专利名称：用于分子的高灵敏性检测的方法和组合物的制作方法
用于分子的高灵敏性检测的方法和组合物相关申请的交叉引用本申请要求于2008 年 3 月 5 日提交的题为 “Methods and Compositions for Highly Sensitive Detection of Molecules” 的美国临时申请第 61/033,897 号和于 2008 年 3 月 21 日 提交的题为 “Ultrasensitive Assays and Methods of Use for the Detection VEGF "的美国临时
申请第61/038,714号的优先权权益；本文通过引用并入这两个申请的全部内容。
背景技术：
生物医学研究、医学诊断、预后、监测和治疗选择、生物恐怖检测和其它涉及 分析物的多个低体积、低浓度样品的分析的领域中的进展已经导致了能灵敏地检测在不 断降低的浓度的样品中的颗粒的样品分析系统的发展。美国专利第4,793,705和5,209,834 号描述了此前的实现极为灵敏的检测的系统。本发明提供了该领域中的进一步进展。
发明内容
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于检测或监测受试对象的病况的方 法，所述方法包括检测来自受试对象的第一样品中的第一标记物并检测第二标记物，其 中第一标记物包含心脏肌钙蛋白I(CTnI)或血管内皮生长因子(VEGF)，且其中第一标记 物的检出限小于约20pg/ml。在某些实施方式中，对至少一个标记物的检测包括使样品与 标记物的标记接触并检测该标记的存在或缺失，其中检测到标记存在表明相应的标记物 的存在。在某些实施方式中，所述标记包含荧光部分，并且所述检测包括使标记通过单 分子检测器，其中所述单分子检测器包括(a)用于刺激荧光部分的电磁辐射源；(b)用 于接收从电磁源发出的电磁辐射的询查空间；和(C)与所述巡查空间可操作地连接的电 磁辐射检测器，该检测器用于确定受激荧光部分的电磁特性。在某些实施方式中，第一标记物的检出限为约10pg/ml 约0.01pg/ml。在某 些实施方式中，第一标记物的检出限小于约lOpg/ml。在某些实施方式中，第一标记物 的检出限小于约5pg/ml。在某些实施方式中，第一标记物的检出限小于约lpg/ml。在 某些实施方式中，第一标记物的检出限小于约0.5pg/ml。在某些实施方式中，第一标记 物的检出限小于约O.lpg/ml。在某些实施方式中，第一标记物的检出限小于约0.05pg/ ml。在某些实施方式中，第一标记物的检出限小于约O.Olpg/ml。在某些实施方式中， 第一标记物的检出限小于约0.005pg/ml。在某些实施方式中，第一标记物的检出限小 于约0.001pg/ml。在某些实施方式中，检出限变差系数(coefficient of variation) (CV)为 约20% 约1%。在某些实施方式中，检出限变差系数(CV)为约100% 约1%。在 某些实施方式中，检出限变差系数(CV)为约75% 约1%。在某些实施方式中，检出 限变差系数(CV)为约50% 约1%。在某些实施方式中，检出限变差系数(CV)为约 25% 约1%。在某些实施方式中，检出限变差系数(CV)为约20% 约1%。在某些 实施方式中，检出限变差系数(CV)为约15% 约1%。在某些实施方式中，检出限变 差系数(CV)为约10% 约1%。在某些实施方式中，检出限变差系数(CV)为约5% 约1%。在某些实施方式中，样品尺寸为约10μ1 约Ο. μ 。在某些实施方式中，样 品尺寸为约100 μ 1 约0.1 μ 1。在某些实施方式中，样品尺寸为约75 μ 1 约0.1 μ 1。 在某些实施方式中，样品尺寸为约50 μ 1 约0.1 μ 1。在某些实施方式中，样品尺寸为 约25 μ 1 约0.1 μ 1。在某些实施方式中，样品尺寸为约20 μ 1 约0.1 μ 1。在某些实 施方式中，样品尺寸为约5μ1 约Ο. μ 。在某些实施方式中，样品尺寸为约Ιμ 约 0.1 μ L在某些实施方式中，样品尺寸小于约ΙΟΟμΙ。在某些实施方式中，样品尺寸小 于约75 μ 1。在某些实施方式中，样品尺寸小于约50 μ 1。在某些实施方式中，样品尺寸 小于约25 μ 1。在某些实施方式中，样品尺寸小于约20 μ 1。在某些实施方式中，样品尺 寸小于约15 μ 1。在某些实施方式中，样品尺寸小于约10 μ 1。在某些实施方式中，样品 尺寸小于约5 μ 1。在某些实施方式中，样品尺寸小于约2 μ 1。在某些实施方式中，样品 尺寸小于约ι μ 1。在某些实施方式中，样品尺寸小于约0.5 μ 1。在某些实施方式中，样 品尺寸小于约0.1 μ 1。在某些实施方式中，样品尺寸小于约0.05 μ 1。在某些实施方式 中，样品尺寸小于约0.01 μ 1。在某些实施方式中，所述方法还包括将第一样品分为两个以上的等分样品并在 这两个以上的等分样品种检测至少一个标记物。在某些实施方式中，样品包括血浆、 血清、细胞溶解产物或组织样品。