 预防和治疗。一种重组巴西坚果过敏原，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。上述重组巴西坚果过敏原的突变体，是在重组巴西坚果过敏原的突变体的基础上衍生的突变体，其中B细胞或/和T细胞表位的至少ー个表面暴露的保守氨基酸残基被在天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知的同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置不出现的另一残基取代，该突变体具有与天然出现的过敏原基本相同的α-碳骨架三级结构。本发明重组巴西坚果过敏原的突变体的制备方法,是在重组巴西坚果过敏原的突变体的基础上衍生的突变体，其中B细胞或/和T细胞表位的至少ー个表面暴露的保守氨基酸残基被在天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知的同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置不出现的另ー残基取代，该突变体具有与天然出现的过敏原基本相同的α-碳骨架三级结构。更进ー步地,所述表达宿主为大肠杆菌表达系统,该表达系统名称为Escherichiacoli JM109-B2SQ3，于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2011152，保藏日期为2011年4月29日，保藏地点为中国.武汉.武汉大学；该表达宿主表达与纯化后即获得权利要求I所述的重组巴西坚果过敏原。最详细的制备方法步骤如下
(O从数据库中获取巴西坚果过敏原的核酸序列,根据表达宿主的密码子偏好性对其进行密码子优化，优化后序列中GC含量为35飞5%，原氨基酸序列不变；
(2)人工合成优化后的核酸序列；
(3)经双酶切后，与表达载体连接，构建成重组载体；
(4)将重组载体转化表达宿主中，选择阳性转化物；
(5)在2(T38°C下，培养阳性转化物，用浓度为O.0Γ2. OmmoI/L的IPTG诱导重组蛋白表达，诱导温度为4 38°C ；
(6)所得培养物经裂解宿主细胞后，纯化获得高纯度的重组蛋白。本发明所述重组巴西坚果过敏原的突变体的制备方法包括如下步骤
Ca)采用生物信息学软件预测权利要求I所述重组巴西坚果过敏原的氨基酸序列的优势抗原表位；
(b)采用定点法改变抗原性高的位点，用天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知的同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置不出现的氨基酸残基取代原有的氨基酸残基；(C)获得巴西坚果过敏原突变体的基因片段，经酶切后，与表达载体连接，构建成突变型重组载体；
(d)按照前述步骤(4) (6)的方法，获得高纯度的重组突变蛋白。本发明所述重组巴西坚果过敏原及其突变体可以用于制备药物，制得的药物用于治疗变态反应性疾病并使对巴西坚果过敏原乃至其它类型过敏的患者产生免疫耐受；或者用来诊断变态反应性疾病或者判断其它食品药品的过敏源性的高低。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果 本发明利用基因工程技术，经密码子优化后人工合成重组巴西坚果过敏原的编码基因，并采用生物信息学软件分析其抗原表位，通过定点突变的方法，针对ー个或多个抗原性高的位点进行定向置換，以降低其过敏源性，构建成低过敏原性的重组巴西坚果过敏原突变体。利用在人工控制的条件下进行蛋白表达，获得高纯度的重组巴西坚果过敏原及其突变体蛋白。与天然巴西坚果过敏原相比，该重组蛋白突变体与特异性IgE的结合能力明显降低，可安全地应用于过敏性疾病的诊断与治疗乃至判断其它蛋白过敏原性的高低。
图I为重组巴西坚果过敏原蛋白的诱导表达电泳图。图中从左至右分别为Marker、未诱导菌、诱导菌体。Marker从上至下分别为97. 4，66.2，45. O, 31. O, 21. O,14. 4 kD。
具体实施例方式以下结合实施例来进ー步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例I重组巴西坚果过敏原的克隆与表达
(I)重组巴西坚果过敏原核酸序列的确定JANCBI数据库中获取天然巴西坚果过敏原的核酸序列(GenBank登录号M17146. I)，在该序列的C端加上方便纯化的亲和标签6*HIS、STREPII或S蛋白，然后分别在序列的N端和C端加上Nde I、Eco RI、Xho I、Pst I等酶切位点，得到重组巴西坚果过敏原的目的基因片段Ber el。(2)根据大肠杆菌的密码子偏好性，对目的基因Ber el的核酸序列进行密码子优化，使得目的基因更适合在宿主菌中表达，优化后GC含量为35飞5%，原氨基酸序列不变，如SEQ ID NO: I 所示。(3)人工合成优化后的Ber el基因序列。(4)经双酶切后，将目的片段Ber el克隆到原核表达载体pET上，构建重组表达质粒。(5)将重组表达质粒pET- Ber el转化入表达宿主菌Rosetta中。(6)选择含重组表达质粒pET- Ber el的表达宿主菌Rosetta在LB培养基中30-37°C培养1-6小时，加入浓度为O. 0Γ2. O mmol/L IPTG诱导表达2_8小时，诱导温度为4-38°C。诱导后，离心收集菌体，进行SDS-PAGE检测目的蛋白的表达量(见图I)。(7)超声破碎法裂解菌体获得目的蛋白的包涵体，裂解液为15-100 mM Tris-Hcl,50-300 mM NaCl, O. 05-1. O mM EDTA。(8)用透析法进行蛋白复性后，以8000-30000rpm的转速在4°C下离心15-30 min,
