专利名称：：质子敏感性g蛋白偶联受体及其dna序列的制作方法
技术领域：
：本发明涉及质子敏感性(proton-sensing)G蛋白偶联受体(此后称之为“质子敏感性GPCRs”)多肽及编码此类多肽的多核苷酸的新确定的用途，涉及它们在诊断和鉴定作为此类质子敏感性GPCRs的激动剂、拮抗物的化合物方面的用途，还涉及此类多肽和多核苷酸的产生。
背景技术：
：除了在钙代谢方面的作用，骨还在调节pH稳态方面发挥重要作用。骨具有相当大的缓冲能力，其可经细胞介导的过程立即(化学平衡)和缓慢地动员(BushinskyDA，2001，EurJNutr，40238-244)。在慢性酸中毒中，骨吸收有所增加，相比碱中毒倾向于刺激骨形成(LemannJ等人，1966，JClinInvest，451608-1614；ArnettTR等人，1996，Bone，18277-279；BushinskyDA，1996，AmJPhysiol，271F216-222；BushinskyDA，1999，AmJPhysiol，277F813-819)。由于次优的营养和衰退的肾功能，老年人常常呈现轻微的慢性酸中毒，这可导致增加的骨吸收，因而参与骨质疏松症的发展(BushinskyDA，2001，EurJNutr，40238-244；FrassettoLA等人，1996，AmJPhysiol，271F1114-22)。在骨细胞中起作用的pH敏感性机制至今仍是未知的。哮喘中，许多活性氮和氧种类的呼吸道浓度是高的。这些种类的稳定性和生物活性是pH依赖性的。急性哮喘患者中的脱气呼吸道水蒸汽冷凝物的pH低于对照受试者两个对数级以下，并且用皮质类固醇治疗使其正常化表明呼吸道pH是呼吸道炎症的重要决定因素(HuntJF等人，2000，AmJResp，161694-699)。已经表明呼吸道酸性加速嗜酸性粒细胞坏死，也表明呼吸道酸性在呼吸道炎症中的作用(HuntJF等人，2000，AmJResp，161694-699)。再次，呼吸道中细胞的pH敏感性机制是未知的。而且，最近发现嗜中性粒细胞的胞外活化诱导它们的激活(TrevaniAS等人，1999，JImmunology，1624849-4857)。嗜中性粒细胞在宿主对传染物的抵御中起重要作用并涉及许多炎性病症的发病机理(GanzTM等人，1988，AnnInternMed，109127)。所报道的胞外酸中毒对于自发性嗜中性粒细胞编程性细胞死亡的延迟、延长嗜中性粒细胞功能性寿命方面的影响也暗示了酸化在呼吸道炎症中的作用(TrevaniAS等人，1999，J.Immunol，1624849-4857)。支持酸化在呼吸道炎症中的作用的其它证据包括在降低的pH下(＜6.5)人支气管上皮外植体中的纤毛摆动频率减少或消失(LukKA等人，1983，ClinSci，64449-451)，降低的pH对于呼吸粘液粘性的影响(HolmaBO，1985，SciTotalEnviron，41101-123)和豚鼠模型中呼吸道酸化对于咳嗽的影响(RicciardoFLM，等人，1999，AmJRespCritCareMed，159557-562)。酸中毒是多种疾病例如癌症(Wike-Hooley等人，RadiotherOncol1984，2343-66)和局部缺血(WebsterKA，Cardivasc.Toxicol.2003，3283-98)的标志，其中已知血管发生发挥关键作用。然而，对于酸中毒对内皮细胞的影响还未充分理解。最近，已有显示酸性胞外pH可保护内皮细胞免于编程性细胞死亡(Terminella等人，Am.J.PhysiollungCellMolPhysiol2002，283L1291-302)。另外，酸中毒抑制由10％的FCS刺激的内皮细胞增殖、迁移以及毛细管形成，尽管有更多量的VEGF或bFGF产生和存在(D’Arcangelo等人，Circ.Res.2000，86312-8)。酸性胞外pH存在下，可观察到来自培养在三维胶原蛋白凝胶中的主动脉环的微血管生长的显著延迟。在外源生长因子例如VEGF和bFGF的存在下，该延迟得以减少，表明体内血管发生反应可能仍存在，因为在那些情况下有大量的血管发生生长因子存在(Burbridge等人，Angiogenesis1999，3281-88)。已有显示在肿瘤而不是有害的酸性环境中对肿瘤发展是传导性的，诱导肿瘤细胞的迁移和侵入(Martinez-Zaguilan等人，ClinExp.Metastasis1996，14，176-86)、基质降解性金属蛋白酶(MMPs)的分泌(Kato等人，CellBiol.Intn1996，20.375-7)、以及在体外和体内从肿瘤细胞(Fukumura等人，CancerRes.2001，616020-4)产生血管发生因子例如血管内皮生长因子(VEGF)(Shi等人，Oncogene2001，203751-6)和IL8(Shi等人，ClinCancerRes.1999，％3711-21；Karashima等人，ClinCancerRes2003，92786-97)。已有显示GPR4(此处确定为pH传感器)在HUVECs(人脐静脉内皮细胞)中有所表达，并且针对GPR4的siRNA显示出削弱HUVECs的增殖和管形成(XuY等人，2003，FirstannualAtherothrombosisSummitArterialInflammation(Sept.17-19)，abstract5)。发明概述本发明基于我们的意外发现——某些G蛋白偶联受体，尤其是OGR1、GPR4和TDAG8(TDAG8也称作GPR65)，作为质子敏感性受体(质子敏感性GPCRs)。因而，本发明涉及某些具有质子敏感性功能的GPCRs的新用途，涉及编码此类多肽的多核苷酸、重组材料及它们的产生方法。此类多肽和多核苷酸对于有关某些疾病治疗的方法具有重要性，所述疾病包括但不限于其中质子稳态受到改变的疾病和医学病症，例如在涉及提高的质子即氢离子水平的疾病和医学病症中，包括过度骨损失的疾�。ü侵适杷芍ⅲ乇鹗抢夏晷怨侵适杷芍⒑蜕鏊ソ叩贾碌墓侵适杷芍�。除了骨代谢，质子敏感性GPCRs可参与呼吸和心血管功能以及血液供应退化相关的病变例如炎症和局部缺血的调节。在进一步的方面，本发明涉及利用本发明提供的基因和多肽鉴定质子敏感性GPCRs的激动剂和拮抗物(例如，抑制剂)的方法，以及用所鉴定的化合物治疗与质子不平衡相关的病症的方法。在更进一步的方面，本发明涉及用于检测疾病的诊断试验，所述疾病与一种或多种不适当的质子敏感性GPCRs活性或水平相关。发明描述在第一方面，本发明涉及某些GPCR多肽在pH稳态中的新用途。此类多肽选自(a)分离的多肽，所述多肽由包含人OGR1(检索号NM_003485.1)、大鼠OGR1(检索号XM_234483)、小鼠OGR1(检索号NM_175493)、牛OGR1(检索号NM_174329)，优选地人OGR1(检索号NM_003485.1)、人GPR4(检索号NM_005282)、小鼠GPR4(检索号NM_175668)、人TDAG8(检索号NM_003608)和小鼠TDAG8(检索号NM_008152)的多核苷酸序列的多核苷酸编码；(b)分离的质子敏感性GPCR多肽，其包含与SEQIDNO1的多肽序列具有至少80％、优选地85％、更优选地90％、更优选地95％、更优选地96％、更优选地97％、更优选地98％、或者更优选地99％的同一性的多肽序列；b(c)分离的质子敏感性GPCR多肽，其包含与SEQIDNO1的多肽序列具有至少20％、优选地30％、更优选地32％、更优选地35％、更优选地45％的同一性的多肽序列；(d)分离的质子敏感性GPCR多肽，其包含与SEQIDNO3的多肽序列具有至少80％、优选地85％、更优选地90％、更优选地95％、更优选地96％、更优选地97％、更优选地98％、或者更优选地99％的同一性的多肽序列；(d)分离的质子敏感性GPCR多肽，其包含与SEQIDNO3的多肽序列具有至少20％、优选地30％、更优选地32％、更优选地35％、更优选地45％的同一性的多肽序列；(e)分离的质子敏感性GPCR多肽，其包含与SEQIDNO4的多肽序列具有至少80％、优选地85％、更优选地90％、更优选地95％、更优选地96％、更优选地97％、更优选地98％、或者更优选地99％的同一性的多肽序列；(f)分离的质子敏感性GPCR多肽，其包含与SEQIDNO4的多肽序列具有至少20％、优选地30％、更优选地32％、更优选地35％、更优选地45％的同一性的多肽序列；(g)分离的多肽，其包含SEQIDNO1、SEQIDNO3或SEQIDNO4的多肽序列。(h)分离的质子敏感性GPCR多肽，其具有与SEQIDNO1的多肽序列至少80％、优选地85％、更优选地90％、更优选地95％、更优选地96％、更优选地97％、更优选地98％、或者更优选地99％的同一性；(i)分离的质子敏感性GPCR多肽，其具有与SEQIDNO1的多肽序列至少20％、优选地30％、更优选地32％、更优选地35％、更优选地45％的同一性；(k)分离的质子敏感性GPCR多肽，其具有与SEQIDNO3的多肽序列至少80％、优选地85％、更优选地90％、更优选地95％、更优选地96％、更优选地97％、更优选地98％、或者更优选地99％的同一性；(l)分离的质子敏感性GPCR多肽，其具有与SEQIDNO3的多肽序列至少20％、优选地30％、更优选地32％、更优选地35％、更优选地45％的同一性；(m)分离的质子敏感性GPCR多肽，其具有与SEQIDNO4的多肽序列至少80％、优选地85％、更优选地90％、更优选地95％、更优选地96％、更优选地97％、更优选地98％、或者更优选地99％的同一性；(n)分离的质子敏感性GPCR多肽，其具有与SEQIDNO4的多肽序列至少20％、优选地30％、更优选地32％、更优选地35％、更优选地45％的同一性；(o)SEQIDNO1、SEQIDNO3或SEQIDNO4的多肽序列；(p)分离的质子敏感性GPCR多肽，其具有或包含这样的多肽序列，该序列与SEQIDNO1、SEQIDNO3或SEQIDNO4的多肽序列相比具有0.20，优选地0.30、更优选地0.32、更优选地0.45的同一性指数；(q)(a)至(p)中此类多肽的片段和变体；以及(r)(a)至(p)中的多肽，其显示出CCL39仓鼠成纤维细胞中pH依赖性肌醇磷酸或cAMP形成，或者CHOK1CRE-luc细胞或CCL39CRE-luc细胞中cAMP萤光素酶报道基因试验中的pH依赖性信号。本发明的多肽是多肽的G蛋白偶联受体家族的成员。将此处所定义的质子敏感性GPCRs多肽的生物学特性(例如，与骨质疏松症、呼吸疾�。缦�、急性/成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)和心血管疾病的发生相关联)在此后称作“质子敏感性GPCRs的生物活性”或“质子敏感性活性”。优选地，本发明的多肽呈现至少一种如上所述的质子敏感性GPCRs的生物活性。更优选地，本发明的多肽呈现OGR1、GPR4或TDAG8的至少一种生物活性。例如，人OGR1多肽和人TDAG8多肽的主要生物学特性与骨吸收性疾病相关，所述疾病包括但不限于过度骨损失导致的疾�。ü侵适杷芍�、齿龈病，例如齿龈炎和牙周炎、派杰病、恶性肿瘤的高血钙，例如，肿瘤诱导的高血钙和代谢性骨病。另外，人GPR4的主要生物学特性是例如与疾病(修饰化合物，即具有激动或/和拮抗作用的化合物在那些疾病中可能是有用的)相关，所述疾病涉及血管发生，由此引起例如，癌症疾�。缡堤辶觯脑嗉膊。缧难芗膊±缧募」Ｈ闹膊。缤庵芏鲎枞约膊。鄄。缣悄虿⌒允油げ”浠蚧瓢弑湫裕亟谘祝缋喾缡怨亟谘祝渲写瓷嘶だ碇匾募膊。约捌し舨�。此外，GPR4例如与疾病相关，所述疾病涉及炎性或阻塞性呼吸道疾�。鹄纾橹鹕恕⒅芄确从�、重构(remodelling)或疾病发展的诱导；所述炎性或阻塞性呼吸道疾病包括任意类型或起源的哮喘，其包括内源性(非过敏性)哮喘和外源性(过敏性)哮喘，轻微哮喘、中度哮喘、严重哮喘、支气管哮喘、用力诱发性哮喘、职业性哮喘以及细菌感染后引起的哮喘。本发明的多肽还包括前述多肽的变体，包括所有等位形式和剪接变体。此类多肽通过可能保守或非保守的插入、缺失和替换或其任一组合而不同于参考多肽。特别优选的变体是那些在其中以任意组合插入、替换或缺失了几个氨基酸，例如50至30、30至20、20至10、10至5、5至3、3至2、2至1或1个氨基酸的变体。本发明优选的多肽片段包括分离的多肽，其包含具有来自SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO4的至少30、50或100个连续氨基酸的氨基酸序列；或分离的多肽，其包含具有从SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO4的氨基酸序列截短或缺失的至少30、50或100个连续氨基酸的氨基酸序列。优选的片段是生物学活性片段，其阻断或增强本发明的GPCRs，特别是OGR1、GPR4或TDAG8的生物活性，所述片段包括那些具有类似活性或提高的活性或具有降低的不希望的活性的片段。同样优选的是在动物尤其是人中具有抗原性或免疫原性的那些片段。本发明的多肽片段可用于通过肽合成产生相应的全长多肽；因而，这些变体可用作产生本发明的全长多肽的中间物。本发明的多肽可为“成熟”蛋白质的形式或者可能是较大的蛋白质例如前体或融合蛋白质的一部分。包括另外的氨基酸序列常常是有利的，所述另外氨基酸序列包含分泌或前导序列、前序列、帮助纯化的序列例如多组氨酸残基、或用于重组产生中的稳定性的额外序列。本发明的多肽可以任意合适的方式制备，例如通过从天然存在的来源中、从包含表达系统的基因工程宿主细胞中分离(见下文)或通过化学合成，利用例如自动化肽合成仪，或此类方法的组合。制备此类肽的方法在本领域中是众所周知的。在另一方面，本发明涉及质子敏感性GPCR多核苷酸在pH稳态中的新用途。此类多核苷酸选自(a)分离的多核苷酸，其包含人OGR1(检索号NM_003485.1)、大鼠OGR1(检索号XM_234483)、小鼠OGR1(检索号NM_175493)、牛OGR1(检索号NM_174329)，优选地人OGR1(检索号NM_003485.1)、人GPR4(检索号NM_005282)、小鼠GPR4(检索号NM_175668)、人TDAG8(检索号NM_003608)和小鼠TDAG8(检索号NM_008152)，优选地人OGR1、人TDAG8和人GPR4的多核苷酸序列；(b)编码质子敏感性GPCR多肽序列的分离的多核苷酸，所述多肽序列与SEQIDNO1的多肽序列具有至少80％、优选地85％、更优选地90％、更优选地95％、更优选地96％、更优选地97％、更优选地98％或更优选地99％的同一性；(c)编码质子敏感性GPCR多肽序列的分离的多核苷酸，所述多肽序列与SEQIDNO1的多肽序列具有至少20％、优选地30％、更优选地32％、更优选地35％、更优选地45％的同一性；(d)编码质子敏感性GPCR多肽序列的分离的多核苷酸，所述多肽序列与SEQIDNO3的多肽序列具有至少80％、优选地85％、更优选地90％、更优选地95％、更优选地96％、更优选地97％、更优选地98％或更优选地99％的同一性；(d)编码质子敏感性GPCR多肽序列的分离的多核苷酸，所述多肽序列与SEQIDNO3的多肽序列具有至少20％、优选地30％、更优选地32％、更优选地35％、更优选地45％的同一性；(e)编码质子敏感性GPCR多肽序列的分离的多核苷酸，所述多肽序列与SEQIDNO4的多肽序列具有至少80％、优选地85％、更优选地90％、更优选地95％、更优选地96％、更优选地97％、更优选地98％或更优选地99％的同一性；(f)编码质子敏感性GPCR多肽序列的分离的多核苷酸，其与SEQIDNO4的多肽序列具有至少20％、优选地30％、更优选地32％、更优选地35％、更优选地45％的同一性；(g)分离的多核苷酸，其包含人OGR1(检索号NM_003485.1)、大鼠OGR1(检索号XM_234483)、小鼠OGR1(检索号NM_175493)、牛OGR1(检索号NM_174329)、人GPR4(检索号NM_005282)的多核苷酸序列；(h)人OGR1(检索号NM_003485.1)、大鼠OGR1(检索号XM_234483)、小鼠OGR1(检索号NM_175493)、牛OGR1(检索号NM_174329)、人GPR4(检索号NM_005282)的多核苷酸序列；(i)编码多肽序列的分离的多核苷酸序列，所述多肽序列与SEQIDNO1、SEQIDNO3或SEQIDNO4的多肽序列相比具有0.20、优选地0.30、更优选地0.32、更优选地0.45的同一性指数；(q)(a)至(i)中此类多核苷酸的片段和变体；以及(r)(a)至(i)中的多核苷酸，其编码的多肽显示出在CCL39仓鼠成纤维细胞中pH依赖性肌醇磷酸或cAMP形成，或者CHOK1CRE-luc细胞或CCL39CRE-luc细胞中cAMP萤光素酶报道基因试验中的pH依赖性信号。用于调节pH稳态的优选的多核苷酸片段包括分离的多核苷酸，其包含具有至少15、30、50或100个连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸来自人OGR1(检索号NM_003485.1)、大鼠OGR1(检索号XM_234483)、小鼠OGR1(检索号NM_175493)、牛OGR1(检索号NM_174329)，优选地人OGR1(检索号NM_003485.1)、人GPR4(检索号NM_005282)、小鼠GPR4(检索号NM_175668)、人TDAG8(检索号NM_003608)和小鼠TDAG8(检索号NM_008152)的序列；或者分离的多核苷酸，其包含具有至少30、50或100个连续核苷酸序列，所述连续氨基酸从人OGR1(检索号NM003485.1)、大鼠OGR1(检索号XM234483)、小鼠OGR1(检索号NM_175493)、牛OGR1(检索号NM_174329)，优选地人OGR1(检索号NM_003485.1)、人GPR4(检索号NM_005282)、小鼠GPR4(检索号NM_175668)、人TDAG8(检索号NM_003608)和小鼠TDAG8(检索号NM_008152)的序列中截短或缺失。