在某些实施方式中、样品包含支气管肺泡灌洗液 (BAL)、血液、血清、血浆、尿液、鼻拭子、脑脊液、胸腔积液、滑膜液、腹膜液、羊 水、胃液、淋巴液、组织间液、组织勻浆、细胞提取物、唾液、痰液、粪便、生理分泌 物、眼泪、粘液、汗液、乳汁、精液、精液、阴道分泌物、来自溃疡和其它表面疹的液 体、水泡液和脓肿、以及组织提取物(包括正常的、恶性的和怀疑的组织或身体的任何 其它可能含有所关注的靶标颗粒的组成部分的活组织检查)。如细胞或组织培养物或培养 液等其它类似样本也是所关注的。在某些实施方式中，第二标记物包括生物标记物、生理学标记物或遗传标记 物。在某些实施方式中，第二标记物包括蛋白。在某些实施方式中，第一标记物与第二 标记物中的至少一个以小于lOpg/ml的浓度见于来自正常个体的样品中。在某些实施方 式中，第一标记物与第二标记物中的至少一个以小于lOOpg/ml的浓度见于来自正常个体 的样品中。在某些实施方式中，第一标记物与第二标记物中的至少一个以小于75pg/ml 的浓度见于来自正常个体的样品中。在某些实施方式中，第一标记物与第二标记物中的 至少一个以小于50pg/ml的浓度见于来自正常个体的样品中。在某些实施方式中，第一 标记物与第二标记物中的至少一个以小于25pg/ml的浓度见于来自正常个体的样品中。 在某些实施方式中，第一标记物与第二标记物中的至少一个以小于20pg/ml的浓度见于 来自正常个体的样品中。在某些实施方式中，第一标记物与第二标记物中的至少一个以 小于15pg/ml的浓度见于来自正常个体的样品中。在某些实施方式中，第一标记物与第 二标记物中的至少一个以小于10pg/ml的浓度见于来自正常个体的样品中。在某些实施 方式中，第一标记物与第二标记物中的至少一个以小于5pg/ml的浓度见于来自正常个体 的样品中。在某些实施方式中，第一标记物与第二标记物中的至少一个以小于2pg/ml的 浓度见于来自正常个体的样品中。在某些实施方式中，第一标记物与第二标记物中的至 少一个以小于lpg/ml的浓度见于来自正常个体的样品中。在某些实施方式中，第一标记 物与第二标记物中的至少一个以小于0.5pg/ml的浓度见于来自正常个体的样品中。在某些实施方式中，第一标记物与第二标记物中的至少一个以小于O.lpg/ml的浓度见于来自 正常个体的样品中。在某些实施方式中，第一标记物与第二标记物中的至少一个以小于 0.05pg/ml的浓度见于来自正常个体的样品中。在某些实施方式中，第一标记物与第二标 记物中的至少一个以小于0.01pg/ml的浓度见于来自正常个体的样品中。在某些实施方式中，第二标记物的检出限为约10pg/ml 约0.01pg/ml。在某 些实施方式中，第二标记物的检出限小于约lOpg/ml。在某些实施方式中，第二标记物 的检出限小于约5pg/ml。在某些实施方式中，第二标记物的检出限小于约lpg/ml。在 某些实施方式中，第二标记物的检出限小于约0.5pg/ml。在某些实施方式中，第二标记 物的检出限小于约O.lpg/ml。在某些实施方式中，第二标记物的检出限小于约0.05pg/ ml。在某些实施方式中，第二标记物的检出限小于约O.Olpg/ml。在某些实施方式中， 第二标记物的检出限小于约0.005pg/ml。在某些实施方式中，第二标记物的检出限小于 约 0.00lpg/ml。在某些实施方式中，第二标记物包含B型利钠肽、IL-I a、IL_1 β、IL_6、 IL-8、IL-10、TNF-a、IFN- Y > cTnl、VEGF > 胰岛素、GLP-1 (活性)、GLP-1 (完 全)、TREMl、白三烯E4、Aktl、A β-40, A β-42, Fas配体或PSA。在某些实施 方式中，第二标记物是细胞因子。在某些实施方式中，细胞因子是G-CSF、MIP-I α、 IL-10、IL-22、IL-8、IL-5、IL-21、INF- Y > IL-15、IL-6、TNF-α、IL-7、 GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-1 α、IL-12、IL-17 α、IL-I β > MCP、IL-32 或 RANTES。 在某些实施方式中，细胞因子是IL-10、IL-8、INF- Y > IL-6、TNF-α、IL-7、IL-1 α 或IL-I β。在某些实施方式中，第二标记物包括载脂蛋白、缺血修饰白蛋白(IMA)、纤 连蛋白、C反应蛋白(CRP)、B型利钠肽(BNP)或髓过氧化物酶(MPO)。在某些实施方式中，本发明的方法还包括确定第一标记物的浓度并且如果第二 标记物包含蛋白则确定第二标记物的浓度。在某些实施方式中，本发明的方法包括如果 第二标记物包含蛋白则确定第一标记物浓度相比于第二标记物浓度的比值。在某些实施方式中，第二标记物包含生理学标记物。在某些实施方式中，生理 学标记物包含心电图(EKG)、压力测试、核成像、超声、胰岛素耐受性、体重指标、血 压、年龄、性别或睡眠窒息。在某些实施方式中，第二标记物包含分子标记物。