专利名称：柯萨奇病毒b分型免疫球蛋白抗体g酶免盒及制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术产品，具体涉及一种柯萨奇病毒(Cox)B1-6分型抗体IgG试剂盒及制备方法。
柯萨奇病毒B1-6对易感人群具有高度的传染性，儿童是最敏感的人群，病毒流行期儿童的感染率通常为10-20％家庭中所有敏感成员通常都被感染，因此，柯萨奇病毒B感染所致的相关疾病发病率较高，尤其柯萨奇病毒性心肌炎对儿童具有很大威胁的�：�。临床的病原学较早期诊断对有效治疗有很重要意义。以往柯萨奇病毒B感染和致病的病原学确诊法是病毒分离和心肌荧光染色，但这两种方法的标本采集和处理较复杂，病毒分离和取心肌荧光染色程序烦琐，实验时间很长，因此病毒分离技术和取心肌荧光法的早期诊断优势不大。而从血清中检测柯萨奇病毒B1-6型分型抗体IgG是病毒较早期感染的主要标志，确定CoxB1-6型型别感染是最后的病原学诊断。
本发明的目的在于克服以往方法的不足之处，研制一种灵敏度和特异性高的诊断试剂盒。
本发明提供了一种CoxB1-6分型抗体IgG ELISA试剂盒，该试剂盒用CoxB病毒B1-6分型抗原包被，兔抗人IgG联接辣根过氧化物酶为检测抗体，检测血清中的CoxB病毒B1-6分型抗体IgG，并且试剂盒由下列组成预包被反应条 96孔 酶结合物工作液 1瓶(10ml)样品稀释液 1瓶(6ml) 阳性对照 1支(200μl)阴性对照 1支(200μl) 20倍浓洗涤液 1瓶(13ml)显色剂A1瓶(3ml) 显色剂B 1瓶(3ml)终止液 1瓶(3ml)本发明的另一目的是提供了上述柯萨奇病毒B1-6分型抗体IgGELISA试剂盒的制备方法，该方法包括下列步骤一、原材料及其规格CoxB病毒B1-6分型IgG抗原的包被。酶标板华东理工大学ELISA测定CV(％)＜10％阳性对照诊断心肌炎患者血清，用本试剂盒测定A值＞0.8，放置-20℃备用。阴性对照选正常人血清，用本试剂盒测定A值＜0.09，放置-20℃备用。酶标抗体兔抗人IgG-HRP，(辣根过氧化物酶，RZ＞3.0 Sigma进口)酶标记兔抗人IgG，双扩散1∶64。小牛血清杭州四季清厂生产。其它试剂Na2CO3A.RNaHCO3A.R小牛血清 杭州四季清厂生产Na2HPO4·12H2O A.RNaH2PO4·2H2OA.RNaCL A.RTweel-20 化学纯甘油 化学纯H2O2A.R柠檬酸.H2O A.RTMB 熔点168℃EDTA A.RH2SO4A.RTris A.R蒸馏水必需符合《中国药典》(1990)之规定细胞及动物要求(1)Hela细胞(ATCC CCL-2)(2)新西兰大白兔2公斤左右二、包被抗体(CoxB病毒1-6分型抗原)的制备。(一)CoxB病毒1-6型的制备(1)CoxB病毒1-6型毒种来源昆明生物所(2)Hela细胞来源中科院细胞所(3)细胞传代①培养剂配制PRMI1640基础培养过滤除菌，200ml基础培养剂中含牛血清10％青霉素4万单位链霉素4万单位6％NaHCO3 4ml3％谷氨酰胺 6ml②胰酶(DT)配制用无Ca、Mg离子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化细胞。③细胞传代将成片的细胞倾去培养液，加入DT进行细胞消化，观察细胞已呈疏松网状，既倒去DT，加入营养液后，分瓶培养培养3-5天。(4)CoxB1-6型病毒的感染、培养、收毒和鉴定①将形态完整、成片的单层细胞倾去培养液后，用不含牛血清的洗液洗一次。②细胞感染病毒后，在37℃吸附1小时。③补充培养液，在37℃培养。④逐日观察细胞至所有细胞产生细胞病变后，用无菌方法收获病毒。⑤微量平底板进行病毒浓度的滴定和病毒鉴定。病毒滴定用10倍的倍比稀释的方法进行病毒的稀释，病毒加入微量板中，每孔加50μl病毒，每个稀释度加4孔，然后加入细胞50μl，设细胞对照，按Reed-Muench方法计算病毒的TCID50；病毒的鉴定应用免疫电镜法和应用中和试验方法(微量滴定法)1-6型病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔内，25μl/孔，抗血清作1∶4-1∶1024连续4倍稀释，25μl/孔，每个稀释度4孔，将板加盖，37℃中培育2小时。然后每孔内加Hela细胞50μl，同时设病毒阴性、阳性对照，逐日观察细胞病变。是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出现CPE；(5)抗原的制备、浓缩和纯化①病毒灭活；②去除病毒碎片用冷冻离心的方法去除细胞碎片；③初步浓缩、提纯用PEG方法进行提纯；④1-6型病毒的进一步纯化用葡聚糖过柱、洗脱的方法，然后在A280的分光光度计进行1-6型病毒蛋白含量的测定。三、兔抗人IgG(r)的制备(1)人IgG(r)链的制备(2)30ml人脐带混合血清，50％及33％饱和硫酸铵各盐析1次，PH7.2PBS透析去盐，体积浓缩至30％。