用于调节pH稳态的优选的多核苷酸变体包括剪接变体、等位基因变体、和多态性，包括具有一个或多个单核苷酸多态性(SNPs)的多核苷酸。用于调节pH稳态的多核苷酸还包括编码多肽变体的多核苷酸，所述多肽变体包含SEQIDNO1、SEQIDNO3或SEQIDNO4的氨基酸序列，并且在其中以任意组合替换、缺失或增加了几个氨基酸残基，例如50至30、30至20、20至10、10至5、5至3、3至2、2至1或1个氨基酸残基。在另一方面，本发明提供了用于调节pH稳态的多核苷酸，其为本发明的DNA序列的RNA转录物。因此，提供了用于调节pH稳态的RNA多核苷酸，其(a)包含DNA序列的RNA转录物，所述DNA序列编码SEQIDNO1、SEQIDNO3或SEQIDNO4的多肽；(b)是DNA序列的RNA转录物，所述DNA序列编码SEQIDNO1、SEQIDNO3或SEQIDNO4的多肽；(c)包含人OGR1(检索号NM_003485.1)、大鼠OGR1(检索号XM_234483)、小鼠OGR1(检索号NM_175493)、牛OGR1(检索号NM_174329)，优选地人OGR1(检索号NM_003485.1)、人GPR4(检索号NM_005282)、小鼠GPR4(检索号NM_175668)、人TDAG8(检索号NM_003608)和小鼠TDAG8(检索号NM_008152)的DNA序列的RNA转录物；或者(d)是人OGR1(检索号NM_003485.1)、大鼠OGR1(检索号XM_234483)、小鼠OGR1(检索号NM_175493)、牛OGR1(检索号NM_174329)，优选地人OGR1(检索号NM_003485.1)、人GPR4(检索号NM_005282)、小鼠GPR4(检索号NM_175668)、人TDAG8(检索号NM_003608)和小鼠TDAG8(检索号NM_008152)的DNA序列的RNA转录物以及与其互补的RNA多核苷酸。人OGR1(检索号NM_003485.1)的多核苷酸序列是编码SEQIDNO1的多肽的cDNA序列。编码SEQIDNO1的多肽的多核苷酸序列可与人OGR1(检索号NM_003485.1)的多肽编码序列是同一的，或者它可为除人OGR1(检索号NM_003485.1)之外的序列，其由于遗传密码的冗余(简并)也编码SEQIDNO1的多肽。人GPR4(检索号NM_005282)的多核苷酸序列是编码SEQIDNO3的多肽的cDNA序列。编码SEQIDNO3的多肽的多核苷酸序列可与人GPR4(检索号NM_005282)的多肽编码序列是同一的，或者它可为除人GPR4(检索号NM_005282)之外的序列，其由于遗传密码的冗余(简并)也编码SEQIDNO3的多肽。人TDAG8(检索号NM_003608)的多核苷酸序列是编码SEQIDNO4的多肽的cDNA序列。编码SEQIDNO4的多肽的多核苷酸序列可与人TDAG8(检索号NM_003608)的多肽编码序列是同一的，或者它可为除人TDAG8(检索号NM_003608)之外的序列，其由于遗传密码的冗余(简并)也编码SEQIDNO4的多肽。用于调节pH稳态的多核苷酸可利用标准的克隆和筛选技术从cDNA文库中获得，所述cDNA文库来源于例如脑、肾、肺和免疫系统细胞中的mRNA(OGR1的表达见例如XuY等人，2000，NatCellBiol，2261-267；ZhuK等人，2001，JBiolChem，27641325-41335；XuY，等人，1996，Genomics，35397-402；GPR4的表达见AnS等人，1995，FEBSLetts，375121-124；TDAG8的表达见KyawH等人，1998，DNACellBiol，17493-500和ChoiJW等人，1996，CellImmunol，16878-84。)(标准克隆技术见例如，SambrookJ等人，1989，MolecularCloningALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y。)。本发明的多核苷酸还可从天然来源例如基因组DNA文库获得，或可利用众所周知的和商业上可获得的技术而得以合成。当本发明的多核苷酸用于重组产生用于调节pH稳态的多肽时，所述多核苷酸可包括成熟多肽自身的编码序列，或阅读框架中的成熟多肽的编码序列与其它编码序列，例如编码前导或分泌序列，前(pre-)、原(pro-)、前原(prepro-)蛋白质序列，或其它融合肽部分的那些序列。例如，可编码促进融合多肽纯化的标记序列。在本发明的此方面的某些优选实施方案中，标记序列是六组氨酸肽，如pQE载体(Qiagen，Inc.)所提供的和GentzR，等人，1989，ProcNatlAcadSciUSA86821-824中所描述的，或者是HA标记。多核苷酸还可包含非编码的5’和3’序列，例如转录的非翻译序列、剪接和多腺苷酸化信号、核糖体结合部位和稳定mRNA的序列。编码本发明多肽的多核苷酸，包括来自还未知物种的同源物，可通过包含下列步骤的方法来获得利用具有SEQIDNO1、SEQIDNO3或SEQIDNO4或其片段，优选地至少15个核苷酸的序列的标记探针在严格杂交条件下筛选文库；并分离包含所述多核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆。此类杂交技术对于技术人员是众所周知的。优选的严格杂交条件包括在42℃下在溶液中孵育过夜，所述溶液包含50％甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖、以及20微克/ml经变性、剪切的鲑精DNA；然后在约65℃下0.1×SSC中洗涤滤器。因而本发明还包括用于调节pH稳态的分离的多核苷酸，其优选地具有至少100个核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷酸通过利用标记探针在严格杂交条件下筛选文库获得，所述探针与编码SEQIDNO1、SEQIDNO3或SEQIDNO4或其片段的序列的多核苷酸互补，即杂交，所述探针优选至少15个核苷酸。本领域的技术人员懂得，在许多情况下，分离的cDNA序列是不完全的，因为编码多肽的区域未一直延伸到5’末端。这是逆转录酶的结果，逆转录酶是一种具有固有地低“持续合成能力”(酶在聚合反应过程中保持对模板的附着能力的量度)的酶，在第一链cDNA合成中未能完成mRNA模板的一个DNA拷贝。有几种可用的和对本领域技术人员众所周知的方法来获得全长cDNAs，或者延伸短cDNAs，例如那些基于cDNA末端快速扩增(RACE)的方法(见，例如，FrohmanMA等人，1988，ProcNatAcadSciUSA，858998-9002)。此技术的新改进，以Marathon(商标)技术(ClontechLaboratories，Inc.)为例，例如，已显著简化了对较长cDNA的搜索。在Marathon(商标)技术中，已从提取自所选组织的mRNA中制备出cDNAs，并将“衔接头”序列连接到每端。然后利用基因特异性和衔接头特异性的寡核苷酸引物进行核酸扩增(PCR)以扩增出cDNA的“缺少”的5’端。然后利用’嵌套’引物重复PCR反应，’嵌套’引物即，设计在所扩增的产物内部退火的引物(一般地，在衔接头序列中较远的3’退火的衔接头特异性引物和在已知基因序列中较远的5’退火的基因特异性引物)。然后可通过DNA测序分析此反应的产物，并通过直接将产物直接连接到现有的cDNA上以给出完整序列或利用新的序列信息设计5’引物进行单独的全长PCR来构建全长cDNA。本发明的重组多肽可通过本领域众所周知的方法从包含表达系统的基因工程宿主细胞中制备。因此，在进一步的方面，本发明涉及包含本发明的一种多核苷酸或多种多核苷酸的表达系统，涉及利用此类表达系统经基因工程产生的宿主细胞，并涉及通过重组技术产生本发明多肽。利用来源于本发明的DNA构建体的RNAs，无细胞翻译系统也可用于产生此类蛋白质。对于重组产生，宿主细胞可经基因工程化而掺入本发明多核苷酸的表达系统或其部分。可通过如许多标准实验室手册，例如Davis等人，1986，BasicMethodsinMolecularBiology和SambrookJ等人(同前)中所述的方法将多核苷酸引入宿主细胞。将多核苷酸引入宿主细胞的优选的方法包括，例如，磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂类介导的转染、电转染、转导、划痕标记示踪(scrapeloading)、弹道引入或感染。合适宿主的有代表性的实例包括细菌细胞，例如链球菌(Streptococci)、葡萄球菌(Staphylococci)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)细胞；真菌细胞，例如酵母细胞和曲霉(Aspergillus)细胞；昆虫细胞例如果蝇S2和SpodopteraSf9细胞；动物细胞例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293和Bowes黑色素瘤细胞；以及植物细胞。可使用很多种表达系统，例如，染色体的、附加型的和病毒衍生的载体，例如，衍生自细菌质粒、衍生自噬菌体、衍生自转座子、衍生自酵母附加体、衍生自插入元件、衍生自酵母染色体元件、衍生自病毒例如杆状病毒、乳多空病毒例如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒，以及衍生自它们的组合的载体，例如那些衍生自质�：褪删逡糯脑靥澹缯沉：褪删�。表达系统可包含调节并引起表达的控制区域。通常，任意能够在宿主中维持、繁殖或表达多核苷酸以产生多肽的系统或载体均可使用。通过多种众所周知的和常规技术中的任意一种可将合适的多核苷酸序列插入表达系统，所述技术为例如SambrookJ等人所述的那些技术(见上面)。可将合适的分泌信号掺入目的多肽以允许所翻译的蛋白质分泌进入内质网的内腔、周质间隙或胞外环境。这些信号对于多肽可为内源性的或者它们可为异源信号。可通过众所周知的方法从重组细胞培养物回收和纯化本发明的多肽，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最优选地，将高效液相层析用于纯化。当多肽在胞内合成、分离和/或纯化期间变性时，可使用用于再折叠蛋白质的众所周知的技术再生活性构象。通过检测相关基因中的突变，可将本发明的多核苷酸用作诊断试剂。对cDNA和基因组序列中以人OGR1(检索号NM_113485.1)、大鼠OGR1(检索号XM_234483)、小鼠OGR1(检索号NM_175493)、牛OGR1(检索号NM_174329)，优选地人OGR1(检索号NM_003485.1)、人GPR4(检索号NM_005282)、小鼠GPR4(检索号NM_175668)、人TDAG8(检索号NM_003608)和小鼠TDAG8(检索号NM_008152)的多核苷酸为特征的基因突变形式的检测和所述突变形式与功能异常的关系将提供诊断工具，该工具可增加或限定疾病的诊断或对疾病的敏感性，所述疾病由于所述基因的低表达、过表达或者改变的空间或时间表达而造成。基因中携带突变的个体可通过本领域众所周知的多种技术在DNA水平上进行检测。用于诊断的核酸可从受试者细胞中获得，例如从组织活体解剖或尸体解剖材料获得。基因组DNA可直接用于检测或者可利用PCR，优选地RT-PCR或其它扩增技术在分析前将其进行酶促扩增。RNA或cDNA也可以类似的方式使用。缺失和插入可通过扩增产物与正常基因型相比在大小上的改变而得以检测。点突变可通过扩增的DNA与标记的OGR1核苷酸序列杂交来鉴定。优选地通过RNA酶消化或通过解链温度的差别可将完全匹配的序列与错配的双链体区分开。DNA序列的差别也可通过DNA片段在含有或不含变性剂的凝胶中电泳迁移率的改变或通过直接的DNA测序而得以检测(见，例如，MyersRM等人，1985，Science，2301242-1246)。特定位置的序列改变可通过核酸酶保护试验例如RNA酶和S1保护或者化学切割方法来揭示(见Cotton等人，1985，ProcNatlAcadSciUSA，854397-4401)。可构建包含本发明的多核苷酸或其片段的寡核苷酸探针的阵列来进行有效的例如遗传突变的筛选。此类阵列优选地是高密度阵列或方格网(grids)。阵列技术方法是众所周知的且具有普遍的适用性，并可用于处理分子遗传学中的多种问题，包括基因表达、遗传连锁、遗传变异性，见，例如，CheeM等人，1996，Science，274610-613和其中所引用的其它参考文献。对多肽或mRNA表达的异常降低或增加水平的检测也可用于诊断或确定受试者对本发明的疾病的敏感性。可利用任意本领域众所周知的用于多核苷酸定量的方法在RNA水平对减少或增加的表达进行测量，所述方法为例如，核酸扩增，例如PCR、RT-PCR、RNA酶保护、RNA印迹法和其它杂交方法。可用于确定来源于宿主的样品中蛋白质，例如本发明的多肽水平的试验技术对于本领域的技术人员是众所周知的。此类试验方法包括放射免疫测定法、竞争性结合试验、蛋白质印迹分析和ELISA试验。因此在另一方面，本发明涉及诊断试剂盒，其包含(a)本发明的多核苷酸，优选地人OGR1(检索号NM_113485.1)、大鼠OGR1(检索号XM_234483)、小鼠OGR1(检索号NM_175493)、牛OGR1(检索号NM_174329)，优选地人OGR1(检索号NM_003485.1)、人GPR4(检索号NM_005282)、小鼠GPR4(检索号NM_175668)、人TDAG8(检索号NM_003608)和小鼠TDAG8(检索号NM_008152)的核苷酸序列，或者其片段或RNA转录物；(b)与(a)的核苷酸序列互补的核苷酸序列；(c)本发明的多肽，优选地SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO4或其片段；或者(d)针对本发明多肽的抗体，优选地针对SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO4的多肽的抗体。可以理解，在任意这种试剂盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可包含实质性成分。这种试剂盒在诊断疾�。绕涫潜痉⒚鞯募膊』蚨约膊〉拿舾行缘确矫媸怯杏玫摹１痉⒚鞯亩嚯谋泶镉诶缒�、肾、肺和免疫系统的细胞中(XuY等人，2000，NatCellBiol，2261-267；ZhuK等人，2001，JBiolChem，27641325-41335；XuY等人，1996，Genomics，35397-402)。本发明另一方面涉及抗体。本发明的多肽或它们的片段，或表达它们的细胞，可用作免疫原来产生对本发明的多肽免疫专一的抗体。术语“免疫专一”意味着抗体对本发明的多肽比对现有技术中的其它相关多肽具有基本上更大的亲和力。产生的针对本发明多肽的抗体可利用常规方案通过将多肽或携带表位的片段或细胞施用于动物，优选地非人类的动物来获得。对于单克隆抗体的制备，提供通过连续细胞系培养物所产生的抗体的任意技术均可使用。实例包括杂交瘤技术(KohlerG和MilsteinC，1975，Nature，256495-497)、三体瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(KozborD等人，1983，ImmunologyToday，472)和EBV杂交瘤技术(Cole等人，1985，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，77-96，AlanR.Liss，Inc.)。用于产生单链抗体的技术，例如美国专利号4,946,778中所述的那些技术，也可适用于产生针对本发明多肽的单链抗体。另外，转基因小鼠或其它生物，包括其它哺乳动物，可用于表达人源化抗体。上述抗体可用来分离或鉴定表达多肽的克隆或通过亲和层析来纯化多肽。针对本发明多肽的抗体也可用来治疗本发明的疾病等等。本发明的多肽和多核苷酸也可用作疫苗。因此，在进一步的方面，本发明涉及用于诱导哺乳动物中免疫反应的方法，其包含用本发明的多肽接种哺乳动物，所述多肽足够产生抗体和/或T细胞免疫反应，所述T细胞包括，例如，产生细胞因子的T细胞或细胞毒性T细胞，以保护所述动物免于疾�。蘼奂膊∈欠褚言诟鎏迥谛纬�。哺乳动物中的免疫反应还可通过下述方法来诱导，该方法包括经载体递送本发明的多肽，所述多肽在体内指导多核苷酸表达并编码所述多肽，以便诱导此类免疫反应而产生抗体来保护所述动物免于本发明的疾病。施用载体的一种途径是通过作为颗粒上的包衣等将其加速进入目的细胞。此种核酸载体可包含DNA、RNA、修饰的核酸、或DNA/RNA杂合体。为使用疫苗，多肽或核酸载体通常以疫苗制剂(组合物)提供。该制剂可还包含合适的载体(carrier)。由于多肽在胃中可被破坏，优选地将其肠胃外施用(例如，皮下、肌内、静脉内、或皮内注射)。