在某些实施方式中，分子 标记物包含胆固醇、LDL/HDL/Q-LDL、甘油三酯、尿酸、肌酐、血葡萄糖或维生素 D。在某些实施方式中，分子标记物包含LDL/HDL/Q-LDL或甘油三酯的细分组分 (subfraction)。在某些实施方式中，第二标记物包含遗传标记物。在某些实施方式中，遗传标 记物包含编码如ApoE等载脂蛋白的基因中的变异。在某些实施方式中，遗传标记物包 含单核苷酸多态性(SNP)。在某些实施方式中，遗传标记物包括插入、缺失、融合或其 它突变。在某些实施方式中，遗传标记物包含表观遗传标记物，例如DNA甲基化或印记 (imprinting)。在本发明的方法的某些实施方式中，病况包括心脏损伤、炎性疾病、增生性病 症、代谢病症、血管生成、动脉粥样硬化或糖尿病。在某些实施方式中，心脏损伤包括 心肌梗塞、坏死、心脏机能受损、不稳定心绞痛、斑块、心脏衰竭、冠状动脉疾病或风湿性心脏病。在某些实施方式中，增生性病症包括癌症。在某些实施方式中，癌症包括 乳腺癌、前列腺癌或淋巴瘤。在某些实施方式中，本发明的方法还包括确定来自受试对象的第一样品和第二 样品之间的标记物浓度变化，由此将此变化用于检测或监测病况。在某些实施方式中， 本发明的方法还包括确定来自受试对象的第一样品和第二样品之间的第一标记物与第二 标记物的浓度比值的变化，由此将此变化用于检测或监测病况。在某些实施方式中，在 从受试对象获取第一样品和获取第二样品之间执行医疗程序。在某些实施方式中，医疗 程序包括手术程序、压力测试或治疗性干预。在某些实施方式中，将来自受试对象的一 系列样品用于检测或检测病况。在某些实施方式中，随时间进行收集系列样品并评估该 系列样品中的浓度变化。在某些实施方式中，本发明所述监测包括检测疾病进程、疾病复发、风险评 估、治疗效力或手术效力。在一个实施方式中，本发明提供了用于检测样品中的单颗粒的方法，所述方 法包括(a)如果样品中存在颗粒则用标记对该颗粒进行标记；和(b)检测所述标记 的存在或缺失，其中检测到所述标记的存在表明样品中存在所述单颗粒；其中所述单 颗粒的检出限小于20pg/ml;且其中所述单颗粒包括心脏肌钙蛋白I(cTnl)、B型利钠 肽(BNP、proBNP 或 NT-proBNP)、TREM-U 白细胞介素 1 α (IL-1 α )，白细胞介素 1 β (IL-1 β ),白细胞介素4(IL_4)、白细胞介素6(IL_6)、白细胞介素8(IL_8)、白细 胞介素10 (IL-10)、白细胞介素Y(IFN-Y)、肿瘤坏死因子α (TNF_ α )、胰高血糖素 样肽l(GLP-l)、白细胞三烯E4(LTE4)、转化生长因子β (TGF β )、AktU A β-40, Aβ-42, Fas配体(FasL)或血管内皮生长因子(VEGF)的单分子、片段或复合物。在某 些实施方式中，单颗粒的检出限为约lOpg/ml 约O.Olpg/ml。在某些实施方式中，单颗 粒的检出限小于约lOpg/ml。在某些实施方式中，单颗粒的检出限小于约5pg/ml。在 某些实施方式中，单颗粒的检出限小于约lpg/ml。在某些实施方式中，单颗粒的检出限 小于约0.5pg/ml。在某些实施方式中，单颗粒的检出限小于约O.lpg/ml。在某些实施 方式中，单颗粒的检出限小于约0.05pg/ml。在某些实施方式中，单颗粒的检出限小于约 0.01pg/ml。在某些实施方式中，单颗粒的检出限小于约0.005pg/ml。在某些实施方式 中，单颗粒的检出限小于约0.001pg/ml。在某些实施方式中，本发明提供了包含含有两种或更多种的针对两种或更多种 生物标记物的抗体的组合物的试剂盒，其中所述两种或更多种抗体与荧光染料部分相 连，其中所述两种或更多种生物标记物包含如上所述的颗粒，其中所述荧光部分在受到 在所述荧光部分的激发波长处发光的激光刺激时能够发射至少约200个光子，其中所述 激光聚焦于包含所述荧光部分的直径不小于约5微米的光斑上，并且其中由所述激光导 向该光斑的总能量不大于约3微焦，其中所述组合物被包装在合适的包装内。参考引用本文通过参考并入本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请，其程度等 同于具体并个别地指明将每个单独的出版物、专利或专利申请通过参考并入。
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在所附权利要求中具体描述了本发明的新颖特点。通过参考对其中利用本发明 的原理的说明性实施方式进行描述的以下具体描述以及附图将获得对本发明的特点和优 点的更好的理解，在所述附图中图IA和IB说明了单颗粒分析器的组件的布置的示意图。图IA显示了包含一 个电磁源和一个电磁检测器的分析器；图IB显示了包含两个电磁源和一个电磁检测器的 分析器。图2A和2B说明了单颗粒分析器用毛细管流动池的示意图。图2A显示了包含 一个电磁源的分析器的流动池；图2B显示了包含两个电磁源的分析器的流动池。图3A和3B说明了显示单颗粒分析器的激光和检测器光学器件的常规(A)和共 聚焦(B)安置的示意图。图3A显示了具有一个电磁源和一个电磁检测器的分析器的布 置；图3B显示了具有两个电磁源和一个电磁检测器的分析器的布置。图4说明了多标记物检测或病况监测的流程图。图5说明了其中客户端工作站接收来自远程计算机的测试结果的计算机系统。图6说明了用于范围浓度的CTnI的线性化标准曲线。图7A是说明在0. lpg/ml 0.2pg/ml的LoD时的100 μ 1样品和50 μ 1样品的cTnl