(3)过Sephadex G200柱，PH8.0 0.2M Nacl-0.1Mtris缓冲液洗脱，分管收集，第二峰为IgG。(4)双扩散法鉴定IgG纯度。(5)10mM疏基乙醇4℃3h解离轻链，对PB透析24h。(6)再过Sephadex G200柱，洗脱液同上，收集第一峰IgG(r)链。(7)双扩散鉴定r链特异性。(8)光密度法测定IgG(r)浓度。(9)抗r链特异性抗体的制备。(10)1mg/ml r链加等量福氏完全佐剂研钵中研磨乳化。(11)每只兔颈背部多点注射3mg r链抗原，2周-1个月1次，共5-8次，双扩散效价达1∶64以上时采集血清。(12)辛酸法纯化抗血清IgG部分蛋白定量。四、酶标记抗体制备兔抗人IgG(r)用过碘酸钠法与辣根过氧化物酶偶联对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存，效价＞1∶1000(用方阵滴定法测定)。五、酶标记兔抗人IgG(r)浓度测定采用方阵滴定法选择酶标记抗体工作浓度为1∶2000六、预包被抗原板及试剂盒原料的制备(10包被Na2CO30.6gNa2HCO31.58g重蒸水500ml加入适量CoxB病毒1-6分型6型抗原，分别调整PH至9.5加入各型板条各孔中，置湿盒中加盖，4℃过夜后甩干。(2)洗涤Tris 2.42g重蒸水1000ml加入板条各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复3次，以除去剩余抗原。(3)封闭蔗糖 100g羊血清25ml0.1MPBS 1000ml加入各型板条各孔中放入湿盒中(加盖)37℃2h，弃去液体，吸水纸上拍干重复一次，待干燥后，放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃。(4)阳性对照制备诊断心肌炎患者的血清，60℃放置1小时，除菌过滤，用本试剂盒测定A值＞0.8备用，分装。(5)阴性对照的制备正常人血清用本试剂盒测定A值0-0.09用万分之二硫柳汞防腐备用分装。(6)酶标记抗体配制30％小牛血清兔抗人IgG(r)-HRP 50％0.15MPBS(稀释度1∶2000)20％甘油——————————————→稀释20倍分装(7)酶标记抗体稀释液小牛血清 30ml0.15MPBS 50ml甘油 20ml20％Tween-20 2.5ml调PH至7.2(8)显色剂ANa2HPO4.12H2O 1.7g柠檬酸.H2O0.5g3％H2O2200ul重蒸水 100ml调PH至5.0(9)显色剂BEDTA 17.5mg柠檬酸.H2O0.5g重蒸水 100ml加入10mlDMSO含60mg TMB的溶液25μl(10)终止液浓H2SO410ml蒸馏水 80ml(11)20X洗涤液Tris 4.84g重蒸水 100ml七、半成品的检定(1)包被板的检定CV(％)＜10％(n-10)(2)稳定性检定①阴性对照和阳性对照+4℃-+8℃的稳定性检定试剂盒内设定阴性对照及阳性对照均+4℃-+8℃放置9个月，再用该试剂盒测定吸光度在正常范围内。②试剂盒37℃稳定性检定装配前一星期将兔抗IgG-HRP(1+100)(同一批CoxB病毒1-6型用IgG-HRP各检测一次)置37℃，并于第1天，第3天，第5天，第7天各测定一次，并用兔抗人IgG-HRP置-20℃作对照，测得质控血清7天基本不变，则可以使用。(3)特异性检定用69份质控参比血清来检测半成品，阴性参比血清允许出现阳性1份，阳性参比血清允许出现阴性1份。
阴性质控血清45份组成T1-3HAV抗体阳性血清，T4-6HCV抗体阳性血清T7-9HEV抗体阳性血清，T10-14HBV表面抗体阳性血清，T15-24CoxB-IgM阴性血清，T25-27类风湿因子阳性血清，T28-30TB阳性血清，T31-33EBV阳性血清，T34-36CMV阳性血清，T37-39Hopl阳性血清，T40-42抗核抗体阳性血清，T43-45TOXO阳性血清，用6型IgG包被板测定。45份特异性血清应允许1份为阳性。
阳性质控血清24份组成Y1-24阳性血清(CoxB-IgG1-6型每型阳性血清4份)，24份阳性血清，应允许1份为阴性，其余23份应检测为阳性。(4)灵敏度检定①组成将中和实验效价高之CoxB-IgG阳性血清选择3份，分别编号为L1#、L2#和L3#。L1#按以下稀释度稀释1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024L2#按以下稀释度稀释1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048L3#按以下稀释度稀释1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512②判断标准6型对L1#灵敏度应检测到1∶32-1∶646型对L2#灵敏度应检测到1∶64-1∶1286型对L3#灵敏度应检测到1∶16-1∶32(5)精密度测定将同一样品平行加样10孔，其检测值的1-6型每型1份其变异系数均小于15％(CV％＜15)。