适合于肠胃外施用的制剂包括水性的和非水性的无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与受者的血液等渗的溶质；以及水性的和非水性的无菌悬液，其可包括悬浮剂和增稠剂。制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如，密封的安瓿和小瓶，并可贮存于冷冻干燥的环境中，使用前只需即刻加入无菌液态载体。疫苗制剂也可包括用于增强制剂免疫原性的佐剂系统，例如水包油系统和本领域已知的其它系统。剂量取决于疫苗的比活并且可通过常规实验容易地确定。本发明的多肽具有一种或多种生物学功能，其在预防和治疗一种或多种疾病状态方面具有相关性。此类疾病状态是本发明多肽的蛋白质水平或活性异常即未在正常范围内的疾病。此类疾病包括例如涉及由生物(例如卡氏肺囊虫(pneumocystiscarinii)、trypsanomacruzi、trypsanomabrucei、crithidiafusiculata)感染造成的疾�。约凹纳娌。缪娌『团奔�、肿瘤(肿瘤侵入和肿瘤转移)，和其它疾�。缫烊拘阅园字什 ⒓∮涣�、肌萎缩及类似疾病。而且，本发明的多肽可涉及由过度骨损失导致的疾�。ü侵适杷芍�、齿龈病例如齿龈炎和牙周炎、派杰病、恶性肿瘤的高血钙，例如，肿瘤诱导的高血钙和代谢性骨病。另外，本发明的多肽可涉及过度软骨或基质降解的疾病，包括骨关节炎和类风湿性关节炎以及某些涉及蛋白水解酶的高水平表达和基质退化的瘤疾病。而且，本发明的多肽可涉及冠状�。ǘ鲋嘌不�(包括动脉粥样斑块破裂和不稳定)、自身免疫病、呼吸系统疾病和免疫介导的疾病(包括移植排斥)。此外，本发明的多肽可涉及多种起源的骨质疏松症(例如幼年的、更年期的、更年期后的、外伤后的、由老年或由皮质类固醇治疗或不活动引起的)。此外，本发明的多肽可涉及炎性或阻塞性呼吸道疾�。佣穑纾橹鹕�、支气管过度反应、重构或疾病发展的诱导；本发明所适用的炎性或阻塞性呼吸道疾病包括任意类型或起源的哮喘，其包括内源性(非过敏性)哮喘和外源性(过敏性)哮喘，轻微哮喘、中度哮喘、严重哮喘、支气管性哮喘、用力诱发性哮喘、职业性哮喘以及细菌感染后引起的哮喘。患有哮喘的受试者还包括例如低于4或5周岁的受试者，其呈现喘息症状并经诊断或可诊断为“喘息婴儿”，其是主要医学关注的一种已确定的患者种类，目前常被鉴定为初期或早期哮喘病(为方便起见，将此特定的哮喘病症称为“喘息性婴儿综合征”)，而且，本发明的多肽可涉及哮喘的预防性治疗，症状发作例如急性哮喘或支气管收缩发作的频率或严重性的降低、肺功能的增强或改善的呼吸道超反应性可证明这一点。对于其它症状治疗的需要减少可进一步证明，所述治疗即当发作发生时用于或意图限制或中止症状发作，例如消炎药(例如皮质类固醇)或支气管舒张剂。哮喘的预防性益处在倾向于“morningdipping”的受试者中尤为明显。“orningdipping”是公认的哮喘综合征，为大多数哮喘症所共有并且特征是例如在上午4到6点钟之间哮喘发作，即在一个通常基本上远离任意先前所施用的症状性哮喘治疗的时间发作。而且，本发明的多肽可涉及其它炎性或阻塞性呼吸道疾病和病症，例如急性肺损伤(ALI)、急性/成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺、呼吸道或肺疾病(COPD、COAD或COLD)，包括慢性支气管炎或与此相关的呼吸困难、肺气肿以及由于其它药物治疗，尤其是其它吸入性药物治疗导致的呼吸道超反应性的恶化。本发明的多肽还涉及无论何种类型或起源的支气管炎包括，例如急性支气管炎、花生仁吸入性支气管炎、卡他性支气管炎、格鲁布性支气管炎、慢性支气管炎或结核性支气管炎。本发明的多肽所涉及的其他的炎性或阻塞性呼吸道疾病包括任意类型或起源的肺尘埃沉着病(炎性的、通常职业性的肺�。３０樗婧粑雷枞曰蚣毙裕⒂煞锤吹幕页疚攵�)，包括，例如矾土肺、炭肺、石棉肺、石末肺、驼鸟毛尘肺、铁尘肺、硅肺、烟尘肺和棉尘肺。考虑到它们的消炎活性，特别是涉及嗜酸性细胞活化的抑制，本发明的多肽也涉及病症，例如嗜酸性细胞增多，尤其是嗜酸性细胞相关的呼吸道病症(例如，包括肺部组织的病态嗜酸性细胞浸润)包括嗜酸细胞过多，由于其影响呼吸道和/或肺以及，例如，相应或伴随于勒夫勒综合征、嗜酸性细胞肺炎、寄生虫(尤其是后生动物)侵袭(包括热带嗜酸性细胞增多症)、支气管肺的曲霉病、结节性多动脉炎(包括丘-斯综合征)、嗜酸细胞肉芽肿的嗜酸性细胞相关的呼吸道病症，以及由药物反应引起的影响呼吸道的嗜酸性细胞相关的病症。有益影响在本领域通常所知的体外和体内药理学测试中得以评估，并如此处所举例说明。上面引用的性质在体外和体内测试中是可证明的，所述测试方便地利用哺乳动物，例如大鼠、小鼠、狗、兔子、猴子或分离的器官和组织，以及天然的或通过例如重组技术制备的哺乳动物的酶制剂。本发明多肽的激动剂或拮抗物，其可通过如此处所述的例如实施例10中的筛选试验来获得，在体外可以溶液的形式使用，例如优选地水性溶液或悬浮液，且在体内肠道或肠胃外地方便地经口施用，例如以悬浮液或水溶液或以固体胶囊剂或片剂剂型施用。在哮喘或类似疾病情况下，可直接将激动剂和拮抗物递送到肺。体外的剂量可在大约10-5摩尔与10-9摩尔浓度范围间。体内剂量可取决于施用途径，为大约0.1到100mg/kg。筛选技术本发明的多核苷酸、多肽和针对多肽的抗体也可用于设计用于检测所加化合物对细胞中mRNA和多肽的产生的影响的筛选方法。例如，可利用单克隆和多克隆抗体通过本领域已知的标准方法来构建酶联免疫吸附测定法用于测量分泌的或结合细胞的多肽的水平。这可用于从适合操作的细胞或组织中发现可抑制或提高多肽产生的介质(也分别称为拮抗物或激动剂)。本发明的多肽可用于通过本领域已知的标准受体结合技术来鉴定膜结合的或可溶的受体(如果有的话)。这些技术包括，但不限于配体结合和交联测定法，其中多肽经放射性同位素(例如，125I)标记、化学修饰(例如，生物素化的)，或融合到适合检测或纯化的肽序列上，并与假定受体的来源(细胞、细胞膜、细胞上清液、组织提取液、体液)孵育。其它方法包括生物物理技术例如表面等离子体共振和分光术。这些筛选方法也可用于鉴定多肽的激动剂和拮抗物，它们与多肽竞争结合其受体(如果有的话)。用于构建此类测定法的标准方法在本领域中是众所周知的。本发明多肽的拮抗物的实例包括抗体或者，在一些情况下，与配体、底物、受体、酶等等紧密相关的寡核苷酸或蛋白质，视情况而定，多肽的拮抗物可以为，例如配体、底物、受体、酶等等的片段；或结合到本发明的多肽但不引起反应因而多肽活性受到抑制的小分子。筛选方法还包括转基因技术的使用。构建转基因动物的领域是成熟的。例如，可将OGR1、GPR4或TDAG8基因通过显微注射引入已受精的卵母细胞的雄原核中，通过逆转录病毒转移进前或后植入胚，或者例如通过电穿孔注射遗传修饰的胚胎干细胞进入宿主囊胚泡。尤其有用的转基因动物是所谓的“敲入”动物，其中用人的等同基因取代了该动物基因组中的动物基因。敲入转基因动物在药物发现过程中对于靶标确认是有用的，其中化合物对于人靶标是特异的。其它有用的转基因动物是所称作的“敲除”动物，其中部分或完全消除了本发明的并且由细胞中内源性DNA序列编码的多肽的动物直向同源物的表达。基因敲除可靶向特定细胞或组织，由于技术的局限性可仅发生于某些细胞或组织，或者可发生于动物中所有或基本上所有的细胞。转基因动物技术也提供了完整的动物表达克隆系统，其中引入的基因得以表达而产生大量本发明的多肽。用在上述方法中的筛选试剂盒形成了本发明另一方面。此类筛选试剂盒包含(a)本发明的多肽；(b)表达本发明多肽的重组细胞；(c)表达本发明多肽的细胞膜；或者(d)本发明多肽的抗体；该多肽优选地是SEQIDNO1、SEQIDNO3或SEQIDNO4的多肽；可以理解，在任意此种试剂盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可包含实质成分。术语表提供下列定义以帮助理解上文中所频繁使用的某些术语。如此处所用的“抗体”包括多克隆和单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体和人源化抗体、以及Fab片段，包括Fab或其它免疫球蛋白表达文库的产物。“分离的”意味着经人手从其自然状态改变，即如果它出现在自然中，那么它已获得改变或从其最初的环境中移出，或二者均有。例如，天然存在于活有机体中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但从其自然状态的共存的材料中分离出的相同多核苷酸或多肽是“分离的”，如此处所使用的术语。而且，通过转化、基因操作或通过任意其它重组方法引入有机体的多核苷酸或多肽是“分离的”，即使它仍旧存在于所述的有机体中，该有机体可为活的或非活的。“多核苷酸”通常指多核糖核苷酸(RNA)或多脱氧核糖核苷酸(DNA)，其可为未修饰的或修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括，但不限制，单和双链DNA、为单和双链区域的混合物的DNA、单和双链RNA、及为单和双链区域的混合物的RNA、杂合分子，其包含可为单链或更典型地双链或单和双链区域的混合物的DNA和RNA。另外，“多核苷酸”涉及包含RNA或DNA或RNA和DNA二者的三链区域。术语“多核苷酸”也包括含有一个或多个修饰碱基的DNAs或RNAs和具有出于稳定性或其它原因经修饰的主链的DNAs或RNAs。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化碱基和稀有碱基例如肌苷。可对DNA和RNA进行多种修饰，因而，“多核苷酸”包含如自然界中通常发现的多核苷酸的化学地、酶促地或代谢地修饰形式，以及病毒和细胞的DNA和RNA特征的化学形式。“多核苷酸”还包含相对短的多核苷酸，经常称为寡核苷酸。“多肽”指包含通过肽键或修饰的肽键彼此相连的两个或多个氨基酸的任意多肽，即肽等构物。“多肽”涉及短链，通常称为肽、寡肽或寡聚体，还涉及更长的链，通常称为蛋白质。多肽可含有除20种基因编码的氨基酸外的氨基酸。“多肽”包括通过自然过程，例如翻译后加工，或通过本领域众所周知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。此类修饰在基础课本和更详细的专题论文以及长篇的研究文献中有详细描述。修饰可发生于多肽的任意地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。可以理解，同种类型的修饰在给定多肽的几个位置可以以相同或不同的程度存在。而且，给定的多肽可含有多种类型的修饰。多肽可因遍在蛋白化而得以分支，并且它们可为环状的，带有或没有分支。环状的、分支的和分支环状多肽可由翻译后天然加工而产生或通过合成的方法来制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、生物素化、黄素的共价附着、血红素部分的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂类或脂类衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸对蛋白质的添加，例如精氨酰化和遍在蛋白化(见，例如，Proteins-StructureandMolecularProperties，第二版，T.E.Creighton，W.H.FreemanandCompany，NewYork，1993；Wold，F.，Post-translationalProteinModificationsPerspectivesandProspects，1-12，inPost-translationalCovalentModificationofProteins，B.C.Johnson，Ed.，AcademicPress，NewYork，1983；Seifter等人，″Analysisforproteinmodificationsandnonproteincofactors″，MethEnzymol，182，626-646，1990，andRattan等人，″ProteinSynthesisPost-translationalModificationsandAging″，AnnNYAcadSci，663，48-62，1992)。多肽序列的“片段”指比参考序列短但基本上保持与SEQIDNO1，SEQIDNO3或SEQIDNO4的参考多肽相同生物学功能或活性的多肽序列。多核苷酸序列的“片段”指比人OGR1(检索号NM_003485.1)、大鼠OGR1(检索号XM_234483)、小鼠OGR1(检索号NM_175493)、牛OGR1(检索号NM_174329)，优选地人OGR1(检索号NM_003485.1)、人GPR4(检索号NM-005282)、小鼠GPR4(检索号NM_175668)、人TDAG8(检索号NM_003608)和小鼠TDAG8(检索号NM_008152)的参考序列短的多核苷酸序列。“变体”指与参考多核苷酸或多肽不同但保持其基本性质的多核苷酸或多肽。多核苷酸的一般变体在核苷酸序列上不同于参考多核苷酸。变体的核苷酸序列中的变化可能或可能不改变参考多核苷酸所编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸变化可导致参考序列所编码的多肽中的氨基酸替换、添加、缺失、融合和截短，如下所述。多肽的一般变体在氨基酸序列上不同于参考多肽。通常，改变是有限的，因而参考多肽和变体的序列总体上是非常类似的，在许多区域是相同的。变体与参考多肽可通过一个或多个任意组合的替换、插入、缺失而不同。替换的或插入的氨基酸残基可能或可能不是由遗传密码编码的。一般的保守替换包括Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln，Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe与Tyr。多核苷酸或多肽的变体可能是天然存在的例如等位基因，或者它可以是所知的不是天然存在的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在的变体可通过诱变技术或直接合成来制备。另外包括为变体的是具有一个或多个翻译后修饰的多肽，所述翻译后修饰为例如糖基化、磷酸化、甲基化、ADP核糖基化等等。实施方案包括N末端氨基酸的甲基化、丝氨酸和苏氨酸的磷酸化及C末端甘氨酸的修饰。“等位基因”指的是发生于基因组中的特定基因座的基因的两个或更多备选形式之一。“多态性”指的是在一个群体内部基因组中的给定位置上核苷酸序列(和所编码的多肽序列，如果有关)中的变异。“单核苷酸多态性”(SNP)指的是一个群体内部基因组中在单个核苷酸位置上核苷酸变异性的发生。SNP可发生在基因内或基因组的基因间区域。SNPs可利用等位基因特异性扩增(ASA)来测定。对于该方法至少需要3条引物。一条通用引物用于所要测定的多态性的反向互补中。该通用引物可在距离多态碱基的50至1500bps间。另外两条(或更多)引物是彼此相同，只是最后的3’碱基摇摆以匹配构成多态性的两个(或更多)等位基因中的一个。然后对样品DNA进行两次(或更多)PCR反应，每次利用通用引物和一条等位基因特异性引物。此处所用的“剪接变体”指的是产生自RNA分子的cDNA分子，所述RNA分子最初转录自相同的基因组DNA序列但已经历了备选RNA剪接。当原初RNA转录物经历剪接时发生备选RNA剪接，通常用于内含子的去除，导致产生一种以上的mRNA分子，每种mRNA分子可编码不同的氨基酸序列。术语剪接变体也指由上述cDNA分子所编码的蛋白质。“同一性”反映了比较序列所确定的两个或多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列之间的关系。通常，同一性指的是分别两个多核苷酸或两个多肽序列在所比较的序列长度上精确的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的对应。“％同一性”——对于其中没有精确对应的序列，可测定“％同一性”。通常，将比对所要比较的两个序列以给出两个序列间最大的相关性。这可包括在一个或两个序列中插入“缺口”，以提高比对的程度。％同一性可在每个所要比较的序列全长上来测定(所称作的全局比对)，这特别适合于同样或非常类似长度的序列，或者在较短的限定的长度上来测定(所称作的局部比对)，这更适合于不等长度的序列。“不平衡的pH范围/不平衡的质子稳态”——正常的动脉pH范围(7.36至7.44)大约包含正常群体的两个标准差；将任意在此范围之外的认为异常。临床上，pH的“安全”范围是大约7.30至7.52；在此范围内pH本身通常不是威胁生命的。由于改变的酶活性和增强的心肌应激性，在此范围之外的pH是可能威胁生命的，应当采取直接措施将pH恢复到正常(来源http://www.mtsinai.org/pulmonary/books/physiology/chap71.htm)。因此，“不平衡的pH范围/不平衡的质子稳态”意味着在本专利申请的上下文中是除7.36至7.44之外的局部或系统pH值。“相似性”是对两个多肽序列间的关系的进一步更加复杂的测定。通常，“相似性”意味着两条多肽链的氨基酸间的比较，以残基与残基间的比较为基�。唤隹悸堑嚼醋悦扛鏊冉�(对于同一性)序列的残基对间严格的对应，而且考虑在无精确对应的地方，基于进化基�。桓霾谢欠窨赡艽媪硪徊谢�。这种可能性有相关的“分数”，从中可确定两序列的“％相似性”。用于比较两个或多个序列同一性和相似性的方法在本领域是众所周知的。