的分析灵敏度的图。图7B是说明标准曲线信号的下端的图。图8说明了在相应的变差系数(CV)为10%时，由第99百分比值确立的在cTnl 浓度为7pg/ml时cTnl的生物学阈值(截留浓度)。图9说明了使用本发明的分析器系统确定的CTnI测试结果与由国家标准和技术 局(NIST)提供的标准测定值之间的相关性(R2 = 0.9999)。图10说明了在来自在急诊室呈现胸痛的患者的系列血清样品的cTnl检测。将 用本发明的分析器系统进行的测定与用商购测试进行的测定进行了比较。图11说明了 cTnl的正常生物学浓度分布和来自呈现胸痛的患者的血清样品中的 cTnl浓度的分布。图12说明了 LTE4竞争曲线。LOD被确定为1.5pg/ml LTE4。图13说明了显示Aktl浓度的标准曲线的图。LOD经计算为25pg/ml Aktl。图14说明了显示TGF β浓度标准曲线的图。LOD经计算为350pg/ml TGF β。图15说明了一种试剂盒的示意图，所述试剂盒包含用于检测样品中的单个蛋 白分子和至少一个标记的分析器系统，所述标记包含荧光部分和所述蛋白分子的结合伴 侣，其中所述分析器包含用于刺激所述荧光部分的电磁辐射源；用于使标记通过的毛细 管流动池；用于使标记在毛细管流动池中移动的动力来源；在毛细管流动池内限定的询 查空间，该询查空间用于接收由电磁源发出的电磁辐射；和与询查空间可操作地连接的 电磁辐射检测器，其中所述荧光部分在受到在所述荧光部分的激发波长处发光的激光刺 激时能够发射至少约200个光子，其中所述激光聚焦于包含所述荧光部分的直径不小于 约5微米的光斑上，并且其中由所述激光导向该光斑的总能量不大于约3微焦。图16说明了在由单颗粒分析器系统开发的夹心分子免疫测试中测定的TREM-I 标准曲线。所述测试的线性范围为IOOfM 1500fM。图17A F说明了 IL-6和IL-8的检测。A) IL-6标准物，根据给出0.1pg/ml 10pg/ml的线性响应的商购试剂盒(R&D Systems，Minneapolis, MN)进行稀释。B): 低于lpg/ml的IL-6标准曲线。C)和D)在血库捐献者EDTA样本中鉴定的IL_6 (C) 和IL-S(D)的分布。E)通过将分析器的检测从对分子计数(数字信号)切换为检测在 较高浓度的分析物中产生的光子总数(模拟信号)可以将在任何分析物的低浓度时的检测 范围扩展至更高浓度。所述单颗粒分析器具有6个对数值的经扩展的线性动态范围。6 对数值检测范围基于从数字检测向模拟检测的切换。F)显示通过对个体颗粒发出的光 子进行计数(数字信号)而确定的低IL-6浓度范围(O.lfg/ml lOfg/ml)和更高的IL_6 浓度范围(lOfg/ml lpg/ml)的非线性化标准曲线。图18说明了本发明的测试与传统测试的比较。图19A是说明人VEGF测试的表现的图；图19B是在最低浓度时的测试表现的图。图20A是说明小鼠VEGF测试的表现的图；图20B是在最低浓度时的测试表现 的图。图21是比较本发明的VEGF测试与人血浆ELISA测试的图。图22A是比较使用MDA-MB-231乳腺癌细胞时在细胞溶解产物和培养基中检测 到的VEGF水平的图；图22B是比较使用HT-29结肠腺癌细胞时在细胞溶解产物和培养 基中检测到的VEGF水平的图。图23是对本发明的VEGF测试与小鼠血浆样品的ELISA测试的比较。图24A是说明使用B16黑色素瘤小鼠细胞系时在细胞溶解产物和培养基中检测 到的小鼠VEGF浓度的图；图24B是说明使用4T1乳癌时在细胞溶解产物和培养基中检 测到的小鼠VEGF浓度的图；图24C是说明使用CT26结肠癌细胞系时在细胞溶解产物和 培养基中检测到的小鼠VEGF浓度的图。图25A说明了显示出对VEGF的高灵敏检测的图。图25B说明了下端标准曲线信号。图26说明了使用不同的免疫测试格式时对人VEGF的检测的测定水平与预期水 平的比较1)基于磁性微粒的单分子计数(MP-SMC) ； 2)基于384孔板的单分子计数 (Plate-SMC)；和3)基于辣根过氧化物酶的酶联免疫吸附测试(HRP-ELISA)。图27A说明了在来自健康的和乳腺癌患者的10 μ 1血浆样品中检测到的人VEGF 的水平。显示了相对于标准ELISA格式(LOD = 31.2pg/ml)的使用本发明的方法时的检 出限(LOD) (Errena ； LOD = 3.5pg/ml)。图27B说明了在10 μ 1裂解物样品中的相似数 据。图28Α C说明了合并的VEGF模拟测定和数字测定。图29Α说明了显示出Αβ-40测试的特异性和线性的图。图29Β是显示Αβ_42 测试的特异性和线性的图。 图30Α是说明IL-I α的测试曲线拟合的图。图30Β是说明IL-1 α测试标准曲 线信号的下端的图。图31Α是说明IL-I β测试曲线拟合的图。图31Β说明了 IL-Ιβ曲线信号的下 端标准曲线。图32Α是说明IL-4测试曲线拟合的图。图32Β是下端处的IL_4测试标准曲线信号。