收集上清液。(9)复性后得到的上清液，经6*HIS、STREPII或S蛋白标签的亲和层析柱获得高纯度的目的蛋白。实施例2重组巴西坚果过敏原的抗原表位分析及突变位点的确定
(I)运用在线软件平台包括 SYFPEITHI，MHCPred, SYFPEITHI, BIMAS, NetMHC II， MHC-THREAD,EpiPredict,HLA-DR4 binding, ProPred, RankPep, SVMHC,PREDEP, PREDICT 等对重组巴西坚果过敏原的氨基酸序列的抗原指数进行分析。综合各软件的分析，结果表明重组巴西坚果过敏原氨基酸序列中1-15、18-42、70-95、98-116区域的抗原值较高。(2)针对抗原值比较高的一个或多个位点进行氨基酸置換，以弱化抗原性。将抗原性改造后的氨基酸序列再进行上述的抗原性分析，如此反复，筛选出抗原性显著降低的突变位点。实施例3重组巴西坚果过敏原突变体的构建
(I)针对确定的突变位点，按照突变试剂盒提供方法设计突变体引物，Tm值一般要求大于78 °C，引物长度在25-45个碱基之间比较适宜。(2)根据突变试剂盒的要求，以重组巴西坚果过敏原的重组表达质粒为模板，进行突变PCR。(3)用试剂盒中提供的酶消化PCR产物后，转化感受态细胞，挑取阳性克�。庑蚣觳馔槐涫欠癯晒�。
权利要求
1.一种重组巴西坚果过敏原，其特征在于是在重组巴西坚果过敏原的基础上衍生的非天然存在的突变体，其中B细胞或/和T细胞表位的至少ー个表面暴露的保守氨基酸残基被在天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知的同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置不出现的另ー残基取代，该突变体具有与天然出现的过敏原基本相同的α-碳骨架三级结构。
2.权利要求I所述的ー种重组巴西坚果过敏原的突变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO: I 所示。
3.权利要求I所述ー种重组巴西坚果过敏原的制备方法，其特征在于包括如下步骤编码权利要求I所述重组巴西坚果过敏原的基因依据相应的表达宿主的情况通过密码子优化得到，并以之获得重组载体后，转化大肠杆菌、酵母或植物，得到重组宿主，蛋白表达后得到权利要求I所述的重组巴西坚果过敏原。
4.根据权利要求3所述ー种重组巴西坚果过敏原的制备方法，其特征在于所述表达宿主为大肠杆菌表达系统，该表达系统名称为Escherichia coli JM109-B2SQ3，于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2011152，保藏日期为2011年4月29日，保藏地点为中国.武汉.武汉大学；该表达宿主表达与纯化后即获得权利要求I所述的重组巴西坚果过敏原。
5.根据权利要求3所述的ー种重组巴西坚果过敏原的制备方法，其特征在于包括如下步骤 (O从数据库中获取巴西坚果过敏原的核酸序列,根据表达宿主的密码子偏好性对其进行密码子优化，优化后序列中GC含量为35飞5%，原氨基酸序列不变； (2)人工合成优化后的核酸序列； (3)经双酶切后，与表达载体连接，构建成重组载体； (4)将重组载体转化表达宿主中，选择阳性转化物； (5)在2(T38°C下，培养阳性转化物，用浓度为O.0Γ2. Ommol/L的诱导剂来诱导重组蛋白表达，诱导温度为4 38°C ； (6)所得培养物经裂解宿主细胞后，纯化获得高纯度的重组蛋白。
6.权利要求2所述的ー种重组巴西坚果过敏原的突变体的制备方法，其特征在于包括如下步骤 Ca)采用生物信息学软件预测权利要求I所述重组巴西坚果过敏原的氨基酸序列的优势抗原表位； (b)采用定点法改变抗原性高的位点，用天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知的同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置不出现的氨基酸残基取代原有的氨基酸残基； (C)获得巴西坚果过敏原突变体的基因片段，经酶切后，与表达载体连接，构建成突变型重组载体； Cd)按照权利要求5所述步骤(4) (6)的方法，获得高纯度的重组突变蛋白。
7.权利要求1-6所述的重组巴西坚果过敏原或其突变体在制备药物中的应用，该药物用于治疗变态反应性疾病并使对巴西坚果过敏原乃至其它类型过敏的患者产生免疫耐受；或者用来诊断变态反应性疾病或者判断其它食品药品的过敏原性的高低。
8.权利要求7中所述的药物或诊断试剂，其特征在于它包含根据权利要求1飞中任意一项的重组过敏原，任选与药用或者诊断试剂中可接受的赋形剂和/或载体，并且任选佐 剂和/或偶联剂组合。
全文摘要
本发明公开了一种重组巴西坚果过敏原与突变体及其制备方法和应用。本发明所述重组巴西坚果过敏原是天然存在的过敏原衍生的非天然存在的变异体，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本发明利用基因工程技术，经密码子优化后人工合成重组巴西坚果过敏原的编码基因，采用生物信息学软件分析其抗原表位，通过定点突变针对一个或多个抗原性高的位点进行定向置换，降低其过敏源性，构建成低过敏原性的重组巴西坚果过敏原突变体。利用在人工控制的条件下进行蛋白表达，获得高纯度的重组巴西坚果过敏原及其突变体蛋白。与天然过敏原相比，该重组蛋白突变体与特异性IgE的结合能力明显降低，可安全地应用于过敏性疾病的诊断与治疗乃至判断其它蛋白质的过敏原性的高低。
文档编号G01N33/68GK102690340SQ20121008938
公开日2012年9月26日 申请日期2012年3月30日 优先权日2012年3月30日
发明者何颖, 刘雪婷, 邹泽红, 陈惠芳, 陶爱林, 高洁荣 申请人:广州医学院第二附属医院
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