因而例如，在WisconsinSequenceAnalysisPackage，版本9.1(DevereuxJ等人，NucleicAcidsRes，12，387-395，1984，从GeneticsComputerGroup，Madison，Wisconsin，USA可获得)中可获得的程序，例如程序BESTFIT和GAP，可用于确定两个多核苷酸间的％同一性以及两个多肽间的％同一性和％相似性。BESTFIT使用Smith和Waterman的“局部同源性”算法(JMolBiol，147，195-197，1981，AdvancesinAppliedMathematics，2，482-489，1981)并发现了两序列间相似性的最佳的单个区域。BESTFIT更适合于比较长度不同的两个多核苷酸或两个多肽序列，此程序假定该较短的序列代表较长序列的一部分。比较中，GAP比对两序列，根据Neddleman和Wunsch(JMolBiol，48，443-453，1970)的算法，寻找“最大相似性”。GAP更适合于比较大约相同长度的序列，并且期望在全长上进行比对。优选地，每个程序中所用的参数“缺口权重”和“长度权重”分别对于多核苷酸序列是50和3，对于多肽序列是12和4。优选地，当所比较的两序列是最佳比对的，确定％同一性和相似性。其它用于确定序列间同一性和/或相似性的程序在本领域也是已知的，例如BLAST家族程序(AltschulSF等人，JMolBiol，215，403-410，1990，AltschulSF等人，NucleicAcidsRes.，25389-3402，1997，从国家生物技术信息中心(NCBI)可获得，Bethesda，Maryland，USA，并可通过NCBI的主页www.ncbi.nlm.nih.gov进入)和FASTA(PearsonWR，MethodsinEnzymology，183，63-99，1990；PearsonWR和LipmanDJ，ProcNatAcadSciUSA，85，2444-2448，1988，可作为WisconsinSequenceAnalysisPackage的一部分而获得)。优选地，将BLOSUM62氨基酸替换矩阵(HenikoffS和HenikoffJG，Proc.Nat.AcadSci.USA，89，10915-10919，1992)用于多肽序列比较，包括其中核苷酸序列在比较之前首先翻译成氨基酸序列。优选地，使用程序BESTFIT以确定查询多核苷酸或多肽序列相对于参考多核苷酸或多肽序列的％同一性，最佳比对的查询和参考序列以及程序的参数设置为缺省值，如上文所述的。“同一性指数”是序列相关性的测量，其可用于比较候选序列(多核苷酸或多肽)和参考序列。因而，例如，具有例如与参考多核苷酸序列相比为0.95的同一性指数的候选多核苷酸序列与参考序列是同一性的，只是候选多核苷酸序列可能包括参考序列的每100个核苷酸平均多达5个差异。此类差异选自至少一个核苷酸缺失、替换包括转换和颠换、或插入。这些差异可发生于参考多核苷酸序列的5’或3’末端位置或这些末端位置间的任意地方，单独地散布在参考序列的核苷酸中或者以一个或多个相邻组的形式散布在参考序列内。换言之，为获得具有与参考多核苷酸序列相比具有同一性指数为0.95的多核苷酸序列，在参考序列的每100个核苷酸中平均最多5-25个可能缺失、替换或插入，或其任意组合，如上文所述。类似地，对于多肽，具有例如与参考多肽序列相比为0.95的同一性指数的候选多肽序列与参考序列是同一性的，只是候选多肽序列可以包括参考序列的每100个氨基酸平均最多5个差异。此类差异选自至少一个氨基酸缺失、替换包括保守和非保守替换、或插入。这些差异可发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置或在这些末端位置间的任意地方，单独地散布在参考序列的氨基酸中或者以一个或多个相邻组的形式散布在参考序列内。换言之，为获得与参考多肽序列相比具有同一性指数为0.95的多肽序列，在参考序列的每100个氨基酸中平均最大5个可以缺失、替换或插入，或其任意组合，如上文所述的。核苷酸或氨基酸差异的数目与同一性指数之间的关系可以下列方程式来表达na≤xa-(xa·I)其中na是核苷酸或氨基酸差异的数目，xa分别为如人OGR1(检索号NM_003485.1)、大鼠OGR1(检索号XM_234483)、小鼠OGR1(检索号NM_175493)、牛OGR1(检索号NM_174329)，优选地人OGR1(检索号NM_003485.1)、人GPR4(检索号NM_005282)、小鼠GPR4(检索号NM_175668)、人TDAG8(检索号NM_003608)和小鼠TDAG8(检索号NM_008152)中所列的核苷酸的总数，或者SEQIDNO1、SEQIDNO3或SEQIDNO4中氨基酸的总数。I是同一性指数，·是乘法算子的符号，其中将xa与I的任意非整数乘积下舍入至最接近的整数，然后将结果从xa减去。“同源物”是本领域中所用的一般性术语，指具有关于参考序列的高度序列相关性的多核苷酸或多肽序列。此相关性可如上文所述通过确定两序列间的同一性和/或相似性程度来量化。属于此一般术语的是术语“直向同源物”和“共生同源物”。“直向同源物”指的是那些为另一物种中多核苷酸或多肽的功能等同物的多核苷酸或多肽。“共生同源物”指的是那些在同一物种内部功能上类似的多核苷酸或多肽。“融合蛋白质”指的是由两种不相关的、融合基因或其片段编码的蛋白质。此说明书所引用的所有出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，以其完整内容在此处引用作为参考，就像每个单独的出版物或参考文献被专门且个别地指出在此处引用作为参考一样。任何本申请所要求优先权的专利申请也以其完整内容以上述对于出版物和参考文献的方式在此处引用作为参考。实施例实施例1OGR1的克隆和稳定细胞系的产生CCL39仓鼠成纤维细胞、HEK293人胚肾细胞、和MG63人骨肉瘤细胞(所有细胞系来自ATCC＝美国典型培养物保藏中心(Americantypeculturecollection)，Manassas，USA)培养于碳酸氢盐缓冲的DMEM和Ham’sF12培养基的1∶1混合物中，其中添加了10％的胎牛血清和抗生素，在pH7.4下于CO2气中培养。建立了人小梁骨来源的前成骨细胞(preosteoblasts)的原代培养物并如前面详细描述的进行培养(SottileV等人，2002，Bone，30699-704)。通过将来自人基因组DNA的此受体的cDNA(U48405，NM_003485)克隆到pcDNA3.1(+)/myc-His(Invitrogen，巴塞尔，瑞士)来制备人OGR1的表达载体。利用来自Stratagene(巴塞尔，瑞士)的QuickChange试剂盒来进行定点诱变。为了稳定转染，利用PvuI.Stable将载体线性化并利用Effectene试剂(Qiagen，巴塞尔，瑞士)进行瞬时转染。接着，利用抗生素G418(400μg/ml)的筛�。掷氤霰泶锸芴宓奈榷ǖ南赴禾�。转基因的表达和膜定位通过利用FITC标记的抗myc的抗体(Zymed/Stehelin&Cie，巴塞尔，瑞士)进行免疫细胞化学而得以证实。实施例2OGR1是激活IP形成的质子敏感性G蛋白偶联受体肌醇磷酸(IP)形成测定缓冲液和pH用于IP形成实验的盐溶液用单独的HEPES(20mM)或HEPES/EPPS/MES(每种8mM)来缓冲，以覆盖更宽的pH范围。HEPES是4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸，EPPS是N’-(2-羟基乙基)哌嗪-N’-3-丙磺酸，MES是2-(N-吗啉代)乙烷磺酸。利用仔细校准的pH计(Metrohm，Herisau，瑞士)在室温下将所有溶液的pH调至指示值。该报告中的所有数据都参照室温下的pH。为获得37℃下的pH，根据我们的校准实验，对于pH6.8-7.8范围内的HEPES缓冲液应当减去0.15pH单位。IP形成测定在无血清的DMEM培养基中用myo[3H]肌醇(100MBq/ml；ART/AnawaTrading，Wangen-Duebendorf，瑞士)标记生长在24孔板中的汇合的细胞培养物24小时。然后在37℃下将细胞在含有130mMNaCl、0.9mMNaH2PO4、5.4mMKCl、0.8mMMgSO4、1.8mMCaCl2、25mM葡萄糖的缓冲盐溶液中孵育。加入锂(20mM)以阻断肌醇单磷酸酶活性，导致IP1的积聚(BerridgeMJ等人，1982，BiochemJ，206587-595；BerridgeMJ和IrvineRF，1989，Nature，341197-205)。在需指示之处，将牛凝血酶或SPC(均来自Sigma，Buchs，瑞士)在加入锂之前1分钟加入。除非另有说明，持续孵育20分钟。然后严格地如前所述的(SeuwenK等人，1988，EMBOJ，7161-168)，用冰预冷的甲酸抽提细胞并利用分批柱层析从游离肌醇中分离总IPs。结果随着OGR1的瞬时或稳定表达，观察到在转染的细胞中磷酸肌醇代谢的强烈的且明显的配体依赖性激活。此效果在缺乏钙、镁、磷酸盐、硫酸盐的测定缓冲液中持续，排除了OGR1经任意这些成分激活的可能。然而，缓冲液pH的改变强烈地影响肌醇磷酸(IP)形成将稳定表达OGR1的CCL39仓鼠成纤维细胞在不同pH的HEPES缓冲的盐溶液中孵育，并在37℃下缺乏或存在肌醇单磷酸酶抑制剂锂的情况下测定IPs的积聚(BerridgeMJ等人，1982，BiochemJ，206587-595；BerridgeMJ和IrvineRF，1989，Nature341197-205)。在pH7.6，存在锂时IP形成接近于背景，然而，较低的pH引起IPs的显著积聚，其在30分钟内是线性的并在pH6.8时最高。我们的标准测定缓冲液的pH是7.4，其解释了为何在前面的实验中观察到了显著的基础活性。可将质子对OGR1的激活绘制备标准的浓度-反应曲线，覆盖较宽范围的胞外pH。CCL39仓鼠成纤维细胞中所表达受体的半最大激活发生在pH7.48+/-0.04(平均值+/-sem；N＝12)。激活似乎是高度协同的，具有＞2的希尔系数。在酸性环境下(pH＜6.5)，IP形成再次下降，反映出在CCL39细胞中磷酸肌醇信号系统的通常的pH依赖性。SPC——据报道激活OGR1的生物活性脂类——不刺激我们考虑的受体，也不影响IP形成的pH依赖性刺激。该分子是有活性的，然而，抑制其它细胞系统中的毛喉素刺激的腺苷酸环化酶，暗示着它作用于至今还未明确的不同于OGR1的受体。重要地，未转染的细胞或表达其它受体的细胞未显示出磷酸肌醇代谢的pH依赖性刺激。类似地，针对其它受体激动剂的反应在pH7-8的范围内不被正向调节，如为凝血酶所证实的，所述凝血酶激活CCL39细胞中内源性受体(ParisS和PouyssegurJ，1986，EMBOJ，555-60)。百日咳毒素(PTX)不抑制在pH7、锂的存在下所测定的IP形成，强烈表明OGR1通过Gq激活磷酸肌醇代谢。针对凝血酶的反应附加于这些细胞中由OGR1所引发的信号，所述反应在pH7和pH7.6受到PTX的部分抑制，如早期工作所期望的(ParisS和PouyssegurJ，1986，EMBOJ，555-60)。在中性或轻微酸性pH下OGR1的激活是非常强的。与通过其同源配体引发的其它GPCRs的激活相当。在瞬时转染的HEK细胞和稳定转染的HEK细胞中也观察到IP形成的强pH依赖性激活(半最大激活在pH7.38+/-0.04(平均值+/-sem；N＝4))。一些pH激活的通道对于温度是非常敏感的(SmithGD等人，2002，Nature，418186-190)。然而，在pH7.6和pH7.0所测定的对于OGR1的IP形成速率仅仅受到范围在35-42℃的温度的最低程度的影响。实施例3OGR1的受体模型受体模型考虑到OGR1和其它视紫红质样的GPCRs间的高相似性，以所公布的视紫红质结构(PalczewskiK，等人，2000，Science289739-745)为模板建立同源性模型。将OGR1的一级序列与牛视紫红质(bRHO)相比对，且对于指示氨基酸的位置，利用SCWRL程序(BowerMJ，等人，1997，JMolBiol，2671268-1282)将bRHO中存在的侧链用OGR1的相应侧链替换。应用分子力学和动力学完善所获得的结构，利用具有ε＝1*r的距离依赖性电介质函数的AMBER力场(CornellWD等人，1995，JAmChemSoc，1175179-5197)的parm96.dat参数，我们自己的用于能量完善的Wit！P软件的minimax�？椋约癆MBER6程序包的sander_classic�？�。在所有计算过程中，通过用谐波电势固定处于运动中的Cα原子或者通过限制它们的位置在0.5A内(势能最小化)。胞外环和所有氨基酸侧链在力场的电势内得以自由运动。在残基CYS94和CYS172之间引入二硫键。胞内环未包括在内。结果在OGR1的pH依赖性激活中组氨酸应当发挥重要作用。确实，对受体的3D模型的检查表明几个组氨酸可能聚簇于胞外表面，置于螺旋I、IV和VII的顶端，及胞内环1和2中。所有组氨酸在小鼠、大鼠、和牛的序列(分别见检索号XM_138218、XM_234483和U88367)中都是保守的。特别地，该模型预测在未质子化状态下H20和H269之间有直接的氢键相互作用，从而连接螺旋I和螺旋VII。次级相互作用可能在H17和H84之间，连接受体N末端与胞外环1。然而，考虑到胞外环的柔性，与H20和H269间的相互作用相比，此相互作用似乎更少可能形成，且在我们的模型中需要最初限制以使其落在恰当位置。在受体的其它位置发现另外的组氨酸，但它们与其它残基的相互作用或强静电相互作用似乎较不明显。我们着手分别将所有可能关键的组氨酸突变至苯丙氨酸，并测定瞬时转染实验中的pH依赖性受体激活。通过免疫细胞化学，利用C末端myc标记对所有受体构建体筛选重组蛋白质表达，并发现重组蛋白质以相似的水平表达于细胞膜上。组氨酸89、159、175的突变在受体功能未有主要影响。然而，与我们的预期一致，组氨酸17、20、84、269每个都是对pH变化的正常敏感性所需要的。另外，H169是重要的。这些氨基酸的突变导致了在pH6.8不能刺激IP形成的受体，然而，一旦将其暴露于更酸的pH，可恢复活性。质子浓度-反应曲线似乎向右移位，即，对于配体的敏感性降低。在任意情况下均不能观察到增强的pH依赖性的基础活性。基于我们的模型，对H169在质子敏感性中的参与情况的直接解释是困难的，因为H169的位置在胞外环2，目前还不能很好地预测其几何形状。H245的突变不是可耐受的，导致严重的(尽管但不全部)功能损失。根据我们的模型，此氨基酸定位于螺旋VI，朝向液体环境，并可能为整个结构的完整性所需。为了产生具有最低数目的组氨酸且在pH7-7.8仍有功能的受体，我们制备并测试了H89、159、175F构建体。所编码的蛋白质确实仍像野生型受体一样在瞬时转染的HEK细胞中起作用。组氨酸对能够与Zn2+和Cu2+原子配位，且该事实已被用于研究GPCR结构-功能(EllingCE等人，1995，Nature，37474-77)。基于我们的模型，我们预期Zn2+和Cu2+通过稳定H20-H269对和可能H17-H84对的未质子化状态而抑制质子依赖性受体激活。确实，两种离子的微摩尔浓度强烈抑制在pH6.9时所刺激的OGR1依赖性IP形成。在对照CCL39细胞中，Cu2+对凝血酶刺激的IP形成仍旧没有影响，Zn2+离子导致该反应的部分抑制。实施例4OGR1的RT-PCR表达图谱RT-PCR表达图谱利用酸性苯酚方法从细胞培养物中制备总RNA。利用SuperscriptII对RNA进行DNA酶处理并反转录(LifeTechnologies/Invitrogen，巴塞尔，瑞士)。用ExpandHighFidelityTaq(Roche，巴塞尔，瑞士)利用下列温度循环方案建立用于OGR1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPDH)的平行反应94℃下30秒变性，65℃(OGR1)或55℃(GPDH)下45秒退火，72℃下50秒延伸；对于OGR1为36个循环，对于GPDH为30个循环。测定GPDH作为mRNA量的内标。对于OGR1，克隆PCR反应产物并通过测序进行验证。用到下列引物OGR1正向5′-CTGAGCCCATGAGGAGTGTG-3′，反向5′-GGTAGGACGCCAGCAGCAGG-3′；GPDH正向5’-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3’，反向5’-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3’通过RT-PCR的表达图谱揭示了在MG63人骨肉瘤细胞中OGR1的mRNA的存在，并且确实我们发现这些细胞对中性或酸性pH强烈地反应，伴随IP形成。该信号在幅度上与由缓激肽引发的信号相当，缓激肽激活MG63细胞中的内源受体(BrechterAB等人，2002，RegulPept，10339-51)。在pH7.46+/-0.01(平均值+/-sem；N＝5)观察到半最大激活。IP形成对PTX预处理是不敏感的并受微摩尔浓度的铜离子抑制，这重述了上述关于成纤维细胞中OGR1的异位表达的结果。对于分离自小梁骨的原代人成骨细胞前体，获得了类似的结果。原代细胞中的半最大激活发生于pH7.41+/-0.02(平均值+/-sem；N＝3)。实施例5OGR1的表达研究利用FITC标记的抗myc的抗体(No.132511，Zymed/Stehelin&Cie，巴塞尔，瑞士)检测重组受体。