图33A是说明IL-6测试曲线拟合的图。图33B是下端处的IL_6测试标准曲线信号。
具体实施例方式提纲I.引言II.用于通过本发明的方法和组合物的灵敏检测的分子A.概述B.标记物III.标记A.结合伴侣1.抗体B.荧光部分1.染料2.量子点C.结合伴侣_荧光部分组合物IV.高灵敏分子分析A.样品B.样品制备C.对关注分子的检测和确定浓度V.适于高灵敏分子分析的仪器和系统A.装置/系统B.单颗粒分析器1.电磁辐射源2.毛细管流动池3.驱动力4.检测器C.采样系统D.样品制备系统E.样品回收VI.使用高灵敏分子分析的方法A.方法B.示例性标记物1.心脏损伤2.感染3.细胞因子a.白细胞介素1b.白细胞介素4C.白细胞介素6
4.炎性标记物a.白细胞三烯E4b.TGF β5 .Aktl6.Fas 配体7. VEGF8.淀粉样β蛋白C.多标记物分析组1.多生物标记物分析组2.混合标记物分析组D.检测和监测Ε.临床方法VII.试剂盒VIII.实例I.引言本发明提供了用于单分子的高灵敏检测以及用于样品中分子浓度的确定的仪 器、试剂盒、组合物和方法。在某些实施方式中，本发明的仪器、组合物、方法和试剂 盒的灵敏度和精度可以通过选自但不限于以下因素的因素的组合来实现合适波长和输 出功率的电磁源、适当的询查空间尺寸、高数值孔径透镜、能检测单光子的检测器和用 于对单分子进行计数的数据分析系统。本发明的仪器称作“单分子检测器”或“单颗粒 检测器”，并且也由术语“单分子分析器”和“单颗粒分析器”所涵盖。在某些实施方 式中，本发明的试剂盒和方法的灵敏度和精度通过将本发明的仪器与选自但不限于以下 因素的因素的组合共同使用而实现展示出使分子能在单分子水平被检测到的分子用标 记，和在本文所述的仪器中测试标记的方法。本发明的仪器、试剂盒和方法尤其可用于单分子或小分子的灵敏和精确检测， 以及用于确定样品中的分子浓度。在某些实施方式中，本发明提供了用于通过检测单分子来灵敏检测和确定分子 浓度的仪器和试剂盒、用于此类检测和确定的标记、和在样品分析中使用此类仪器和标 记的方法。特别地，本发明的仪器、试剂盒和方法的灵敏度和精度使得可以在极低浓度 (例如，低于约100飞摩尔、10飞摩尔、1飞摩尔、0.1飞摩尔、0.01飞摩尔或0.001飞摩 尔的浓度)检测和确定分子(例如，生物学状态标记物)的浓度。在其它实施方式中， 本发明的仪器和试剂盒能够在较大的动态浓度范围内(例如，在大于IO5倍、IO6倍或IO7 倍的浓度范围内)确定样品中物种的浓度(例如，分子的浓度)而无需对样品进行稀释或 其它处理。本发明的仪器、试剂盒和方法的高灵敏度使得可以使用此前因缺乏检测灵敏度 而不可用的标记物(例如，生物标记物)。本发明的仪器、试剂盒和方法的高灵敏度还有 助于建立新的标记物。目前存在大量可获取的能用于确定生物学状态但由于目前在测量 其较低浓度范围时的限制而没有实际采用的标记物。在某些情形中，通过目前的方法可 以检测到异常高水平的标记物，但尚未确立正常范围。在某些情况下，标记物的较高正常范围可检测，但较低正常范围或低于正常值的水平无法检测。在某些情况下，例如癌 症或感染的标记物，任何的标记物水平都能表明生物学状态的存在，而检测灵敏度的提 高有利于早期诊断。在某些情况下，标记物浓度在多个时间点上的变化速率或没有变化 提供了最有用的信息，但目前的分析方法不允许在病况的早期阶段(此时其通常最可被 治疗)进行时间点采样。在某些情况下，仅能通过使用在临床设定中不实际或不可用的 繁琐方法(例如，需要复杂样品处理和耗时的分析的方法)来在临床可用的水平检测标记 物。另外，存在如下的生物学状态潜在标记物，其具有足够低的浓度而使其存在极难或 不可能通过目前的方法来检测。本发明的分析方法和组合物提供了使得能够在此前无法检测到标记物的浓度对 生物学状态标记物进行检测的灵敏度、精度和稳健性，由此使得可以将此类标记物从确 认性标记物或仅可用于有限的研究设定中的标记物“重新利用”为诊断性标记物、预后 性标记物、治疗导向性标记物或其它类型的可用于临床设定和/或用于大规模临床设定 (包括临床试验)中的标记物。此类方法使得能够确定此类标记物的正�：头钦７段�。如此重新利用的标记物可以用于例如检测正常状态(正常范围)；检测响应物 /非响应物(例如，对于如药物施用等治疗的响应物/非响应物)；检测早期疾病或病理 的出现(例如，早期疾病检测、早期心脏缺血的检测)；疾病分期(例如，癌症)；疾病 监测(例如，糖尿病监测、对治疗后癌症复发的监测)；疾病机理研究；和治疗毒性(例 如，药物治疗毒性)的研究。