(6)酶标抗体稀释液，底物液经过37℃细菌培养试验，发现无菌生长。八、试剂盒组装(1)上述制备步骤所用试剂用过滤器除菌过滤后超净分装。(2)试剂盒必需有外包装盒，海棉垫，塑料瓶6瓶，eppenkof管2支，包被板，说明书，内标签纸9张，外标贴纸1张，批号lot/EXP，48T/96T。九、成品检定(1)物理检查①药盒外包装，标签，批号，规格(48T/96T)有无遗漏。②药盒内试剂瓶完整无渗漏，试剂瓶数和说明书无欠缺，标签完整，有效期应清楚明晰。③药盒试剂(酶标抗体稀释液，显色剂A，显色剂B，洗涤液)核对PH值及溶液是否澄清。(2)稳定性检定完全同半成品检定(3)特异性检定完全同半成品检定。(4)灵敏度完全同半成品检定。(5)精密性完全同半成品检定。(6)抽样合格后，留下5个试剂盒剩余入库。
3个试剂盒4℃ 2个 隔一个月测定1次37℃ 1个 第一次隔三天测定1次，以后每星期测定1次，记录数据，绘制图表。
2个试剂盒留库备查十、保存与有效期保存于2-8℃，自检定后合格之日起有效期为8个月。
本发明的柯萨奇病毒B1-6分型IgG抗体试剂盒经上海长海医院临床应用结果如下标本对本院临床和门诊病人CoxB1-6混合型IgG抗体阳性的部分血清进一步作CoxB-IgG的分型检测。试剂盒上海新新医学生物工程公司CoxB1-6分型抗体IgG酶联试剂盒。检测模式为间接分步法。酶标仪Labsystems Dragon Wellscan MK3检测结果见下表CoxB分型IgG抗体阳性检出率结果临床拟诊 例数123456型阳性份数心肌炎 25 5520 971 47上感 5 022430 9发热待查 4 222111 9讨论1.CoxB1-6 IgG混合型抗体在多种疾病血清中可呈阳性结果，而本项目中不少病种的检测例数太少，故未再列入IgG抗体的分型研究中，无诊断栏中的检测例数虽达59例，但分型检测的临床意义不大，所以也未对此类血清作分型实验。本研究共对心肌炎、上感和发热待查三个病种计34例阳性血清作了分型检测。
2.从上表数据可看出，多数病例的同一份血清往往呈现CoxB二个型以上的IgG抗体阳性结果，在25例心肌炎中，一个型别抗体阳性的有7例，2个型别抗体阳性的有11例，3个型别抗体阳性的有5例，4个型别抗体阳性的有2例。上感和发热待查的9份病例全部是2个型别以上同时阳性，这反映柯萨奇病B组病毒的感染可能以混合型感染为主。
3.从分型检测中初步显示，CoxB病毒性心肌炎中以CoxB3型的感染为主，6型的感染极少，1、2、4、5型也有，但较少。上感与CoxB2、3、4、5型的感染均有关系，但与CoxB1、6两型关系不大。CoxB引起的不明发热，因病例太少，似难以断定主要与CoxB的哪一型别有关。
经上海第二医科大学附属新华医院临床应用结果如下应用上海新新医学生物工程公司提供的《柯萨奇病毒B1-6分型抗体IgG酶联免疫(ELISA)诊断试剂盒》对部分CoxB1-6混合型IgG抗体阳性血清作分型检测，实验按试剂盒说明书操作，酶标仪为Drganon Teknika Reader 530，试剂盒系采用间接ELISA法，分型检测的总结果见下表。
分型抗体检测结果诊断例数 1234 5 6 主型心肌炎 20 2516 8 4 03上感10 0126 6 14、5肺炎11 1733 5 02、5肝炎5 1130 5 03、5结果分析1.凡CoxB1-6混合型IgG抗体阳性的血清作分型IgG抗体检测时，全部有至少一型IgG抗体阳性、也即混合型IgG抗体阳性，分型IgG抗体也阳性。
2.CoxB感染的心肌炎，主型是3型，其中单独2型抗体阳性1例，单独4型抗体阳性2例，而凡3型抗体阳性的血清均同时伴有其它型抗体的阳性，从表中可见，CoxB6型似与心肌炎感染无关。10例上感中，单独4型阳性抗体的有3例，单独5型抗体阳性的也有3例，3、4、5型同时阳性的2例，2、5型阳性1例，4、6型阳性1例，可见上感主要与CoxB4、5型感染有关，与1、2、6型关系较少。肺炎与CoxB之间的关系和上感大致相似，也是与2、5两型关系较密切。肝炎患者血清中也常有CoxB IgM和IgG抗体的阳性，进一步的分型检测说明主要与CoxB3、5两型有关，尤其是5型，在5例混合型IgG阳性的血清中，5例均出现CoxB5型抗体阳性，而在所分型的5例中未查到4型和6型抗体阳性。
3.本项分型检测中，大多数病例的血清出现了二型以上抗体同时阳性的结果，这说明是几型病毒的混合感染呢？还是由于包被病毒抗原的交叉反应所致？对病例进一步分析，我们认为是以多型病毒的混合感染为主。