为检测质膜标志物膜联蛋白V，用到alexa标记的抗体(No.A13202，JuroSupply，Luzern，瑞士)。用染料H33258(Sigma，Buchs，瑞士)染核。对骨组织的实验用石蜡包埋的器官的4μm切片进行，所述器官收集自6个月龄的雌性Wistar大鼠。将切片在二甲苯中脱腊并利用胃蛋白酶消化来暴露抗原(10分钟，Sigma，Buchs，瑞士)。通过用3％过氧化氢的孵育5分钟，然后用10％山羊血清孵育1小时封闭内源过氧化物酶。利用兔多克隆抗体(1∶100，3小时孵育)来进行免疫组织化学检测，所述抗体由LifespanBiosciencesInc.(西雅图，美国)开发，针对肽表位CFVSETTHRDLARLRG(SEQIDNO2)，其与人和大鼠OGR1是相同的。利用ABC过氧化物酶染色试剂盒(SantaCruzBiotechnology/LabForce，Nunningen，瑞士)来显示染色。对于大鼠骨切片的免疫组织化学(如上面段落所述)将OGR1定位于成骨细胞和骨细胞。实施例6OGR1-1敲除小鼠OGR1-1敲除小鼠的产生同源重组的靶载体的产生小鼠OGR1-1转录物mCT51440经鉴定在小鼠基因组Celera数据库中对应于小鼠12号染色体上命名为mCG51257的基因座。根据Celera序列信息设计引物来扩增基因组DNA，用以产生同源重组和敲除OGR-1基因的靶载体。引物序列和用于两侧翼基因组区域扩增的条件是对于区域1正向引物TS145CTATCTGCATGTGGAGCCCC和反向引物TS140CTGGCAGGATAGGTCACCAT。利用KODHotStartDNA聚合酶(Novagen/Juro，Luzerne，瑞士)在T3PCRBiometra循环变温器中进行PCR。简而言之，将200ng129Sv基因组DNA与200μMdNTP混合物、600nM正向引物、600nM反向引物、5μl10XPCR缓冲液(1mMMgSO4)和1μlKODHotStartDNA聚合酶一起制备于50μl的总体积中。用于基因组DNA扩增的设置为94℃3分钟，然后35个循环的94℃30秒、58℃30秒、68℃5分钟，然后在68℃下最后延伸5分钟。最后，将反应物冷却至4℃。利用ZerobluntTopoPCR克隆试剂盒(LifeTechnologies/Invitrogen，巴塞尔，瑞士)根据厂商说明书将4μl的PCR产物亚克�。司庑蛑な档膒TOPO-区域1。对于区域2正向引物TS143GCTTGCATGGTGGCTGTCTC和反向引物TS142TACAACACCACCTGCACAGA。利用PfuDNA聚合酶(Promega，Wallisellen，瑞士)在PerkinElmerPE9600PCR循环变温器中进行PCR。简而言之，将200ng129Sv基因组DNA与200μMdNTP混合物、1μM正向引物和1μM反向引物、1×PfuDNA聚合酶缓冲液(含有2mMMgSO4)、5％的二甲亚砜(DMSO)和1.25μlPfuDNA聚合酶一起制备于50μl的总体积中。用于基因组DNA递降扩增的设置为94℃3分钟，10个循环的94℃30秒、68℃(-1℃/循环)30秒、68℃5分钟，然后25个循环的94℃30秒、55℃30秒、68℃5分钟，以及在68℃下10分钟的最后步骤。最后，将反应物冷却至4℃。利用正向引物TS167CCATCGATGCTTGCCTCTAAACTAGTCT和反向引物TS168ATAGTTTAGCGGCCGCCTCTACTGTCCTTGTGGCTT，用Pfu聚合酶在与上面相同的条件下，通过嵌套PCR对1μl此PCR反应物进行扩增。利用ZerobluntTopoPCR克隆试剂盒(Invitrogen，巴塞尔，瑞士)根据厂商说明书将4μl的PCR产物亚克隆并通过测序证实。为产生用于同源重组的靶载体，利用区域1作模板以及引物正向TS170CCCAAGCTTAGAGCAGGTGACTGTGCATA和反向TS171CCGCTCGAGCTTTGGGCCAGAAGGAGCCT扩增基因组片段1。10ng的pTopo-区域1用作PCR混合物中的模板，所述PCR混合物如利用KODHotStart聚合酶扩增区域1所描述的。在T3PCRBiometra循环变温器中进行PCR且设置为94℃2分钟，然后31个循环的94℃15秒、58℃30秒、74℃1分30秒，然后在74℃最后延伸1分钟。利用PCR纯化试剂盒(Qiagen，巴塞尔，瑞士)根据厂商说明书来纯化所扩增的PCR片段，将其用限制酶HindIII和XhoI消化，连接进入HindIII/XhoI消化过的载体pRAY-2(检索号U63120)，并经测序确认。利用1μlpTopo-区域2作模板和正向引物TS167以及反向引物TS168来扩增第二个基因组片段。PCR混合物如同区域1的扩增所述的且设置为94℃2分钟，然后35个循环的94℃15秒、55℃30秒、68℃1分30秒，然后是最后的延伸步骤68℃5分钟。利用ZerobluntTopoPCR克隆试剂盒亚克隆所扩增的PCR片段并通过测序证实。在用限制酶ClaI和NotI消化后，将PCR片段连接进入ClaI/NotI消化过的包含片段1的载体pRAY-2。所获得的OGR1靶载体通过测序来证实。胚胎干细胞培养和转染利用限制酶ScaI将最后的OGR-1靶载体线性化并在250V和500μF下将17μg电穿孔进入1.5×10e7129S3小鼠胚胎干细胞(ES细胞)。将细胞培养在含有原代失活的胚胎成纤维细胞的6cm皿中。电穿孔后24小时加入含有G418的选择培养基(200μg/ml，Gibco/Invitrogen，巴塞尔，瑞士)。在电穿孔后10天分离出抗性胚胎干细胞并通过嵌套PCR分析以鉴定靶构建体进入OGR-1基因座的同源重组事件(通过PCR进行基因分型)。通过PCR进行基因分型用50μl裂解缓冲液(0.05％SDS，50μg/ml蛋白酶K，10mMTris/HCL，pH7.4)提取胚胎干细胞并利用1μl粗胚胎干细胞提取物与200μMdNTP混合物、600nM正向引物、600nM反向引物、1xTaqPCRmaster混合物(Qiagen，巴塞尔，瑞士)一起以25μl的总体积，在TgradientPCRBiometra循环变温器中进行诊断PCR。PCR所用的引物是用于第一次扩增的正向引物TS207TGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGC和反向引物TS203CCAGGGTAGCTTTGCAACATGC，以及用于嵌套反应的正向引物TS208AGCGCATCGCCTTCTATCGCC和反向引物TS204ATGGGCTTTGCCATGAGGCAG。PCR条件是95℃3分钟；35个循环的95℃30秒、62℃45秒、72℃2分钟。对于嵌套反应，将1μl的初次反应物在95℃3分钟；25个循环的95℃30秒、62℃45秒、72℃2分钟来进行扩增。最后，在1％琼脂糖凝胶上对10μl的嵌套PCR反应物进行分析。胚胎干细胞的Southern基因分型为了产生适合于DNA印迹杂交的探针，利用100ngpTopo区域1作模板通过PCR扩增OGR1基因组区域。扩增所用引物为，正向TS146CAAGGGCAGGGGAGTCAAGG和反向TS159TAATTATTCTACTTTATTAC。PCR混合物如上所述，利用PfuDNA聚合酶。用于PCR的设置是94℃2分钟，10个循环的94℃15秒、55℃(-1℃/循环)15秒、72℃30秒，接着是25个循环的94℃15秒、45℃15秒、72℃30秒。最后，将反应物冷却至4℃。利用PCR纯化试剂盒如上所述对所扩增的PCR片段进行纯化。利用12μg基因组DNA和限制酶SspI/RsrII或SspI/XhoI，将来自129S3胚胎干细胞的基因组DNA消化过夜。所消化的DNA在0.9％琼脂糖凝胶上得以分离并印迹到HybondN+膜(Amersham，Dübendorf，瑞士)上。利用AmershamrediprimeII试剂盒如生产商所述的进行含有32P-dCTP的DNA探针的随机引物标记。在PerfectHybPlus杂交缓冲液(Sigma，Buchs，瑞士)中65℃下将膜杂交过夜，在0.5×SSC、0.1％SDS中洗涤并通过曝光至KodakX-O-Mat胶片而成像。在相同条件下利用对应于pRAY2载体的NheI/BamHI片段的neo探针来确认靶构建体的单一整合。染色体组型分析在进行染色体舒展(spread)前一天将胚胎干细胞分裂。为了染色体舒展，用10μg/ml秋水仙素(KaryoMax，Gibco/Invitrogen，巴塞尔，瑞士)在37℃和10％CO2中处理胚胎干细胞4.5小时，然后在室温下预热的(37℃)0.56％KCl中孵育10分钟。通过利用冰预冷的甲醇/醋酸(3∶1)固定。在显微镜上分析染色体的舒展。胚泡注射和繁殖将靶定的胚胎干细胞注射进C57Bl/6宿主胚泡并将其转移入假孕的C57Bl/6xBalb/cN1代孕母亲中。通过皮毛着色可鉴定嵌合后代。用129S3野生型雌性与雄性嵌合体交配。通过基因分型PCR测试后代的种系传递。实施例7用于OGR1的激动剂或拮抗物的筛选试验方法利用钙指示剂Flou-3和荧光成像平板读出器(MolecularDevices/BucherBiotech，巴塞尔，瑞士)记录胞质钙瞬变(transients)。用乙酰氧基甲基酯的染料(2μg/ml)对OGR1转染的CCL39细胞染色，该染色在37℃下包含5mMproenicide的完全培养基中进行1小时，以抑制多种药物抗性转运蛋白。然后洗涤细胞并在包含130mMNaCl、0.9mMNaH2PO4、5.4mMKCl、0.8mMMgSO4、1.8mMCaCl2、25mM葡萄糖、5mMHEPES的pH7.6的缓冲盐溶液中室温下维持45分钟。为鉴定受体拮抗物，在此次孵育的最后15分钟内加入测试化合物。在转移至读出器之后，记录基线(Fb)，然后通过加入合适量的较强缓冲液(20mMHEPES，pH6)引起酸化来刺激细胞。备选地，在此阶段加入测试化合物来鉴定激动性分子。计算F’＝(F-Fb)/Fb将荧光读数F归一化。结果胞外pH从pH7.6变化至更酸的值导致了胞内钙浓度的快速而瞬时的升高，表明阳离子从胞内贮藏的释放。反应的幅度是pH依赖性的，随酸度而升高。半最大活性发生于pH7.20+/-0.04(平均值+/-sem；N＝3)。受体拮抗物阻断荧光信号。实施例8GPR4的克隆和稳定细胞系产生利用引物GPR4F和GPR4R(5’CACCATGGGCAACCACACGTGGGAGGGCTGC3’和5’TCATTGTGCTGGCGGCAGCATCTTCAGCTGCA3’分别地)从基因组DNA中扩增人GPR4。PCR反应混合物含有0.2mMdNTPs、1xPCR缓冲液(含有1.5mMMgCl2)、0.5单位TaqDNA聚合酶、40pmol每种引物和无菌水，总体积50μl。用于此反应的模板是人基因组DNA(Promega，Southampton，英国)。利用BiometraT3循环变温器利用下列循环条件进行PCR在95℃变性2分钟，然后35个循环的95℃变性15秒、60℃退火15秒和72℃延伸1分钟。最后的延伸在72℃下进行7分钟。纯化1.1kb的PCR产物并将其克隆进pcDNA3.1D/V5-His-TOPO(Invitrogen，Paisley，英国)。在CHOK1CRE-lu细胞或CCL39CRE-luc细胞中产生表达GPR4的稳定细胞系，所述细胞稳定表达cAMP依赖性萤光素酶报道基因以检测响应配体的cAMP的变化。利用Lipofectamine2000(Invitrogen，Paisley，英国)根据厂商方案，通过转染GPR4cDNA表达构建体来在上述细胞系中产生稳定细胞系。转染的细胞在400μg/ml或1mg/ml的G418的存在下进行选择。3周的抗生素选择后，挑选出单个克隆并将其扩大用于进一步分析。实施例9GPR4是激活cAMP形成的质子敏感性G蛋白偶联受体cAMP形成试验在无血清DMEM培养基中，用[3H]腺嘌呤(100MBq/ml；Amersham，Dübendorf，瑞士)标记培养于24孔板中的汇合的细胞培养物4小时。然后在37℃下在如上面用于IP试验(实施例2)的缓冲的盐溶液中孵育细胞。根据指示，将磷酸二酯酶抑制剂异丁基甲基黄嘌呤(IBMX，1mM)加入以允许cAMP的积聚。孵育时间是15分钟。然后用冰预冷的三氯乙酸提取细胞并利用分批柱层析将cAMP与游离的腺嘌呤和ATP分离(SalmonY，1979，Adv.Cycl.NucleotRes，1035-55)。结果如上所述的表达研究和cAMP形成试验表明该受体确实对与OGR1非常相似的范围中的pH变化起反应。SPC，其据报道是GPR4的配体(ZhuK等人，2001，JBiolChem，27641325-41335)，自身不调节pH依赖性刺激且不激活cAMP形成。在瞬时转染的HEK293细胞中，GPR4对cAMP的半最大激活发生于pH7.55+/-0.02(平均值+/-sem；N＝6)。实施例10用于GPR4的激动剂或拮抗物的筛选试验在进行试验的前一天，将如实施例8中所述的共表达GPR4和cAMP萤光素酶报道基因的细胞以每孔10-20,000个细胞接种于白色96孔板中，并在37℃下5％CO2的存在中孵育过夜。用200μlHBS缓冲液(130mMNaCl、0.9mMNaH2PO4、0.8mMMgSO4、1.8mMCaCl2、5.4mMKCl、25mM葡萄糖、20mMHEPES)在合适的pH洗涤细胞一次，所述缓冲液含有合适的所要测试的化合物，例如可使用任意内部或商业上可获得的化合物库。在37℃下非CO2培养箱中孵育平板4-5小时。4-5小时后从细胞中吸出缓冲液并用200μl的HBSpH7.4洗涤细胞一次。通过加入100μl的HBSpH7.4和100μl的SteadyGlo萤光素酶试剂(Promega，Southampton，英国)裂解细胞，并将其置于旋转平台上剧烈旋转25-30分钟。利用发光剂测定发光。在酸性pH缓冲液(pH6.8或pH7.0)中，产生了高发光信号。试验中，例如在酸性pH缓冲液(pH6.8或pH7.0)中通过与无化合物对照相比发光信号的减弱来表征拮抗物。实施例11GPR4的RT-PCR表达图谱RNA提取和第一链cDNA合成利用RNeasy提取试剂盒(Qiagen，Crawley，英国)根据厂商的方案从细胞中制备RNA。所用细胞是原代人支气管上皮细胞(HBECs)、分化的HBECs、原代人肺成纤维细胞，原代人支气管平滑肌细胞(BSMC)、人外周血T细胞和人外周血嗜中性粒细胞。原代人细胞从Biowhittaker购买或，有指示之处，根据标准方法分离自外周人血液。利用第一链cDNA合成试剂盒(Roche，Lewes，英国)中所提供的试剂和方案从分离自细胞的总RNA制备第一链cDNA。RT-PCR通过逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)将GPR4受体在来源于组织和上述的不同细胞类型中的cDNA中作图。用于RT-PCR图谱的组织cDNA购买自Clontech(Basingstoke，英国)。每个反应混合物总体积为25μl，含有0.2mMdNTPs、1xPCR缓冲液(包含1.5mMMgCl2，)、0.5单位的TaqDNA聚合酶、50pmol的每种引物和去离子水。所用模板cDNA来自商业化的来源于组织样品的cDNA(来自ClontechpanelI和II(2.5μl))，或来自从如前面部分所述的细胞类型制备的cDNAs(1μl)。所用的GPR4RT-PCR引物如下5’TGGGCGTCTACCTGATGAA3’和5’GGGTTTGGCTGTGCTGTT3’。利用BiometraTrioPCR机器在0.2ml的管中进行循环。循环条件如下1个循环的94℃变性1分45秒，然后35个循环的94℃变性15秒、60℃退火15秒、72℃延伸30秒。在1.5％的琼脂糖凝胶上分析反应物并用溴化乙锭染色。对照RT-PCR反应用对于持家基因GAPDH特异的引物来进行。定量RT-PCR通过TaqMan定量RT-PCR来测定总RNA样品中的信使RNA水平。引物和探针作为预优化试剂从AppliedBiosystems(Warrington，英国)购买获得。定量RT-PCR反应以25μl终体积一式三份地进行，并在每个反应物中含有1xTaqManUniversalPCRmastermix靶cDNA制备物。利用ABIPRISM7700序列检测器(AppliedBiosystems，Warrington，英国)来进行实验，并利用ABIPRISM7700SequenceDetectionSystem软件来分析。扩增条件如下50℃2分钟和95℃10分钟，然后40个循环的95℃15秒和60℃1分钟。数据通过从利用12种人组织的cDNA库产生的标准曲线外推来定量，针对持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)归一化。表1GPR4的表达图谱数据的概要实施例12GPR4的免疫定位研究利用FITC标记的抗myc的抗体(No.132511，Zymed/Stehelin&Cie，巴塞尔，瑞士)来检测重组受体。为检测质膜标志物膜联蛋白V，使用了alexa标记的抗体(No.A13202，JuroSupply，Luzern，瑞士)。用染料H33258(Sigma，Buchs，瑞士)染核。在polysine载玻片上封片的3μm的肺组织石蜡切片上进行人组织的实验。首先用二甲苯和工业用甲基化酒精(IMS)至70％IMS处理石蜡切片，并用甲醇中的0.05％的过氧化氢封闭内源性过氧化物酶。微波照射后将切片在DakopH6的抗原回收溶液中染色。