因此本发明提供了用于灵敏检测标记物的方法和组合物，还提供了确立标记物 的正�：鸵斐Ｋ降闹档姆椒�。在其它实施方式中，本发明提供了基于对标记物确立 的值的诊断、预后和/或治疗选择方法。本发明还提供了用于此类方法中的组合物，例 如，用于标记物的超灵敏检测的检测试剂。II.本发明的方法和组合物的灵敏检测的分子本发明的仪器、试剂盒和方法可以用于许多不同类型的单分子的检测。具体而 言，所述仪器、试剂盒和方法可用于生物学状态标记物的灵敏检测和浓度确定。本文所 用的术语“单分子检测”既指直接检测也指间接检测。例如，可以用荧光标记将单分子 标记，并在本文所述的仪器中检测分子-标记复合物。替代性地，可以用荧光标记将单 分子标记，然后使荧光标记从该单分子分离，并在本文所述的仪器中检测该标记。术语 单分子检测涵盖了两种检测形式。A.概述可以使用本发明的分析器和相关方法检测的分子的实例包括例如蛋白、核 酸、糖类等生物聚合物和小分子(有机小分子和无机小分子)。具体而言，本文所述的仪 器、试剂盒和方法可用于检测生物样品中的蛋白和小分子的单分子，以及确定所述样品 中此类分子的浓度。术语“蛋白”、“多肽”、“肽”和“寡肽”在本文中可互换使用，并且包 括包含由肽键连接在一起的两个或多个氨基酸的任何组合物。可以理解，多肽可以含有 除通常称为20种天然存在氨基酸的20种氨基酸之外的其它氨基酸。此外，多肽可以包 含一个或多个氨基酸，包括经本领域已知的任何方法修饰(不管是天然地还是非天然地 修饰)的末端氨基酸。多肽修饰的实例包括例如糖基化或其它后翻译修饰。可存在于本发明的多肽中的修饰包括但不限于乙酰化、酰基化、ADP核糖基化、酰胺化、黄素 的共价连接、血红素部分的共价连接、多核苷酸或多核苷酸衍生物的共价连接、脂质或 脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键的形成、脱甲基 化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸酯的形成、甲酰化、Y-羧基化、糖化 (glycation),糖基化、GPI锚定物形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白 水解处理、磷酸化、异戊基化、消旋化、硒化、硫化、经转移RNA介导的向蛋白的氨基 酸添加(例如，精氨酸化)和泛素化。由本仪器、试剂盒和方法检测的分子可以为游离的，或为复合物(例如，抗 体-抗原复合物，或更一般而言的蛋白_蛋白复合物，例如肌钙蛋白复合物或前列腺特异 抗原(PSA)复合物)的一部分。本领域技术人员可以理解，在提及蛋白时，本发明可以 检测其片段、多肽、突变体、变异体或复合物。B.生物学状态标记物在某些实施方式中，本发明提供了用于灵敏检测生物标记物的组合物和方法， 和此类标记物在诊断、预后和/或治疗方法的确定中的使用。本发明的标记物可以为例如与生物体的生物学状态(例如，如疾病或非疾病态 等状况)相关的任何组合物和/或分子或者组合物和/或分子的复合物。标记物可以 为例如，小分子、多肽、核酸(如DNA和RNA)、脂质(如磷脂)或者胶束、细胞组分 (例如，线粒体或叶绿体)等。本发明所考虑的标记物可以是此前所已知的或未知的。 例如，在某些实施方式中，本文的方法能鉴定可以用作所关注的生物学状态或所关注的 状况的标记物的新型多肽，而在其他实施方式中，将已知多肽鉴定为所关注的生物学状 态或状况的标记物。使用本发明的系统可以使得能够观察那些标记物，例如，在确定有 机物的生物学状态中具有高度应用潜力但仅以低浓度存在的多肽，例如从患病组织“浸 出”的那些多肽。其它的具有高度应用潜力的标记物或多肽可以是那些与疾病有关的标 记物或多肽，例如，产生于肿瘤-宿主环境中的标记物或多肽。在本发明的方法和组合 物中可以使用可提供有关生物学状态的信息的任何合适的标记物。本文所用术语“标记 物”涵盖了可以在来自生物体的样品中被检测且其检测或定量提供了关于该生物体的生 物学状态的信息的任何分子。生物学状态包括但不限于表型状态；影响生物体的状况；发育阶段；年龄； 健康情况；病理学；疾病检测、过程或分期；感染；毒性；或对于化学因素、环境因素 或药物因素的响应(例如，药物响应表型、药物毒性表型或药物有效性表型)。本文所用术语“生物体”是指由至少一个细胞组成的任何生命体。生物体可以 简单如单细胞生物体，或复杂如哺乳动物。本发明的生物体优选为哺乳动物。此类哺乳 动物可以为例如人类，或者如灵长类(例如，猴、猩猩等)、驯养动物(例如，狗、猫、 马等)、农场动物(例如，山羊、绵羊、猪、牛等)或实验动物(例如，小鼠、大鼠等) 等动物。生物体优选为人类。在某些实施方式中，本发明的方法和组合物针对各类标记物，例如，细胞因 子、生长因子、肿瘤学标记物、炎症标记物、内分泌标记物、自身免疫标记物、甲状腺 标记物、心血管标记物、糖尿病标记物、传染病标记物、神经学标记物、呼吸道标记 物、胃肠道标记物、肌肉骨骼标记物、皮肤病学病症标记物和代谢标记物。