经上海中医药大学附属曙光医院临床应用结果如下一、材料1.“柯萨奇病毒B1-6分型抗体IgG酶联免疫诊断试剂盒”由上海新新医学生物工程公司提供。2.检测样品为本院应用该公司的“CoxB1-6混合型IgG抗体试剂盒”检测为阳性结果的血样共28份。二、方法根据试剂盒规定应用ELISA间接法测定病人血清中的CoxB1-6分型IgG抗体，操作步骤按说明书进行。酶标仪为Labsystems DragonWellscan MK3。三、CoxB1-6分型IgG抗体检测一览表。病名序号123456型心肌炎 1+++2+ +3 +++4++5+6 ++ +7+8++9 + + ++10 +11 +12 +13 ++++14 ++15 ++16 +17 ++ +18 + +上感 1 + +2+ +3 + ++4+++5++6 + +心律失常 1 + +四、讨论1.本项研究中选择了心肌炎的部份CoxB1-6 IgG阳性病例以及所有上感和心律失常CoxB1-6混合型IgG阳性病例作进一步分型抗体检测，结果凡混合型IgG抗体阳性的血清，作分型IgG抗体检测也至少有一型以上阳性，这说明该公司的混合型试剂盒和分型试剂盒能互相印证，检测结果正确。
2.本研究中分型检测血清共28份，单独一个型别病毒抗体阳性的血清只有6份，其余22份血清为二个以上型别的病毒抗体同时阳性，说明柯萨奇B组病毒感染可能系以多型病毒混合感染为主。
3.从18份心肌炎分型检测的结果中可以看出，18份心肌炎分型检测血清中CoxB3型占15份，4型占8份，所以初步提示柯萨奇病毒引起的心肌炎主要与CoxB3型感染为主，CoxB4型次之。
4.上感的主型CoxB病毒为3、4、5型，另三型病毒也有合并感染的情况，但阳性率较低。心律失常似乎与COXB3型关系更密切些，但检测病例数较少，尚须进一步观察。
本申请的柯萨奇病毒B1-6抗体IgG分型ELISA试剂盒。其检测方法简便快速，收费低廉，灵敏度和特异性均较高，它是柯萨奇病毒B感染疾病较早期诊断的鉴别诊断的可靠病原学指标，能最后确定CoxB1-6型感染的型别，临床应用价值较高，有较明显的社会和经济效益。
12.L精氨酸L组氨酸L蛋氨酸 上海试剂二厂13.小牛血清 杭州四季青生物材料工程公司14.胰蛋白酶 美国Sigma公司15.氯化铯 美国Sigma公司16.辣根过氧化物酶 美国Sigma公司17.TMB上海东风试剂厂18.高碘酸钠 上海化学试剂分装厂19.硼氢化钾 上海试剂一厂20.酶标板 华东理工大学新分离技术研究室二、CoxB1-6包被病毒抗原的制备1.CoxB病毒1-6型毒种来源昆明生物所2.Hela细胞来源中科院细胞所3.细胞传代①培养剂配制PRMI1640基础培养剂过滤除菌，200ml基础培养剂中含牛血清 10％青霉素 4万单位链霉素 4万单位6％NaHCO3 4ml3％谷氨酰胺 6ml②胰酶(DT)配制用无Ca、Mg离子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化细胞。③细胞传代将成片的细胞倾去培养液，加入DT进行细胞消化，观察细胞已呈疏松网状，即倒去DT，加入营养液后，分瓶培养3-5天。4.病毒的感染、培养、收毒和鉴定①将形态完整、成片的单层细胞倾去培养液后，用不含牛血清的洗液洗一次。②细胞感染病毒后，在37℃吸附1小时。③补充培养液，在37℃培养。④逐日观察细胞，至所有细胞产生细胞病变后，用无菌方法收获病毒。⑤微量平底板进行病毒浓度的滴定和病毒鉴定；病毒滴定用10倍的倍比稀释方法进行病毒的稀释，病毒加入微量板中，每孔加50μl病毒，每个稀释度加4孔，然后加入细胞50μl，设细胞对照，按Reed-Muench方法计算病毒的TCID50，本法培养病毒效价为TCID50＞10-5。病毒的鉴定
A.应用免疫电镜法；B.应用中和试验方法(微量滴定法)病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔内，25μl/孔，抗血清作1∶4-1∶1024连续4倍稀释，25μl/孔，每个稀释度4孔，将板加盖，37℃中培育2小时。然后每孔内加Hela细胞50μl，同时设病毒阴性、阳性对照，逐日观察细胞病变。是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出现CPE；三、抗原的制备、浓缩和纯化1.病毒灭活；2.去除病毒碎片用冷冻离心的方法去除细胞碎片；3.初步浓缩、提纯用PEG方法进行提纯；4.病毒的进一步纯化用葡聚糖过柱、洗脱的方法，然后在A280的分光光度计进行蛋白含量的测定；5.包被聚苯乙烯微孔板测定包被浓度和活性，1mg/ml病毒的包被浓度为1∶1000；四、兔抗人IgG(r)抗体的制备1.人IgM(r)链的制备①30ml人脐带混合血清，50％及33％硫酸铵饱和度各盐析1次，PH7.2PBS透析去盐，体积浓缩至30％；②过sephadex G200柱PH8.0 0.2M NaCl-0.1M Trs缓冲液洗脱，分管收集，第二峰为IgG。③双扩散法鉴定IgG纯度。④10mM巯基乙醇4℃3h解离轻链，对PBB透析24h。⑤再过sephadex G200柱，洗脱液同上，收集第一峰IgG(r)链。⑥双扩散鉴定r链特异性。