多余的背景染色利用Dako无血清蛋白质阻断剂降低5分钟。利用由LifespanBiosciencesInc.(西雅图，美国)开发的兔多克隆抗体(1∶500，4℃过夜)进行免疫组织化学检测，所述抗体针对肽表位RSDVAKALHNLLRFLASDK(SEQIDNO5)，其为人GPR4的表位，或备选地利用针对肽表位DELFRDRYNHTFCFEKFPME(SEQIDNO6)所产生的兔多克隆抗体，所述表位为人和小鼠GPR4的。通过首先利用Dako稀释剂中的Dako生物素化的猪抗兔免疫球蛋白(1∶200)处理30分钟来显示染色。洗涤步骤后，用Dako链霉亲和素-生物素过氧化物酶复合体(SABCpx)处理切片。用二氨基联苯胺(DAB)来显现反应位置。用Cole’s苏木精对核进行复染色。表2经免疫组织化学分析的GPR4的蛋白质表达上面的数据表明GPR4蛋白质的表达在哮喘病患者的呼吸上皮中是上调的，表明可能存在与疾病的联系。GPR4蛋白质在正常受试者的肺组织中是缺失的或仅微弱表达。在正常肺组织的肺泡巨噬细胞、嗜中性粒细胞和支气管平滑肌中GPR4蛋白质的表达证实了mRNA水平的结果(表1)。实施例13GPR4的功能性试验(嗜中性粒细胞趋化性试验)根据以前发表的方法(FrevertCW等人，JImmunologyMethods，1998，21341)以96孔板形式进行试验。所有细胞缓冲液从Invitrogen(Paisley，英国)获得。钙荧光素-AM染料获得自MolecularProbes(Invitrogen，Paisley，英国)。嗜中性粒细胞如前所述分离(HaslettC等人，1985，AmJPath，119101)。简要地，将柠檬酸盐全血与4％葡聚糖-T500混合并使其立于冰上30分钟以除去红细胞。通过菲可帕克密度梯度离心从外周血单核细胞中分离出粒细胞(PMN)。通过低渗休克裂解除去PMN沉淀的任意红细胞污染。所分离的粒细胞(嗜中性粒细胞)用荧光染料钙荧光素-AM(5μg)标记。然后将所标记的嗜中性粒细胞与稀释于DMSO中的测试化合物(0.001-1000nM)相混合并在室温下孵育10分钟。将激动剂(pH6.8或pH7.0的缓冲液)置于96孔趋化性小室的底端小室内。将聚碳酸酯滤器(5μm)覆盖于平板和细胞上，且如果使用拮抗物，将其加样于顶端滤器上。允许细胞在37℃下含5％CO2的湿润培养箱中迁移90分钟。在孵育阶段结束时，利用多孔荧光平板读出器(FluoroskanII，Labsystems)在485nm激发和538nm发射下定量所迁移的细胞。阳性对照细胞(未加入拮抗物的细胞)代表最大的细胞趋化性反应。而无激动剂的阴性对照(未刺激的)，即pH＞＝7.4，加入到底端小室。阳性对照和阴性对照的差异代表了细胞的趋化活性。在试验中，通过与无化合物对照相比酸性pH的趋化性反应的降低来表征拮抗物。实施例14GPR4的功能性试验(形态改变试验)如下测定激动剂(pH剂量反应)曲线将粒细胞的等分试样(80μl4-5×105细胞)与10μl试验缓冲液(1xPBS，pH7.4，加0.1％BSA)在1.2ml组管(clustertubes)中混合。轻轻振荡样品并在37℃孵育5分钟(在水浴中)。在该时间之后，将激动剂加入到所有管中，只是零对照中加入10μl试验缓冲液。轻轻振荡样品并在37℃水浴中孵育另外5分钟。然后将250μl冰预冷的、优化的0.25％的CellFixTM溶液(BectonDickinson，牛津，英国)加入每管以终止反应并维持细胞形态变化直到分析。在从FACSCalibur流式细胞仪上获取数据之前，轻轻振荡管子并在冰上孵育10分钟。首先获得FSC/SSC图，然后利用门控(gated)粒细胞从第一个图获得FSC/FL-2图。FL-2图上嗜中性粒细胞与嗜酸性细胞不同，因为后者具有更高的自身荧光。对于拮抗物(仍无化合物)试验，将等分试样的粒细胞(80μl的4-5×105细胞)与10μl含有恒定浓度的DMSO(最高10％)的10×浓缩化合物(0.1-1000μM最终)混合于1.2ml组管中，轻轻振荡样品并在37℃孵育5分钟(在水浴中)。将激动剂(pH6.8或7.0的缓冲液)加入到所有管中，零化合物/零激动剂对照除外，向其中加入10μl试验缓冲液。在支架上轻轻振荡样品并在37℃水浴中孵育另外5分钟。然后将250μl冰预冷的、优化的0.25％CellFixTM溶液加入每管，并且在从流式细胞仪获取数据之前轻轻振荡支架并在冰上孵育10分钟。FL-2图上嗜中性粒细胞与嗜酸性细胞不同，因为后者具有更高的自身荧光。在试验中，通过与无化合物(即仅仅pH6.8或pH7.0的缓冲液)对照相比所观察到的形态改变的降低来表征拮抗物。实施例15GPR4的基因表达图谱筛选通过筛选基因来鉴定血管发生的潜在治疗性靶标，所述基因与用于内皮细胞的公认的标志基因显示出相关性表达。此标志基因集包含但不限于CDH5、VWF、KDR、TIE、TEK、PTPRB、ANGPT2(公认的基因符号，根据人类基因组组织/基因命名委员会(HUGO/HGNC))。利用Affymetrix(3380CentralExpressway，SantaClara，CA95051，USA；http://www.affymetrix.com/index.affx)寡核苷酸阵列技术，通过DNA微阵列分析而获得基因表达数据。将数据输入到软件工具GeneSpring(SiliconGenetics，2601SpringStreet，RedwoodCity，CA94063，USA；http://www.silicongenetics.com/cgi/SiG.cgi/index.smf)。对于每一个标志基因，通过利用Pearson相关性方法——相关性的统计学测定鉴定了其它相关性表达的显示基因。认为0.7到1的相关性系数表明强相关性。在被视作潜在的药物靶标的基因中，分析显示12种GPCRs具有＞0.7的相关性系数。实施例16GPR4的内皮细胞增殖试验原代的人皮肤微血管内皮细胞(HDMECs)和原代的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购买自PromoCell，Heidelberg，德国。HDMECs培养于内皮细胞基本培养基(EndothelialCellBasalMedium)MV中，其中补充了SupplementPack/内皮细胞生长培养基(EndothelialCellGrowthMedium)MV和5％的胎牛血清(FCS)，HUVECs培养于补充了SupplementPack/内皮细胞生长培养基加12.5％FCS的内皮细胞基本培养基中。内皮细胞基本培养基用作极限或饥饿培养基。如ReynoldsLE等人，NatMed.2002Jan；8(1)27-34所述的自小鼠肺分离小鼠原代细胞。简要地，将小鼠肺切碎、胶原酶消化(Gibco)、过滤并将所得细胞悬液平铺于涂布0.1％明胶(Sigma)、10mg/ml纤连蛋白(Sigma)和30μg/mlVitrogen(CollaborativeBiomedicalResearch)的混合物的瓶上。利用抗大鼠IgG缀合的磁珠(Dynal，Wiltshire，UK)通过单阴性(FCγ-RII/III抗体；Pharmingen)和双阳性(ICAM-2；Pharmingen)细胞种类来纯化内皮细胞，产生了＞97％纯的群体。测定增殖作为用不同的生长因子例如VEGF165(10ng/ml)和bFGF(0.5ng/ml)刺激的内皮细胞中胞外pH的函数。另外，用转染了针对GPR4的siRNA的内皮细胞或在靶向GPR4的化合物存在下开展类似实验，以便阐明GPR4在此过程中的特异作用。将内皮细胞的增殖用作对于血管发生的体外读数。内皮细胞增殖的抑制代表降低血管发生的一种途径。使用了一种基于BrdU掺入的内皮细胞增殖试验(BiotrakCellProliferationElisaSystemV.2，Amersham，英格兰)。以每孔5×103个细胞的密度将分汇合的HUVEC接种涂布1.5％明胶的96孔板中，然后在37℃下生长培养基中孵育。24小时后，将所要用生长因子孵育的孔中的培养基用含有1.5％FCS的基础培养基替换，剩余孔中的培养基用生长培养基替换。再过24小时后，培养基用含有相同量FCS(5％或1.5％)的新鲜培养基来替换，如前所述加减所要测试的化合物和特异性生长因子。另外包括无生长因子的孔作为对于生长因子影响的基线对照。孵育24小时后，加入BrdU标记溶液并将细胞再孵育24小时后固定、封闭和加入过氧化物酶标记的抗BrdU抗体。利用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺底物检测结合的抗体，该底物形成有色反应产物，将其在450nm以分光光度法定量。每种样品一式三份来进行。转染了siRNA的细胞在转染后24小时使用。实施例17对于GPR4的内皮细胞编程性细胞死亡试验原代的人皮肤微血管内皮细胞(HDMECs)和原代的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购买自PromoCell，Heidelberg，德国。HDMECs培养于内皮细胞基本培养基MV中，其中补充了SupplementPack/内皮细胞生长培养基MV和5％的胎牛血清(FCS)，HUVECs培养于补充了SupplementPack/内皮细胞生长培养基加12.5％FCS的内皮细胞基本培养基中。内皮细胞基本培养基用作极限或饥饿培养基。如ReynoldsLE等人，NatMed.2002Jan；8(1)27-34所述的自小鼠肺分离小鼠原代细胞。简要地，将小鼠肺切碎、胶原酶消化(Gibco)、过滤并将所得细胞悬液平铺于涂布0.1％明胶(Sigma)、10mg/ml纤连蛋白(Sigma)和30μg/mlVitrogen(CollaborativeBiomedicalResearch)的混合物的瓶上。利用抗大鼠IgG连接的磁珠(Dynal，Wiltshire，英国)通过单阴性(FCγ-RII/III抗体；Pharmingen)和双阳性(ICAM-2；Pharmingen)细胞种类来纯化内皮细胞，产生了＞97％纯的群体。测定编程性细胞死亡作为胞外pH的函数。另外，用转染了针对GPR4的siRNA的内皮细胞或在靶向GPR4的化合物存在下开展类似实验，以便阐明GPR4在此过程中的特异作用。使用血清饥饿作为诱导编程性细胞死亡的对照，并将VEGF165(10ng/ml)用作减少细胞编程性细胞死亡的对照。内皮细胞中编程性细胞死亡的诱导代表抑制血管发生的一种途径。利用CellDeathDetectionELISAPLUS系统(RocheDiagnostics)，按照厂商的方案测定编程性细胞死亡。简要地，在血清饥饿、利用pH变化、生长因子、化合物或GPR4-siRNA处理后，将细胞(HUVECs或HDMVECs)用100μl/孔的裂解缓冲液在37℃温和裂解以仅释放胞质内容物并以200g离心10分钟。将20μl上清液转移至ELISA平板并加入含有抗体的80μl免疫试剂，且在TiterPlate摇床中以摇动(300转/分钟)2小时进行孵育。用试剂盒中所提供的孵育缓冲液洗涤细胞3次。加入100μl的ABTS显色试剂并在10分钟后利用Spectromax190MicroplateSpectrophotometer在405nm测定OD，并以ABTS溶液作空白。每种样品一式三份地进行。实施例18GPR4的内皮细胞迁移试验原代的人皮肤微血管内皮细胞(HDMECs)和原代的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购买自PromoCell，Heidelberg，德国。HDMECs培养于内皮细胞基本培养基MV中，其中补充了SupplementPack/内皮细胞生长培养基MV和5％的胎牛血清(FCS)，HUVECs培养于补充了SupplementPack/内皮细胞生长培养基加12.5％FCS的内皮细胞基本培养基中。内皮细胞基本培养基用作极限或饥饿培养基。MS1是利用多瘤病毒中间T抗原转导所建立的小鼠胰岛内皮细胞系，且购买自ATCC。MS1细胞培养于含有4mML-谷胺酰胺、1.5g/L碳酸氢钠和4.5g/L葡萄糖加5％FCS的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基中。bEnd3是用SV40大T抗原转导所建立的小鼠脑内皮细胞系，且购买自ATCC。bEnd3细胞培养于含有4mML-谷胺酰胺、1.5g/L碳酸氢钠和4.5g/L葡萄糖加10％FCS的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基中。如ReynoldsLE等人，NatMed.2002Jan；8(1)27-34所述的自小鼠肺分离小鼠原代细胞。简要地，将小鼠肺切碎、胶原酶消化(Gibco)、过滤并将所得细胞悬液平铺于涂布有0.1％明胶(Sigma)、10mg/ml纤连蛋白(Sigma)和30μg/mlVitrogen(CollaborativeBiomedicalResearch)的混合物的瓶上。利用抗大鼠IgG缀合的磁珠(Dynal，Wiltshire，英国)通过单阴性(FCγ-RII/III抗体；Pharmingen)和双阳性(ICAM-2；Pharmingen)细胞种类来纯化内皮细胞，产生了＞97％纯的群体。测定内皮细胞朝特定生长因子例如VEGF(10ng/ml)或S1P(100nM)的迁移作为胞外pH的函数。另外，用转染了针对GPR4的siRNA的内皮细胞或在靶向GPR4的化合物存在下开展类似实验，以便阐明GPR4在此过程中的特异作用。将内皮细胞的迁移用作对于血管发生的体外读数。内皮细胞迁移的抑制代表抑制血管发生的一种途径。利用BDFalconHTSFluoroBlokMultiwellInsertSystem进行迁移试验。该系统由24孔的多孔内眼板组成，并用于研究细胞通过8μm孔径大小的多孔荧光阻断PET膜的运动。光阻断膜仅允许检测那些迁移通过膜并粘附于内眼板底部的细胞。内眼板的底部用1.5％明胶在37℃下包被2小时并用PBS洗涤一次。将24跨孔内眼板放入含有600μl基础培养基+0.1％BSA并补充有所要测试的不同生长因子和/或抑制剂的24孔板。将内皮细胞(传代3-5次)培养于完全生长培养基中至70-80％汇合。通过胰酶消化收获细胞，将补充或未补充抑制剂的100μl基础培养基+0.1％BSA中的30000个细胞加入到内眼板(上层小室)中。将化学引诱物(生长因子)仅加入下层小室通过建立梯度来刺激细胞迁移通过小孔，将不同的抑制剂加入两个小室内以确保相等的浓度。将平板在37℃孵育2-5小时。用4％FA将定位于膜的下面的迁移细胞在室温固定10分钟，用PBS漂洗并用Hoechst染料33342将核后染色(post-stain)15分钟。用CellomicsArrayScanTMII细胞计数器自动计数染色细胞。每种样品一式三份进行。CellomicsArrayScanTMII细胞计数器(Cellomics，Inc.，匹兹堡，PA)是自动化荧光成像显微镜，其用于每孔扫描16个视野(宽为350μm)并计算每个视野中的细胞。用MicrosoftExcel分析数据并以迁移细胞的平均数±SEM来表示。用siRNA转染的细胞在转染后24小时使用。实施例19对于GPR4的内皮细胞-平滑肌细胞共培养试验(芽形成)原代的人皮肤微血管内皮细胞(HDMECs)和原代的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购买自PromoCell，Heidelberg，德国。HDMECs培养于内皮细胞基本培养基MV中，其中补充了SupplementPack/内皮细胞生长培养基MV和5％的胎牛血清(FCS)，HUVECs培养于补充了SupplementPack/内皮细胞生长培养基加12.5％FCS的内皮细胞基本培养基中。内皮细胞基本培养基用作极限或饥饿培养基。人肺动脉平滑肌(HPASM)细胞购买自PromoCell，Heidelberg，德国，并培养于补充了SupplementPack/SmoothMuscleCellGrowthMedium2和10％FCS的平滑肌细胞基本培养基(SmoothMuscleCellBasalMedium)2中。所有培养基和补充物均购买自PromoCell，Heidelberg，德国。在特定生长因子例如VEGF(10ng/ml)、bFGF、PDGF或S1P(100nM)存在下，测定平滑肌细胞层上的内皮细胞的芽形成作为胞外pH的函数。另外，用转染了针对GPR4的siRNA的内皮细胞或在靶向GPR4的化合物存在下开展类似实验，以便阐明GPR4在此过程中的特异作用。将内皮细胞的芽形成用作对于血管发生的体外读数。内皮细胞芽形成的抑制代表降低血管发生的一种途径。用PBS中10％的牛I型胶原蛋白在37℃下包被48孔组织培养板5小时。将500μl平滑肌细胞生长培养基II中的HPASM细胞(2×104细胞/孔)接种于胶原蛋白层并允许其在37℃和5％CO2中附着24小时。除去生长培养基，并将内皮细胞生长培养基中的HDMECs或HUVECs(5×103细胞/孔)接种于汇合的HPASM细胞单层的顶部。将细胞孵育24小时后，将培养基替换成含有不同生长因子和/或化合物的极限培养基(基础+1.5％FCS)。在37℃下孵育平板6天。2-3天后更新培养基、生长因子和化合物。在第6天除去培养基并用4％PFA在室温固定细胞5分钟。通过CD31染色，利用抗人CD31抗体(BectonDickinson)，然后是生物素化的山羊抗小鼠抗体和链霉亲和素-HRP(辣根过氧化物酶)(均来自SouthernBiotechnology)可显现内皮细胞芽。