表1提供了已由本发明的方法和组合物测定的这些种类的标记物的实例，并且 提供了由本发明的方法和组合物检测的所述标记物的浓度，以及由本发明的单颗粒分析 器系统针对特定标记物所计出的颗粒数目。表1.标记物类别和类别中的示例性标记物
权利要求
1.一种检测或监测受试对象中的病况的方法，所述方法包括检测来自所述受试对 象的第一样品中的第一标记物和检测第二标记物，其中所述第一标记物包含心脏肌钙蛋 白-I(CTnI)或血管内皮生长因子(VEGF)，且其中所述第一标记物的检出限小于约20pg/ ml ο
2.如权利要求1所述的方法，其中对至少一个标记物的检测包括使所述样品与用于所 述标记物的标记接触并检测所述标记的存在或缺失，其中检测到所述标记的存在表明相 应的标记物的存在。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述标记包含荧光部分，且其中所述检测包括使所 述标记通过单分子检测器，其中所述单分子检测器包含(a)用于刺激所述荧光部分的电磁辐射源；(b)用于接收从所述电磁源发出的电磁辐射的巡查空间；和(c)与所述询查空间可操作地连接的电磁辐射检测器，该检测器用于确定受到刺激的 荧光部分的电磁特性。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述第一标记物的检出限为约lOpg/ml 约 0.01pg/ml。
5.如权利要求1所述的方法，其中检出限的变差系数(CV)为约20% 约1%。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述样品的大小为约10μ 1 约0.1 μ 1。
7.如权利要求1所述的方法，还包括将所述第一样品分为两个或更多个等分样品，并 在所述两个或更多个等分样品中检测至少一个标记物。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包括血浆、血清、细胞溶解产物或组织样品。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述第二标记物包括生物标记物、生理学标记物或 遗传标记物。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述第二标记物包括蛋白。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述第一标记物与所述第二标记物中的至少一个 以小于lOpg/ml的浓度见于来自正常个体的样品中。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述第二标记物的检出限为约20pg/ml 约 0.01pg/ml。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述第二标记物包括B型利钠肽、IL-Iα、 IL-I β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFNl、cTnl、VEGF 、 胰岛素、GLP-1 (活 性)、GLP-I (完全)、TREMU 白细胞三烯 E4、AktU A β-40, A β-42, Fas 配体或 PSA。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述第二标记物是细胞因子。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述细胞因子是G-CSF、MIP-Ia、IL-10、 IL-22、IL-8、IL-5、IL-21、INF- Y 、 IL-15、IL-6, TNF-α、IL-7、GM-CSF、 IL-2、 IL-4、IL-I a、IL-12、IL-17 a、IL-I β 、MCP 、 IL-32 或 RANTES。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述细胞因子是IL-10、IL-8、INF-Y , IL-6, TNF- a、IL-7, IL-I α 或 IL-I β。
17.如权利要求10所述的方法，其中所述第二标记物包括载脂蛋白、缺血修饰白蛋白(IMA)、纤连蛋白、C反应蛋白(CRP)、B型利钠肽(BNP)或髓过氧化物酶(MPO)。
18.如权利要求1所述的方法，还包括测定第一标记物的浓度，和在第二标记物包含 蛋白时测定第二标记物的浓度。
19.如权利要求1所述的方法，还包括在第二标记物包含蛋白时测定第一标记物浓度 与第二标记物浓度之比。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述第二标记物包含生理学标记物。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述生理学标记物包括心电图(EKG)、压力测 试、核成像、超声、胰岛素耐受性、体重指标、血压、年龄、性别或睡眠窒息。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述第二标记物包含分子标记物。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述分子标记物包括胆固醇、LDL/HDL/ Q-LDL、甘油三酯、尿酸、肌酐、血葡萄糖或维生素D。