⑦光密度法测定IgG(r)浓度。2.抗r链特异性抗体的制备①1mg/ml r链加等量福氏完全佐剂研钵中研磨乳化。②每只兔颈背部多点注射3mg r链抗原，2周-1个月1次，共5-8次，双扩效价达1∶64以上时采集血清。③辛酸法纯化抗血清IgG部份，蛋白定量。五、兔抗人IgG(r)酶标记物的制备。1.称5mg辣根过氧化物酶加0.5ml蒸馏水，再加0.5ml 60mM过碘酸钠液氧化15’4℃中。2.加0.16M乙二醇0.5ml中止氧化，4℃30’。3.加10mg/ml兔抗人IgG(r)0.5ml，装袋对碳酸钠缓冲液透析过夜。4.加5mg/ml硼氢化钾0.2ml，4℃3h再装透析袋对PH7.2 0.01M PBS透析24h，换液4-5次。5.取出兔抗人IgG(r)-HRP作工作浓度测定，配成1mg/ml浓度时的工作效价为1∶2000。六、阴，阳性对照血清配制从病毒攻击的细胞保护试验筛选阴性和阳性对照血清，并将阳性血清定值。七、CoxB1-6 IgG分型试剂盒操作方法建立1.预包被CoxB-IgG1-6型板的制备(10μg/ml抗原量)。CoxB IgG分型试剂盒操作流程。2.在试管中将待检血清，用PBS作1∶50稀释(10倍PBS1ml+9ml蒸馏水即为工作浓度)。3.各孔中滴加100μl滴样品稀释液，然后分别加待检血清5μl，同时做阳性对照1孔，阴性对照1孔(各加50μl)，空白对照1孔(孔含样品稀释液2滴)。4.置37℃温箱中反应60分钟，甩去孔内液体先在草纸上拍2-3下，然后用洗涤液洗5次，每次条孔加满洗涤液后停留30秒钟，每次甩去洗涤液后都要在草纸上拍干，以便洗涤彻底。(10倍浓洗涤液1ml+9ml蒸馏水即为工作洗涤液)。5.各孔加酶标记液1滴(50μl)，置37℃中反应60分钟。6.同上彻底洗涤拍干。7.各孔滴加显色剂A、B各1滴，置37℃中反应10-15分钟再每孔滴加终止液1滴，置酶标仪中450nM波长读数。8.结果判定阴性对照A值×2.5＝临界值，凡待检标本孔A值大于临界值即为阳性。阴性对照小于0.09按0.09计算。八、灵敏度测定选中和实验CoxB-IgG阳性血清3份，编号为L1#、L2#和L3#。
用CoxB1-6 IgG分型试剂盒分别对L1#按以下稀释度稀释1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024检测L2#按以下稀释度稀释1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048检测L3#按以下稀释度稀释1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512检测判断标准CoxB1-6型试剂盒对L1#灵敏度应检测到1∶32-1∶64CoxB1-6型试剂盒对L2#灵敏度应检测到1∶64-1∶128CoxB1-6型试剂盒对L3#灵敏度应检测到1∶16-1∶32九、特异性检定
用69份内控参比血清来检测半成品，阴性参比血清允许出现阳性1份，阳性参比血清允许出现阴性1份。
阴性质控血清45份组成T1-3HAV抗体阳性血清，T4-6HCV抗体阳性血清T7-9HEV抗体阳性血清，T10-14HBV表面抗体阳性血清，T15-24CoxB-IgM阴性血清，T25-27类风湿因子阳性血清，T28-30TB阳性血清，T31-33EBV阳性血清，T34-36CMV阳性血清，T37-39Hop1阳性血清，T40-42抗核抗体阳性血清，T43-45TOXO阳性血清，用6型IgG包被板测定。45份特异性血清应允许1份为阳性。
阳性质控血清20份组成Y1-24阳性血清(CoxB-IgG1-6型每型阳性血清4份)，24份阳性血清，应允许1份为阴性，其余23份应检测为阳性。十、精密度试验取实验吸光度分别为高中低A值的3份阳性血清做精密度试验，批内试验为每份血清同时做10个复孔，批间试验为每份血清间隔2-3天，实验1次，共测定6次，结果如下B1型试剂盒批内试验1 2 3 4 5 6 7 89 10X S CV(％)1 1. 11 1.20 1.18 1.24 1.09 1.06 1.22 1.14 1.13 1.07 1.144 0.063 5.52 0.76 0.74 0.68 0.67 0.75 0.66 0.70 0.71 0.69 0.80 0.716 0.045 6.33 0.41 0.38 0.40 0.36 0.44 0.37 0.38 0.39 0.34 0.43 0.390 0.031 7.9平均批间CV＝6.5％B1型试剂盒批间试验1 2 3 4 5 6 X S CV(％)1 1.06 1.11 1.10 0.99 0.95 1.03 1.04 0.063 6.022 0.76 0.68 0.74 0.69 0.81 0.75 0.738 0.047 6.53 0.41 0.37 0.36 0.43 0.38 0.35 0.383 0.031 8.03平均批间CV＝6.85％B2型试剂盒批内试验1 