专利名称：一种荧光pcr检测单纯疱疹病毒i型的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光PCR检测单纯疱疹病毒I型的试剂盒，特别是涉及以实时荧光聚合酶链反应技术快速、定性检测单纯疱疹病毒I型感染的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对样本中单纯疱疹病毒I型核酸DNA进行定性检测，适用于单纯疱疹病毒I型感染的辅助诊断，抗病毒治疗的疗效监测和流行病学研究。
背景技术：
单纯疱疫病毒herpes simplex virus,属于疱疫病毒科a病毒亚科,病毒质粒大小约180纳米。根据抗原性的差别目前把该病毒分为I型和2型。I型主要由口唇病灶获得，2型可从生殖器病灶分离到。感染是由于人与人的接触。从发生后四个月到数年被感染的人数可达人口总数的50-90%,是最易侵犯人的一种病毒,但在临床仅有一部份发病。此病可分为口唇性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、阴部疱疹、卡波西病等，有时也是脑膜炎、脑炎的病因。口唇部疱疹一般较易诊断，同时因日晒、发热等种种的刺激因素而引起复发。该病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上及人、猴、鸡等的动物培养细胞中大量地增殖。HSV具有典型疱疹病毒形态特征。根据生物化学、生物学、流行病学等分为两个血清型，S卩HSV-I和HSV-2。二者基因组相似，序列有50%的同源性，HSV基因组大约152kb，34个基因，编码70多个多肽(polyp印tides)。特别是基因编码的晚期蛋白中有11种包膜糖蛋白(gB、gC、gD、gE、gG、gH、gl、gj、gK、gL、gM),有些功能较清楚。其中gB和gD与病毒吸附和穿入有关，是与细胞特异性受体相互作用的病毒配体分子。gD诱导产生中和抗体的能力最强，可用于研制疫苗。gC是补体C3b-结合蛋白(complement C3b_binding protein)。gE是Fe受体，可与IgG的Fe端结合。gG为型特异性抗原，以此抗原能区别HSV-I (gG-Ι)和HSV-2 (gG-2)。gH与病毒的释放有关。HSV对动物感染宿主范围较广。常用实验动物为家兔、豚鼠及小鼠等。HSV在多种细胞中能增殖，常用原代兔肾、人胚肾细胞以及地鼠肾等传代细胞培养分离病毒。感染细胞很快出现明显细胞病变，并出现嗜酸性核内包涵体。单纯疱疹病毒在全球广泛分布，人群中感染极为普遍，潜伏和复发感染者较多。患者和带毒者是该病的传染源。病毒可通过皮肤、粘膜的直接接触或性接触途径进入机体。新生儿疱疹是临床上常见而又严重的感染，据统计死亡率超过50%，存活者约有1/2严重损伤。HSV-1、HSV-2在分娩时均可通过产道感染新生儿，以HSV-2为多见，约占75%。常发生在生后第6天。感染类型有①皮肤、眼和口腔的局部损伤；②脑炎；③病毒播散到内脏，发生脓毒血症(s印sis)，常引起死亡。早期抗感染可减少死亡率。剖腹产是避免生殖道感染的有效方法。妊娠妇女感染HSV-1，病毒有可能经胎盘感染胎儿，造成流产、死胎或先天性畸形。单纯疱疹病毒I型多引起腰部以上的皮肤、眼、口腔疱疹和器官(脑)的感染，HSV-I的原发感染常局限在口咽部，尤以龈口炎(gingivostomatitis)最为多见。此外还可引起脑炎、皮肤疱疹性湿疹。成人可引起咽炎和扁桃体炎。近年来发现HSV-I也是导致生殖器疱疹的重要原因之一。微生物学检查法包括
病毒分离培养是当今临床上明确诊断疱疹病毒感染的可靠依据。可采集皮肤、生殖器等病变部位的水疱液、脑脊液、角膜刮取物、唾液等标本，接种人二倍体成纤维细胞株WI38及其它传代细胞株如Veix)、BHK等，经24 48小时后，细胞则出现肿胀、变圆、细胞融合等病变。然后用HSV-I和HSV-2的单克隆抗体作免疫荧光染色鉴定或应用DNA限制性内切酶图谱分析来定型。抗体检测常用于抗体检测的方法有补体结合试验、中和试验、免疫荧光及酶联免疫吸附试验等，临床多用于急性感染诊断和器官移植患者的检测，以及流行病学调查。如用于急性感染诊断,应采取急性期和恢复期双份血清，同时检测血清中的IgG和IgM。DNA检测取病变组织或细胞，提取病毒DNA，与标记的HSV DNA探针进行杂交或应用PCR检测HSV-I或HSV-2的gB糖蛋白基因来判断是否是HSV的感染。这种方法已用于疑为HSV脑炎患者的诊断。