随后是二氨基联苯胺(DAB)颜色反应和用Diff-Quick复染色。利用倒置相差显微镜在1.25x放大率下将细胞成像，并利用DefiniensCellenger软件(DefiniensAG，慕尼黑，德国)分析所获得的图像，所述软件计算核的数量、芽的长度和面积、及分枝。为了共培养实验以随时间检测发育，将DiI-Ac-LDL(20μg/m)加入共培养培养基中并在37℃和5％CO2孵育4小时。每3天更新DiI-Ac-LDL染色。DiI-LDL是荧光染料，其特异性地被内皮细胞但不被平滑肌细胞吸收，因而不需固定细胞即可检测内皮细胞芽。转染了siRNA的细胞在转染后24小时使用。实施例20对于GPR4的体内血管发生模型含有生长因子的琼脂小室GPR4k.o小鼠与wt小鼠以及用影响GPR4的化合物处理过的wt小鼠中，测定装有生长因子的琼脂小室周围高度血管化组织的形成。该试验是关于体内血管发生的模型并用于表征抗血管发生剂。将以80个规则间隔0.8mm的孔穿孔并在无菌环境下用0.8％琼脂加20U/ml肝素(含有或不含生长因子)填充的特氟隆小室移植进小鼠的胁腹。为了皮下移植，在尾的根部产生小的皮肤切口以允许移植套针的插入。在无菌环境下通过在动物背部的小切口将小室植入。利用伤口夹将皮肤切口封闭。如果琼脂中加入了生长因子例如VEGF(3μg/ml)和bFGF(0.3μg/ml)和S1P(5mM/ml)，那么4天后，在小室周围形成血管组织。在移植后的第4天，利用CO2处死动物。然后将小室从动物中取出并小心地将每个小室周围的血管化纤维组织取出，并利用不同的参数例如重量、血红蛋白和Tie2蛋白质含量进行分析。备选地，将组织速冻并加工用于组织学。血红蛋白的量反映了血液体积和出血的组合。相反，Tie2仅特异地表达于内皮细胞，因而Tie2蛋白质水平可用作特定组织血管化的度量。生长于植入物周围的纤维组织的湿重在取出后立即测定。然后在加入2ml的RIPA缓冲液后，以24000转/分钟将整个组织匀浆(UltraTurraxT25)1分钟。在7000转/分钟下将匀浆物离心1小时并利用0.45μmGHP注射器过滤上清液以避免脂类污染。测定上清液中血红蛋白和Tie2蛋白质的量。利用Drabkin试剂试剂盒(Sigmahaemoglobin#525)在540nm通过分光光度分析来测定血红蛋白含量。将等分试样的滤液(100μl)加入0.9ml的Drabkin’s溶液中并在室温孵育混合物至少15分钟。混合物在540nm的吸光度与血红蛋白浓度是成比例的。然后利用先前用来自供体小鼠的不同体积的全血样品得到的校准曲线，将血红蛋白测量转换为血液体积测量(μl)。Tie2蛋白质水平通过ELISA来测量在4℃下用每孔0.1ml抗Tie-2AB33捕获抗体(2mg/ml，UBI，#05-584)包被NuncMaxsisorb96孔板过夜。将孔洗涤三次并通过用3％Top-Block(Juro#TB232010)在室温下摇动(300转/分钟)孵育2小时对孔进行封闭。再次洗涤孔并加入蛋白质裂解液(0.2ml的总体积中0.1-0.5mg)并在室温孵育2小时。洗涤后，在室温下应用Tie2检测抗体复合体(R&D#AF762，0.5μg/ml)和PBS-T+0.1％Top-Block中的抗山羊-碱性磷酸酶缀合物(1∶6000稀释，SIGMA#A-8062)1小时。洗涤后，通过与对硝基苯基磷酸(SIGMA#N-2270，片剂)孵育来检测Tie-2抗体复合体，并在405nm读取吸光度。将溶解在RIPA缓冲液中的融合到人IgG1恒定区的Tie-2的重组人胞外结构域(sTie-2Fc)以0.1ng-300ng/孔的浓度范围用作标准。实施例21关于GPR4的4T1小鼠乳腺肿瘤的同位转移模型在GPR4k.o小鼠和wt小鼠以及用影响GPR4的化合物处理过的wt小鼠中测定同位同源乳腺肿瘤和其肿瘤转移的生长。血管发生对于肿瘤生长和转移形成是关键的。如MichigamiT等人在BreastCancerResTreat.2002Oct；75(3)249-58中所述的接种肿瘤细胞。将4T1小鼠乳腺肿瘤细胞(1×106/0.1mlPBS)同位地接种进同源雌性Balb/c小鼠(6-8周龄)的右乳腺脂肪垫中。细胞接种7-10天后肿瘤开始形成。在宽泛的时程实验中，组织学检查显示分别在细胞接种后2和3周后开始形成肺和骨转移。3周后终止实验并对肿瘤称重。将组织速冻并加工用于组织学或在RIPA缓冲液中裂解用于ELISA和蛋白质印迹分析。实施例22关于GPR4的B16-BL6小鼠黑色素瘤的同位转移模型在GPR4k.o小鼠和wt小鼠以及用影响GPR4的化合物处理过的wt小鼠中测定同位同源黑色素瘤和其肿瘤转移的生长。血管发生对于肿瘤生长和转移形成是关键的。将B16-BL6小鼠黑色素瘤细胞培养至超汇合并将1μlHBSS中的5×104个细胞同位地皮内(i.d.)接种进同源雌性C57/BL6小鼠(6-8周龄)的耳朵皮肤中。在立体定位(stereotactic)显微镜下进行注射并将细胞注射在耳朵周边两条血管之间。细胞接种后7-10天开始形成肿瘤。大约10天在100％的动物中在颅淋巴结形成肿瘤转移，而大约30％的动物在3周后具有肺肿瘤转移。3周后终止实验。通过成像定量原代肿瘤的大小同时将淋巴结肿瘤转移称重。将组织速冻并加工用于组织学或在RIPA缓冲液中裂解用于ELISA和蛋白质印迹分析。实施例24关于GPR4的小鼠抗原诱导的关节炎模型在GPR4k.o小鼠和wt小鼠以及用影响GPR4的化合物处理过的wt小鼠中进行抗原诱导性关节的模型。血管发生在类风湿性关节炎中发挥重要作用。如先前由GrosiosK等人，InflammRes.2004Apr；53(4)133-42所描述的来进行试验。在第-21天和第-14天将雌性小鼠在背部的两个位置针对甲基化牛血清白蛋白(mBSAFlukaChemieAG)皮内敏化，其中所述甲基化牛血清白蛋白与完全弗氏佐剂以1∶1匀浆(0.1ml，含有1mg/mlmBSA)。在第0天，右膝接受溶于5％葡萄糖溶液中的10μl的10mg/mlmBSA(注射抗原的膝)，而左膝只接受10μl的5％的葡萄糖溶液(注射载体的膝)。然后在内关节注射之后立即利用卡钳测量左和右膝的直径，并在第2、4、7、9、11和14天重新测量。每天给予处理。将右膝肿胀以左膝肿胀的比率来计算，并将R/L膝肿胀比率对时间来绘图，从而给出对照和处理组的曲线下面积(AUC)图表。利用Excel电子表格将个体处理组AUCs的百分率抑制对对照组AUC(0％抑制)进行计算。在第14天，通过CO2吸入处死小鼠并取出右和左膝，并加工用于组织学分析。利用Histodurplastic包埋方法(LeicaAG，德国)对膝进行加工用于非脱钙组织学。在RM2165旋转切片机(LeicaAG，德国)上从对照和关节炎膝切割切片(5μm)。吉姆萨染色后，根据标准方案，将载玻片按照来自每个动物的左膝/右膝对进行数字编号并以盲的(blinded)形式读出。实施例25早熟模型的视网膜病(ROP)-GPR4在GPR4k.o小鼠和wt小鼠以及用影响GPR4的化合物处理过的wt小鼠中进行低氧诱导的视网膜病模型。在此模型中低氧是诱导视网膜中血管发生的主要推动力量。如ReynoldsLE等人，NatMed.2002Jan；8(1)27-34和Wilkinson-BerkaJL等人在InvestOphthalmolVisSci.2003Mar；44(3)974-9中所述的来进行此试验。通过将7天龄的幼崽与其母亲置于包含75％±5％O2和2％CO2(利用医用级O2和工业级空气)的封闭小室中来诱导C57BL/6小鼠中的ROP。利用气体分析仪(ModelML205；ADInstruments，Pty.，Ltd.，CastleHill，NewSouthWales，Australia)和图表记录仪(Chart，ver.3.5，ontheMacLab/2ESystem；ADInstruments，Pty.，Ltd.)每天两次对小室中的气体水平进行监控。大约2.5L/分钟的气流速率有助于维持代谢产生的CO2的充足水平和O2压的降低。将小鼠保持在小室内5天(含氧量高的时期，出生后的P7-P12天)，然后将其放入室内空气中再过5天(低氧诱导的血管发生，P12-P17)。用葡聚糖-FITC灌注小鼠以突出脉管并检测视网膜，且作为全样载片或通过组织学来分析。实施例26TDAG8的克隆和稳定细胞系产生自基因组DNA扩增人TDAG8，利用下列引物正向，5’-GACTTCTCTGTTTACTTTCTA-3’；反向，5’-GTTCTACTCAAGGACCTCTA-3’。PCR反应混合物在20μl的总体积内含有0.2mMdNTPs、1xPCR缓冲液(含有1.5mMMgCl2)、0.5单位Taq/TgoDNA聚合酶混合物(Roche)，40pmol每种引物和无菌水。用于此反应的模板是人基因组DNA(Promega，Wallisellen，瑞士)。利用BiometraT3循环变温器进行PCR，利用下列循环条件95℃变性2分钟，然后是38个循环的95℃变性30秒、60℃退火45秒和72℃延伸1分钟。最后的延伸在72℃进行7分钟。将PCR产物克隆进topoPCR4载体(Invitrogen，巴塞尔，瑞士)并测序。然后将cDNA从此构建体中利用下列引物重新扩增正向5’-TCCGGAATTCGCCACCATGAACAGCACATGTATT-3’反向5’-GATCCGCTCGAGCTCAAGGACCTCTAATTC-3’以便在编码序列5’端引入EcoRI限制位点和kozak序列，并在3’端恰好在终止密码子之前引入XhoI限制位点。然后将cDNA亚克隆进表达载体pcDNA3.1/myc-His，作为与myc标记的融合蛋白质。在CCL39细胞或者CCL39CRE-luc细胞中产生了表达TDAG8的稳定细胞系，其稳定表达cAMP依赖性萤光素酶报道基因以检测响应配体的cAMP。利用Effectene(Qiagen，巴塞尔，瑞士)根据厂商方案，通过转染TDAG8cDNA表达构建体来在上述细胞系中产生稳定细胞系。转染的细胞在400μg/ml的G418存在下进行选择。3周的抗生素选择后，挑选出单个克隆并将其扩大用于进一步分析。实施例27TDAG8是激活cAMP形成的质子敏感性G蛋白偶联受体cAMP形成试验在无血清DMEM培养基中，用[3H]腺嘌呤(100MBq/ml；Amersham，Dübendorf，瑞士)标记培养于24孔板中的汇合的细胞培养物4小时。然后，如上面关于IP试验(实施例2)所述的缓冲的盐溶液中在37℃下孵育细胞。如果指出，将磷酸二酯酶抑制剂异丁基甲基黄嘌呤(IBMX，1mM)加入从而允许cAMP的积聚。孵育时间是15分钟。然后用冰预冷的三氯乙酸提取细胞并利用分批柱层析将cAMP从游离的腺嘌呤和ATP中分离出来(SalmonY，1979，Adv.Cycl.NucleotRes，1035-55)。结果如上所述的表达研究和cAMP形成试验表明该受体确实对与OGR1非常相似的范围中的pH变化起反应。鞘氨醇半乳糖苷据报道是TDAG8的配体(ImDS等人，2001，JCellBiol，153429-434)，它们自身不激活cAMP形成。在稳定表达受体的CCL39细胞中通过TDAG8的cAMP的半最大激活发生于pH7.15+/-0.02(平均值+/-sem；N＝6)。实施例28用于TDAG8的激动剂或拮抗物的筛选试验将如实施例8中所述的共表达TDAG8和cAMP萤光素酶报道基因的细胞以每孔10-20,000个细胞接种于白色96孔板中。在进行试验的前一天，将培养基更换为无血清DMEM并在37℃5％CO2存在下将细胞孵育过夜。用合适的pH的100μlHBS缓冲液(130mMNaCl、0.9mMNaH2PO4、0.8mMMgSO4、1.8mMCaCl2、5.4mMKCl、25mM葡萄糖、20mMHEPES)洗涤细胞一次。然后将含有所要测试的化合物(例如任意内部或商业上可获得的化合物库)的100μl适宜的HBS缓冲液加入到细胞上。在37℃下非CO2培养箱中孵育平板4-5小时。4-5小时后从细胞中吸出缓冲液并用100μl的PBS洗涤细胞一次。通过加入15μl裂解缓冲液(5mMtris-磷酸、4mMDTT、0.4mMEDTA、2％甘油、0.2％tritonX-100)来裂解细胞，振荡1分钟并在室温孵育20分钟。当自动加入50μl底物缓冲液(E1483，Promega，Wallisellen，瑞士)时，在LabsystemsLuminoskanRS(BioConcept，Allschwill)上进行光信号测量，LabsystemsLuminoskanRS同时进行底物分配和信号测量。试验中的激动剂产生了发光的增强，而拮抗物产生了发光的减弱。例如，拮抗物的特征在于试验中与无化合物对照相比发光信号的减弱，以及例如在pH6.8或pH7.0的酸性pH缓冲液中人TDAG8的半最大激活。在稳定表达受体的CCL39CRE-luc细胞中通过人TDAG8对萤光素酶诱导的半最大激活发生于pH7.28+/-0.02(平均值+/-sem；N＝7)。实施例29TDAG8在破骨细胞和破骨细胞前体细胞中的表达将人原代外周血单核细胞(PBMNCs，由单核细胞、淋巴细胞和其它血细胞类型的子集组成)培养在补充了10％胎牛血清的MEMalpha培养基中。为诱导破骨细胞分化，一些培养物中补充了含有M-CSF(25ng/ml，R&DSystems，Abingdon，英国)、RANK配体(50ng/ml，InsightBiotechnology，Wembley，英国)、TGFbetal(5ng/ml，R&DSystems，Abingdon，英国)、地塞米松(1μM，Sigma，Buchs，瑞士)的细胞因子混合物。处理后的17天观察到成熟的破骨细胞。利用RNAeasy(Qiagen，巴塞尔，瑞士)从用胞因子混合物处理或未处理的培养物制备RNA。利用SuperscriptII(Lifetechnologies/Invitrogen，巴塞尔，瑞士)将RNA进行DNA酶处理并逆转录。用ExpandHighFidelityTaq(Roche)利用下列温度循环方案建立对于TDAG8和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPDH)的平行PCR反应94℃下30秒变性，56℃(TDAG8)或55℃(GPDH)下45秒退火，72℃下50秒延伸；对于TDAG8为36个循环，对于GPDH为30个循环。测定GPDH作为mRNA量的内标。对于TDAG8，克隆PCR反应产物并通过测序进行验证。用到下列引物TDAG8正向5’-AACTACTTGTCAGCATCACA-3’，反向5’-GTTCTACTCAAGGACCTCTA-3’；GPDH正向5’-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3’，反向5’-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3’。结果在PBMNCs和完全分化的破骨细胞中均观察到TDAG8的强表达。实施例30破骨细胞分化和活性试验(对于TDAG8的功能性试验)将人原代外周血单核细胞(PBMNCs)培养在补充了10％胎牛血清的MEMalpha培养基中。为诱导破骨细胞分化，培养物中补充了含有M-CSF(25ng/ml，R&DSystems，Abingdon，英国)、RANK配体(50ng/ml，InsightBiotechnology，Wembley，英国)、TGFbeta1(5ng/ml，R&DSystems，Abingdon，英国)、地塞米松(1μM，Sigma，Buchs，瑞士)的细胞因子混合物。为研究pH对于破骨细胞分化的影响，在分化过程中将细胞维持在不同pH的培养基中，并在对酒石酸抗性的酸性磷酸酶染色后在显微镜下计数成熟的破骨细胞。为研究pH对破骨细胞活性的影响，将PBMNCs接种于牛骨薄切片上，并在如上所述的细胞因子混合物的存在下在标准条件下培养直到第14天。然后将培养物转移到不同pH的培养基，并再培养3天后通过测量再吸收的骨的面积和所释放的胶原蛋白片段的浓度来估计破骨细胞活性。另外，人TDAG8拮抗物(例如，通过实施例17的筛选试验所获得的)可逆转所观察到的中性环境例如pH6.8或7.0的激动剂效果。实施例31逐对序列比对利用GCG程序“Gap”(DevereuxJ等人，1984，NuclAcidsRes，12387-395.)比对序列。所使用的具有Refseq数据库检索号的蛋白质序列OGR1NP_003476GPR4NP_005273TDAG8NP_003599人OGR-1与人GPR4的比对百分比相似性50.838百分比同一性45.251人OGR-1与人TDAG8的比对百分比相似性45.706百分比同一性34.663人GPR4与人TDAG8的比对百分比相似性46.061百分比同一性36.970序列表<110>诺瓦提斯公司<120>新的G蛋白偶联受体及其DNA序列<130>4-33201P1<160>6<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>365<212>PRT<213>人<220><221>肽<222>(1)..