2 3 4 5 6 7 8 9 10X S CV(％)1 1.09 1.11 0.99 0.98 1.04 1.12 1.02 1.11 1.01 1.06 1.053 0.053 5.02 0.67 0.73 0.64 0.65 0.72 0.74 0.60 0.69 0.70 0.63 0.677 0.047 6.93 0.51 0.48 0.49 0.45 0.54 0.55 0.47 0.44 0.50 0.43 0.486 0.040 8.3平均批间CV＝6.73％B2型试剂盒批间试验1 2 3 4 5 6 X S CV(％)1 1.11 1.05 0.97 1.01 0.95 1.09 1.030 0.064 6.262 0.71 0.74 0.66 0.68 0.73 0.64 0.69 0.040 5.743 0.53 0.50 0.47 0.48 0.42 0.54 0.49 0.044 8.94平均批间CV＝6.98％B3型试剂盒批内试验1 2 3 4 5 6 7 8 9 10X S CV(％)1 1.34 1.31 1.40 1.33 1.30 1.38 1.42 1.41 1.33 1.37 1.359 0.043 3.12 0.86 0.94 0.78 0.87 0.85 0.76 0.80 0.81 0.79 0.90 0.836 0.057 6.93 0.61 0.58 0.60 0.55 0.63 0.56 0.59 0.58 0.55 0.62 0.587 0.028 4.8平均批间CV＝4.9％B3型试剂盒批间试验1 2 3 4 5 6 X S CV(％)1 1.34 1.39 1.30 1.29 1.36 1.25 1.32 0.051 3.872 0.86 0.94 0.80 0.79 0.91 0.81 0.852 0.062 7.333 0.61 0.57 0.55 0.62 0.57 0.55 0.578 0.030 5.18平均批间CV＝5.46％B4型试剂盒批内试验1 2 3 4 5 6 7 8 9 10X S CV(％)1 0.95 0.91 0.89 0.86 0.98 0.85 0.83 0.87 0.97 0.88 0.899 0.052 5.782 0.78 0.72 0.69 0.73 0.68 0.79 0.64 0.62 0.81 0.83 0.729 0.072 9.93 0.39 0.43 0.36 0.34 0.44 0.38 0.38 0.40 0.36 0.37 0.385 0.031 8.14平均批间CV＝7.94％B4型试剂盒批间试验1 2 3 4 5 6 X S CV(％)1 0.91 0.97 0.84 0.88 0.96 0.86 0.903 0.053 5.82 0.78 0.73 0.65 0.63 0.71 0.61 0.685 0.066 9.583 0.39 0.43 0.34 0.41 0.37 0.36 0.383 0.033 8.68平均批间CV＝8.05％B5型试剂盒批内试验1 2 3 4 5 6 7 8 9 10X S CV(％)1 0.87 0.90 0.84 0.83 0.89 0.92 0.93 0.86 0.84 0.82 0.87 0.038 4.42 0.69 0.67 0.72 0.73 0.66 0.64 0.68 0.75 0.63 0.65 0.682 0.040 5.93 0.32 0.36 0.35 0.30 0.31 0.29 0.34 0.36 0.38 0.29 0.33 0.032 9.79平均批间CV＝6.7％并且具有夹持用的端部。夹持用端部具有曲率半径R为0mm或2mm的角形部。
表2
表3
用目视检查开口的和封闭的裂纹，而用比色法检查细裂纹。对裂纹敏感性的评定方法是由在同样条件下各制备10个每种型式的试样来实现的，将浇铸后有开口裂纹、封闭裂纹和细裂纹的试样数加起来，并将其值作为一个指标。表4示出观察的结果。
权利要求
1.一种柯萨奇病毒B1-6分型抗体IgG试剂盒，其特征在于该试剂盒用CoxB病毒B1-6分型抗原包被，兔抗人IgG联接辣根过氧化物酶为检测抗体，检测血清中的CoxB病毒B1-6分型抗体IgG，并且试剂盒由下列组成预包被反应条 48孔/96孔(盒) 酶结合物工作液； 1瓶(10ml)样品稀释液 1瓶(6ml) 阳性对照 1支(200μl)阴性对照 1支(200μl) 20倍浓洗涤液 1瓶(13ml)显色剂A1瓶(3ml) 显色剂B 1瓶(3ml)终止液 1瓶(3ml)