24.如权利要求22所述的方法，其中分子标记物包括LDL/HDL/Q-LDL或甘油三酯 的细分组分。
25.如权利要求1所述的方法，其中所述第二标记物包含遗传标记物。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述遗传标记物包括编码载脂蛋白的基因中的变 异体。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述载脂蛋白是ApoE。
28.如权利要求1所述的方法，其中所述病况包括心脏损伤、炎性疾病、增生性病 症、代谢病症、血管生成、动脉粥样硬化或糖尿病。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述心脏损伤包括心肌梗塞、坏死、心脏机能受 损、不稳定心绞痛、斑块、心脏衰竭、冠状动脉疾病或风湿性心脏病。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述增生性病症包括癌症。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述癌症包括乳腺癌、前列腺癌或淋巴瘤。
32.如权利要求18所述的方法，还包括确定来自受试对象的第一样品和第二样品之间 的标记物浓度变化，由此将所述变化用于检测或监测病况。
33.如权利要求19所述的方法，还包括确定来自受试对象的第一样品和第二样品之间 的第一标记物与第二标记物的浓度比的变化，由此将所述变化用于检测或监测病况。
34.如权利要求32或33所述的方法，其中在从受试对象获取第一样品和获取第二样 品之间执行医疗程序。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述医疗程序包括手术程序、压力测试或治疗性 干预。
36.如权利要求1所述的方法，其中所述监测包括监测疾病进程、疾病复发、风险评 估、治疗效力或手术效力。
37.一种检测样品中的单分子的方法，所述方法包括(a)当在样品中存在颗粒时用标记对该颗粒进行标记；和(b)检测所述标记的存在或缺失，其中检测到所述标记的存在表明在样品中存在所述 单颗粒；其中所述单颗粒的检出限小于20pg/ml ；且其中所述单颗粒包括心脏肌钙蛋白I(cTnl)、B型利钠肽(BNP、proBNP或NT-proBNP) > TREM-U白细胞介素1 α (IL_1 α )、白细胞介素1 β (IL_1 β )、白细胞 介素4(IL_4)、白细胞介素6(IL_6)、白细胞介素8(IL_8)、白细胞介素10 (IL-10)、干 扰素Y(IFN-Y)、肿瘤坏死因子α (TNF-Ci)、胰高血糖素样肽1 (GLP_1)、白细胞三烯 E4CLTE4)、转化生长因子 β (TGF3)、AktU Aβ-40, Aβ-42, Fas 配体(FasL)或血 管内皮生长因子(VEGF)的单分子、片段或复合物。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述单颗粒的检出限为约lOpg/ml 约O.Olpg/ml ο
39.一种包含组合物的试剂盒，所述组合物包含针对两种或更多种生物标记物的两种 或更多种抗体，其中所述两种或更多种抗体与荧光染料部分相连，其中所述两种或更多 种生物标记物包含如权利要求37所述的颗粒，其中所述部分在受到在所述部分激发波长 处发光的激光刺激时能够发射至少约200个光子，其中所述激光聚焦于包含所述部分的 直径不小于约5微米的光斑上，并且其中由所述激光导向该光斑的总能量不大于约3微 焦，其中所述组合物被包装在合适的包装内。
全文摘要
本发明公开了使用高灵敏性分子检测来检测和监测受试对象中的病况的方法。本发明提供了检测或监测受试对象中的病况的方法，所述方法包括检测来自该受试对象的第一样品中的第一标记物和检测第二标记物，其中所述第一标记物包括如心脏肌钙蛋白-I(cTnI)或血管内皮生长因子(VEGF)等生物标记物，且其中所述第一标记物的检出限小于约10pg/ml。第二标记物可以为生物标记物、生理学标记物、分子标记物或遗传标记物。
文档编号G01N21/64GK102016552SQ200980116372
公开日2011年4月13日 申请日期2009年3月4日 优先权日2008年3月5日
发明者理查德·A·利文斯顿, 约翰·托德, 罗伯特·普斯卡斯, 菲利普·J·戈伊克斯, 萨拉·阿吉, 道格拉斯·赫尔德 申请人:神谷来克斯公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