(365)<223><400>1MetGlyAsnIleThrAlaAspAsnSerSerMetSerCysThrIleAsp151015HisThrIleHisGlnThrLeuAlaProValValTyrValThrValLeu202530ValValGlyPheProAlaAsnCysLeuSerLeuTyrPheGlyTyrLeu354045GlnIleLysAlaArgAsnGluLeuGlyValTyrLeuCysAsnLeuThr505560ValAlaAspLeuPheTyrIleCysSerLeuProPheTrpLeuGlnTyr65707580ValLeuGlnHisAspAsnTrpSerHisGlyAspLeuSerCysGlnVal859095CysGlyIleLeuLeuTyrGluAsnIleTyrIleSerValGlyPheLeu100105110CysCysIleSerValAspArgTyrLeuAlaValAlaHisProPheArg115120125PheHisGlnPheArgThrLeuLysAlaAlaValGlyValSerValVal130135140IleTrpAlaLysGluLeuLeuThrSerIleTyrPheLeuMetHisGlu145150155160GluValIleGluAspGluAsnGlnHisArgValCysPheGluHisTyr165170175ProIleGlnAlaTrpGlnArgAlaIleAsnTyrTyrArgPheLeuVal180185190GlyPheLeuPheProIleCysLeuLeuLeuAlaSerTyrGlnGlyIle195200205LeuArgAlaValArgArgSerHisGlyThrGlnLysSerArgLysAsp210215220GlnIleGlnArgLeuValLeuSerThrValValIlePheLeuAlaCys225230235240PheLeuProTyrHisValLeuLeuLeuValArgSerValTrpGluAla245250255SerCysAspPheAlaLysGlyValPheAsnAlaTyrHisPheSerLeu260265270LeuLeuThrSerPheAsnCysValAlaAspProValLeuTyrCysPhe275280285ValSerGluThrThrHisArgAspLeuAlaArgLeuArgGlyAlaCys290295300LeuAlaPheLeuThrCysSerArgThrGlyArgAlaArgGluAlaTyr305310315320ProLeuGlyAlaProGluAlaSerGlyLysSerGlyAlaGlnGlyGlu325330335GluProGluLeuLeuThrLysLeuHisProAlaPheGlnThrProAsn340345350SerProGlySerGlyGlyPheProThrGlyArgLeuAla355360365<210>2<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>该肽用于产生针对OGR1的抗体<220>肽<221><222>(1)..(16)<223><400>2CysPheValSerGluThrThrHisArgAspLeuAlaArgLeuArgGly151015<210>3<211>362<212>PRT<213>人<220><221>肽<222>(1)..(362)<223><400>3MetGlyAsnHisThrTrpGluGlyCysHisValAspSerArgValAsp151015HisLeuPheProProSerLeuTyrIlePheValIleGlyValGlyLeu202530ProThrAsnCysLeuAlaLeuTrpAlaAlaTyrArgGlnValGlnGln354045ArgAsnGluLeuGlyValTyrLeuMetAsnLeuSerIleAlaAspLeu505560LeuTyrIleCysThrLeuProLeuTrpValAspTyrPheLeuHisHis65707580AspAsnTrpIleHisGlyProGlySerCysLysLeuPheGlyPheIle859095PheTyrThrAsnIleTyrIleSerIleAlaPheLeuCysCysIleSer100105110ValAspArgTyrLeuAlaValAlaHisProLeuArgPheAlaArgLeu115120125ArgArgValLysThrAlaValAlaValSerSerValValTrpAlaThr130135140GluLeuGlyAlaAsnSerAlaProLeuPheHisAspGluLeuPheArg145150155160AspArgTyrAsnHisThrPheCysPheGluLysPheProMetGluGly165170175TrpValAlaTrpMetAsnLeuTyrArgValPheValGlyPheLeuPhe180185190ProTrpAlaLeuMetLeuLeuSerTyrArgGlyIleLeuArgAlaVal195200205ArgGlySerValSerThrGluArgGlnGluLysAlaLysIleLysArg210215220LeuAlaLeuSerLeuIleAlaIleValLeuValCysPheAlaProTyr225230235240HisValLeuLeuLeuSerArgSerAlaIleTyrLeuGlyArgProTrp245250255AspCysGlyPheGluGluArgValPheSerAlaTyrHisSerSerLeu260265270AlaPheThrSerLeuAsnCysValAlaAspProIleLeuTyrCysLeu275280285ValAsnGluGlyAlaArgSerAspValAlaLysAlaLeuHisAsnLeu290295300LeuArgPheLeuAlaSerAspLysProGlnGluMetAlaAsnAlaSer305310315320LeuThrLeuGluThrProLeuThrSerLysArgAsnSerThrAlaLys325330335AlaMetThrGlySerTrpAlaAlaThrProProSerGlnGlyAspGln340345350ValGlnLeuLysMetLeuProProAlaGln355360<210>4<211>337<212>PRT<213>人<220><221>肽<222>(1)..(337)<223><400>4MetAsnSerThrCysIleGluGluGlnHisAspLeuAspHisTyrLeu151015PheProIleValTyrIlePheValIleIleValSerIleProAlaAsn202530IleGlySerLeuCysValSerPheLeuGlnProLysLysGluSerGlu354045LeuGlyIleTyrLeuPheSerLeuSerLeuSerAspLeuLeuTyrAla505560LeuThrLeuProLeuTrpIleAspTyrThrTrpAsnLysAspAsnTrp65707580ThrPheSerProAlaLeuCysLysGlySerAlaPheLeuMetTyrMet859095LysPheTyrSerSerThrAlaPheLeuThrCysIleAlaValAspArg100105110TyrLeuAlaValValTyrProLeuLysPhePhePheLeuArgThrArg115120125ArgIleAlaLeuMetValSerLeuSerIleTrpIleLeuGluThrIle130135140PheAsnAlaValMetLeuTrpGluAspGluThrValValGluTyrCys145150155160AspAlaGluLysSerAsnPheThrLeuCysTyrAspLysTyrProLeu165170175GluLysTrpGlnIleAsnLeuAsnLeuPheArgThrCysThrGlyTyr180185190AlaIleProLeuValThrIleLeuIleCysAsnArgLysValTyrGln195200205AlaValArgHisAsnLysAlaThrGluAsnLysGluLysLysArgIle210215220IleLysLeuLeuValSerIleThrValThrPheValLeuCysPheThr225230235240ProPheHisValMetLeuLeuIleArgCysIleLeuGluHisAlaVal245250255AsnPheGluAspHisSerAsnSerGlyLysArgThrTyrThrMetTyr260265270ArgIleThrValAlaLeuThrSerLeuAsnCysValAlaAspProIle275280285LeuTyrCysPheValThrGluThrGlyArgTyrAspMetTrpAsnIle290295300LeuLysPheCysThrGlyArgCysAsnThrSerGlnArgGlnArgLys305310315320ArgIleLeuSerValSerThrLysAspThrMetGluLeuGluValLeu325330335Glu<210>5<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>该肽用于产生针对GPR4的抗体<220><221>肽<222>(1)..(19)<223>用于产生GPR4的抗体的肽2<400>5ArgSerAspValAlaLysAlaLeuHisAsnLeuLeuArgPheLeuAla151015SerAspLys<210>6<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>该肽用于产生针对GPR4的抗体<220><221>肽<222>(1)..(20)<223>用于产生GPR4的抗体的肽<400>6AspGluLeuPheArgAspArgTyrAsnHisThrPheCysPheGluLys151015PheProMetGlu20权利要求1.分离的质子敏感性GPCR多肽的用途，用于开发用于疾病和医学病症的药物，其中所述疾病和医学病症中质子稳态失调。2.分离的质子敏感性GPCR多肽的用途，用于开发用于疾病和医学病症的药物，其中所述疾病和医学病症中质子稳态失调；所述多肽选自(a)由多核苷酸编码的分离的多肽，所述多核苷酸包含人OGR1(检索号NM_003485.1)、大鼠OGR1(检索号XM_234483)、小鼠OGR1(检索号NM_175493)、牛OGR1(检索号NM_174329)，优选地人OGR1(检索号NM_003485.1)、人GPR4(检索号NM_005282)、小鼠GPR4(检索号NM_175668)、人TDAG8(检索号NM_003608)和小鼠TDAG8(检索号NM_008152)的多核苷酸序列；(b)分离的质子敏感性GPCR多肽，其包含与SEQIDNO1的多肽序列具有至少20％的多肽序列；(c)分离的质子敏感性GPCR多肽，其包含与SEQIDNO3的多肽序列具有至少20％的多肽序列；(d)分离的质子敏感性GPCR多肽，其包含与SEQIDNO4的多肽序列具有至少20％同一性的多肽序列；(e)分离的多肽，其包含SEQIDNO1、SEQIDNO3或SEQIDNO4的多肽序列；(f)分离的质子敏感性GPCR多肽，其具有与SEQIDNO1的多肽序列至少20％的同一性；(g)分离的质子敏感性GPCR多肽，其具有与SEQIDNO3的多肽序列至少20％的同一性；(h)分离的质子敏感性GPCR多肽，其具有与SEQIDNO4的多肽序列至少20％的同一性；(i)SEQIDNO1、SEQIDNO3或SEQIDNO4的多肽序列；和(l)(a)至(i)中的多肽，其显示在CCL39仓鼠成纤维细胞中的pH依赖性的肌醇磷酸形成，或者在cAMP萤光素酶报道基因测定中在CHOK1CRE-luc细胞或CCL39CRE-luc细胞中pH依赖性信号。3.如权利要求1或2中要求保护的分离的多肽的用途，所述多肽包含SEQIDNO1、SEQIDNO3或SEQIDNO4的多肽序列。4.如权利要求1或2中要求保护的分离的多肽的用途，所述多肽由SEQIDNO1、SEQIDNO3或SEQIDNO4的多肽序列组成。5.分离的多核苷酸的用途，用于开发用于疾病和医学病症的药物，其中所述疾病和医学病症中质子稳态失调；所述多核苷酸选自(a)分离的多核苷酸，其包含人OGR1(检索号NM_003485.1)、大鼠OGR1(检索号XM_234483)、小鼠OGR1(检索号NM_175493)、牛OGR1(检索号NM_174329)，优选地人OGR1(检索号NM_003485.1)、人GPR4(检索号NM_005282)、小鼠GPR4(检索号NM_175668)、人TDAG8(检索号NM_003608)和小鼠TDAG8(检索号NM_008152)的多核苷酸序列；(b)编码质子敏感性GPCR多肽序列的分离的多核苷酸，所述多肽序列与SEQIDNO1的多肽序列具有至少20％同一性；(c)编码质子敏感性GPCR多肽序列的分离的多核苷酸，所述多肽序列与SEQIDNO3的多肽序列具有至少20％同一性；(d)编码质子敏感性GPCR多肽序列的分离的多核苷酸，所述多肽序列与SEQIDNO4的多肽序列具有至少20％同一性；(f)分离的多核苷酸，其包含人OGR1(检索号NM_003485.1)、大鼠OGR1(检索号XM_234483)、小鼠OGR1(检索号NM_175493)、牛OGR1(检索号NM_174329)，优选地人OGR1(检索号NM_003485.1)、人GPR4(检索号NM_005282)、小鼠GPR4(检索号NM_175668)、人TDAG8(检索号NM_003608)和小鼠TDAG8(检索号NM_008152)的多核苷酸序列；(g)人OGR1(检索号NM_003485.1)、大鼠OGR1(检索号XM_234483)、小鼠OGR1(检索号NM_175493)、牛OGR1(检索号NM_174329)，优选地人OGR1(检索号NM_003485.1)、人GPR4(检索号NM_005282)、小鼠GPR4(检索号NM_175668)、人TDAG8(检索号NM_003608)和小鼠TDAG8(检索号NM_008152)的多核苷酸序列；(h)(a)至(g)中的多核苷酸，其编码的多肽显示在CCL39仓鼠成纤维细胞中的pH依赖性的肌醇磷酸形成或者在cAMP萤光素酶报道基因测定中在CHOK1CRE-luc细胞或CCL39CRE-Iuc细胞中的pH依赖性信号。6.特异结合权利要求1至4中任意一项的多肽的抗体的用途，用于生产预防和/或治疗疾病和医学病症的药物，其中所述疾病和医学病症中质子稳态失调；药物组合物，其包含用于预防和/或治疗疾病和医学病症的抗体，其中所述疾病和医学病症中质子稳态失调，所述抗体特异结合权利要求1至4中任意一项的多肽；或疾病和医学病症的预防和/或治疗方法，其中所述疾病和医学病症中质子稳态失调，所述方法包含对需要此类预防和/或治疗的受试者施用有效量的抗体，所述抗体特异结合权利要求1至4中任意一项的多肽。7.筛选方法，其用于鉴定拮抗根据权利要求1至4任意一项的多肽的质子敏感性活性的化合物。8.筛选方法，其用于鉴定激动根据权利要求1至4任意一项的多肽的质子敏感性活性的化合物。9.筛选方法，其用于鉴定刺激或抑制权利要求1至4的多肽的功能或表达水平的化合物，所述方法包含选自(a)通过直接或间接与候选化合物结合的标记，定量或定性测定或检测候选化合物对所述多肽(或者对表达所述多肽的细胞或膜)或其融合蛋白质的结合；(b)在经标记的竞争剂存在下，测定候选化合物对所述多肽(或者对表达所述多肽的细胞或膜)或其融合蛋白质结合的竞争；(c)利用对表达所述多肽的细胞或细胞膜适宜的检测系统，测试候选化合物是否导致通过激活或抑制所述多肽产生信号；或(d)利用例如ELISA试验，检测候选化合物对编码所述多肽的mRNA或细胞中所述多肽的产生的影响；构成的组的方法。10.预防和/或治疗疾病和医学病症的方法，其中所述疾病和医学病症中质子稳态失调，所述方法包含对需要此类预防和/或治疗的受试者施用有效量的从权利要求7的方法可获得的拮抗物。11.预防和/或治疗疾病和医学病症的方法，其中所述疾病和医学病症中质子稳态失调，所述方法包含对需要此类预防和/或治疗的受试者施用有效量的从权利要求8的方法可获得的激动剂。12.药物组合物，其用于预防和/或治疗疾病和医学病症，其中所述疾病和医学病症中质子稳态失调，所述组合物包含从权利要求7的方法可获得的拮抗物。13.药物组合物，其用于预防和/或治疗疾病和医学病症，其中所述疾病和医学病症中质子稳态失调，所述组合物包含从权利要求8的方法可获得的激动剂。14.诊断试剂盒，其包含针对根据权利要求1至4任意一项的多肽的抗体。15.诊断试剂盒，其包含用于预防和/或治疗疾病和医学病症的药物制剂，其中所述疾病和医学病症中质子稳态失调，所述药物制剂包含针对根据权利要求1至4任意一项的多肽的抗体。全文摘要本发明涉及某些G蛋白偶联受体(GPCRs)，尤其OGR1、GPR4和TDAG8(TDAG8又称为GPR65)多肽，和编码此类GPCR多肽的多核苷酸的新鉴定的效用，涉及它们在诊断中的用途，还涉及鉴定为所述GPCRs的激动剂或拮抗物的化合物的方法，还涉及此类多肽和多核苷酸的产生。文档编号G01N33/53GK1809374SQ200480017242公开日2006年7月26日申请日期2004年6月18日优先权日2003年6月20日发明者B·鲍姆加腾,C·E·琼斯,M－G·路德维格,G·马蒂尼-巴伦,K·瑟文,R·沃尔夫,L·怀德尔,T·叙普利申请人:诺瓦提斯公司
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