2.一种如权利要求1所述的一种柯萨奇病毒B1-6分型抗体IgG试剂盒的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤一、原材料及其规格CoxB病毒B1-6分型IgG抗原的包被；酶标板华东理工大学ELISA测定CV(％)＜10％阳性对照诊断心肌炎患者血清，用本试剂盒测定A值＞0.8，放置-20℃备用；阴性对照选正常人血清，用本试剂盒测定A值＜0.09，放置-20℃备用；酶标抗体兔抗人IgG-HRP，(辣根过氧化物酶，RZ＞3.0 Sigma进口)酶标记兔抗人IgG，双扩散1∶64；小牛血清杭州四季清厂生产；其它试剂Na2CO3A.RNaHCO3A.R小牛血清 杭州四季清厂生产Na2HPO4·12H2O A.RNaH2PO4·2H2OA.RNaCLA.RTweel-20化学纯甘油化学纯H2O2A.R柠檬酸.H2O A.RTMB 熔点168℃EDTA A.RH2SO4A.RTrisA.R蒸馏水必需符合《中国药典》(1990)之规定细胞及动物要求(1)Hela细胞(ATCCCCL-2)(2)新西兰大白兔 2公斤左右二、包被抗原(CoxB病毒1-6分型抗原)的制备；(一)CoxB病毒1-6型的制备(1)CoxB病毒1-6型毒种来源昆明生物所(2)Hela细胞来源中科院细胞所(3)细胞传代①培养剂配制PRMI1640基础培养过滤除菌，200ml基础培养剂中含牛血清10％青霉素4万单位链霉素4万单位6％NaHCO3 4ml3％谷氨酰胺 6ml②胰酶(DT)配制用无Ca、Mg离子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化细胞；③细胞传代将成片的细胞倾去培养液，加入DT进行细胞消化，观察细胞已呈疏松网状，既倒去DT，加入营养液后，分瓶培养培养3-5天；(4)CoxB1-6型病毒的感染、培养、收毒和鉴定①将形态完整、成片的单层细胞倾去培养液后，用不含牛血清的洗液洗一次；②细胞感染病毒后，在37℃吸附1小时；③补充培养液，在37℃培养；④逐日观察细胞至所有细胞产生细胞病变后，用无菌方法收获病毒；⑤微量平底板进行病毒浓度的滴定和病毒鉴定；病毒滴定用10倍的倍比稀释的方法进行病毒的稀释，病毒加入微量板中，每孔加50μl病毒，每个稀释度加4孔，然后加入细胞50μl，设细胞对照，按Reed-Muench方法计算病毒的TCID50；病毒的鉴定应用免疫电镜法和应用中和试验方法(微量滴定法)1-6型病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔内，25μl/孔，抗血清作1∶4-1∶1024连续4倍稀释，25μl/孔，每个稀释度4孔，将板加盖，37℃中培育2小时；然后每孔内加Hela细胞50μl，同时设病毒阴性、阳性对照，逐日观察细胞病变；是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出现CPE；(5)抗原的制备、浓缩和纯化①病毒灭活；②去除病毒碎片用冷冻离心的方法去除细胞碎片；③初步浓缩、提纯用PEG方法进行提纯；④1-6型病毒的进一步纯化用葡聚糖过柱、洗脱的方法，然后在A280的分光光度计进行1-6型病毒蛋白含量的测定；三、兔抗人IgG(r)的制备(1)人IgG(r)链的制备(2)30ml人脐带混合血清，50％及33％饱和硫酸铵各盐析1次，PH7.2PBS透析去盐，体积浓缩至30％；(3)过Sephadex G200柱，PH8.0 0.2M Nacl-0.1Mtris缓冲液洗脱，分管收集，第二峰为IgG；(4)双扩散法鉴定IgG纯度；(5)10mM疏基乙醇4℃ 3h解离轻链，对PB透析24h；(6)再过Sephadex G200柱，洗脱液同上，收集第一峰IgG(r)链；(7)双扩散鉴定r链特异性；(8)光密度法测定IgG(r)浓度；(9)抗r链特异性抗体的制备；(10)1mg/ml r链加等量福氏完全佐剂研钵中研磨乳化；(11)每只兔颈背部多点注射3mg r链抗原，2周-1个月1次，共5-8次，双扩散效价达1∶64以上时采集血清；(12)辛酸法纯化抗血清IgG部分蛋白定量；四、酶标记抗体制备兔抗人IgG(r)用过碘酸钠法与辣根过氧化物酶偶联对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存，效价＞1∶1000(用方阵滴定法测定)；五、酶标记兔抗人IgG(r)浓度测定采用方阵滴定法选择酶标记抗体工作浓度为1∶2000六、预包被抗原板及试剂盒原料的制备(10包被Na2CO30.6gNa2HCO31.58g重蒸水 500ml加入适量CoxB病毒1-6分型6型抗原，分别调整PH至9.5加入各型板条各孔中，置湿盒中加盖，4℃过夜后甩干；(2)洗涤Tris2.42g重蒸水 1000ml加入板条各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复3次，以除去剩余抗原；(3)封闭蔗糖100g羊血清 25ml0.1MPBS 1000ml加入各型板条各孔中放入湿盒中(加盖)37℃2h，弃去液体，吸水纸上拍干重复一次，待干燥后，放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃；(4)阳性对照制备诊断心肌炎患者的血清，60℃放置1小时，除菌过滤，用本试剂盒测定A值＞0.8备用，分装；(5)阴性对照的制备正常人血清用本试剂盒测定A值0-0.09用万分之二硫柳汞防腐备用分装；(6)酶标记抗体配制30％小牛血清兔抗人IgG(r)-HRP 50％0.15MPBS(稀释度1∶2000) 20％甘油——————————→稀释20倍分装(7)酶标记抗体稀释液小牛血清 30ml0.15MPBS 50ml甘油 20ml20％Tween-20 2.5ml调PH至7.2(8)显色剂ANa2HPO4.12H2O 1.7g柠檬酸.H2O0.5g3％H2O2200ul重蒸水 100ml调PH至5.0(9)显色剂BEDTA 17.5mg柠檬酸.H2O0.5g重蒸水 100ml加入10mlDMSO含60mg TMB的溶液25ul(10)终止液浓H2SO410ml蒸馏水80ml(11)20X洗涤液Tris 4.84g重蒸水100ml七、半成品的检定(1)包被板的检定CV(％)＜10％(n-10)(2)稳定性检定①阴性对照和阳性对照+4℃-+8℃的稳定性检定试剂盒内设定阴性对照及阳性对照均+4℃-+8℃放置9个月，再用该试剂盒测定吸光度在正常范围内；②试剂盒37℃稳定性检定装配前一星期将兔抗IgG-HRP(1+100)(同一批CoxB病毒1-6型用IgG-HRP各检测一次)置37℃，并于第1天，第3天，第5天，第7天各测定一次，并用兔抗人IgG-HRP置-20℃作对照，测得质控血清7天基本不变，则可以使用；(3)特异性检定用69份质控参比血清来检测半成品，阴性参比血清允许出现阳性1份，阳性参比血清允许出现阴性1份；阴性质控血清45份组成T1-3HAV抗体阳性血清，T4-6HCV抗体阳性血清T7-9HEV抗体阳性血清，T10-14HBV表面抗体阳性血清，T15-24CoxB-IgM阴性血清，T25-27类风湿因子阳性血清，T28-30TB阳性血清，T31-33EBV阳性血清，T34-36CMV阳性血清，T37-39Hopl阳性血清，T40-42抗核抗体阳性血清，T43-45TOXO阳性血清，用6型IgG包被板测定；45份特异性血清应允许1份为阳性；阳性质控血清24份组成Y1-24阳性血清(CoxB-IgG1-6型每型阳性血清4份)，24份阳性血清，应允许1份为阴性，其余23份应检测为阳性；(4)灵敏度检定①组成将中和实验效价高之CoxB-IgG阳性血清选择3份，分别编号为L1#、L2#和L3#；L1#按以下稀释度稀释1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024L2#按以下稀释度稀释1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048L3#按以下稀释度稀释1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512②判断标准6型对L1#灵敏度应检测到1∶32-1∶646型对L2#灵敏度应检测到1∶64-1∶1286型对L3#灵敏度应检测到1∶16-1∶32(5)精密度测定将同一样品平行加样10孔，其检测值的1-6型每型1份其变异系数均小于15％(CV％＜15)；(6)酶标抗体稀释液，底物液经过37℃细菌培养试验，发现无菌生长；八、试剂盒组装(1)上述制备步骤所用试剂用过滤器除菌过滤后超净分装；(2)试剂盒必需有外包装盒，海棉垫，塑料瓶6瓶，eppenkof管2支，包被板，说明书，内标签纸9张，外标贴纸1张，批号lot/EXP，48T/96T；九、成品检定(1)物理检查①药盒外包装，标签，批号，规格(48T/96T)有无遗漏；②药盒内试剂瓶完整无渗漏，试剂瓶数和说明书无欠缺，标签完整，有效期应清楚明晰；③药盒试剂(酶标抗体稀释液，显色剂A，显色剂B，洗涤液)核对PH值及溶液是否澄清；(2)稳定性检定完全同半成品检定(3)特异性检定完全同半成品检定；(4)灵敏度完全同半成品检定；(5)精密性完全同半成品检定；(6)抽样合格后，留下5个试剂盒剩余入库；3个试剂盒4℃ 2个 隔一个月测定1次37℃ 1个 第一次隔三天测定1次，以后每星期测定1次，记录数据，绘制图表；2个试剂盒留库备查十、保存与有效期保存于2-8℃，自检定后合格之日起有效期为8个月。
全文摘要
本发明公开了一种柯萨奇病毒B1－6分型抗体IgG试剂盒。该试剂盒用Cox病毒B1－6分型抗原包被,免抗人IgG联接辣根过氧化物酶为检测抗体,检测血清中的Cox病毒B1－6分型抗体IgG。本发明的试剂盒灵敏度和特异性高,临床应用价值高。本发明提供了制备方法。
文档编号G01N33/531GK1382990SQ01112708
公开日2002年12月4日 申请日期2001年4月24日 优先权日2001年4月24日
发明者杜凤鸣 申请人:杜凤鸣
专业数控铣床产品供应商
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