而实时荧光PCR技术是一种新的PCR方法，是在常规PCR反应的基础上增加了能与扩增模板特异性结合的探针，与传统PCR相比，该方法无需对PCR产物进行再处理，完全是在封闭状态下完成检测的全过程，具有实时、准确、快速等特点。本试剂盒采用TaqMan荧光探针技术，选取单纯疱疹病毒I型基因编码区的高度特特异保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，其中目的荧光探针5’端标记荧光发射基团FAM，3’端标记非荧光淬灭基团BHQ1，利用荧光PCR检测仪可在FAM通道检测荧光信号。同时设置了内标质控系统，用于整个核酸提取和反应体系的质量控制。内标靶区域选取与HSV-I目标区域一致，并在探针位置人工合成了一段寡核苷酸，设计特异性荧光探针，与任何物种均无交叉反应，其中荧光探针5’端标记荧光发射基团HEX，并与内标质粒共同组成内标质控体系，可在VIC通道检测荧光。对于待检物而言，若检测结果显示典型的S型荧光增长曲线，则为阳性标本，反之则为阴性。通过简单易操作的核酸提取系统，结合实时荧光PCR检测系统运行PCR扩增程序，本试剂盒实现了检测的高效率、高灵敏和高特异。
发明内容
本发明涉及一种荧光PCR检测单纯疱疹病毒I型的试剂盒，特别是涉及以实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)技术快速、定性检测单纯疱疹病毒I型感染的试剂盒。应用荧光PCR的方法，对疱疹液、泌尿生殖道分泌物等样本中的单纯疱疹病毒I型DNA进行定性检测，可用于单纯疱疹病毒I型感染的辅助诊断，抗病毒治疗的疗效监测和流行病学研究。其基本原理是利用实时荧光PCR技术，以单纯疱疹病毒I型基因编码区的高度特特异保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，进行PCR扩增，用于单纯疱疹病毒I型DNA的定性检测。另外，本试剂盒还带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。为了实现本发明，我们采用了以下技术方案I)使用适当的核酸分析软件分别对已知的单纯疱疹病毒I型基因的核苷酸序列进行同源性比较，在找出同源区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件选择并设计寡核苷酸引物和探针。由于所设计的引物和探针均具有互补于HSV-I基因的序列，而且与其他病原体的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点，所以避免了单纯疱疹病毒I型检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度。同时设置了内标质控系统，用于整个反应体系的质量控制。内标靶区域选取与HSV-I目标区域一致，并在探针位置人工合成了一段寡核苷酸，设计特异性荧光探针，与任何物种均无交叉反应。2)使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物和探针，用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团(报告基团)的6-FAM amidite和HEX，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联上作为荧光淬灭或抑制基团的BHQ1。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20% )电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。 3)适宜于PCR扩增的反应体系。反应体系包括热启动Taq酶、2’ -脱氧核苷三磷酸、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、能够与内标核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的检测内标的寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液。同时设置了内标质控系统，用于整个核酸提取和反应体系的质量控制。4)从待测样本中提取核酸DNA，分别加入前述的反应体系中，直接经PCR扩增，从荧光扩增曲线对未知样本的核酸DNA进行定性检测。基于以上技术方案发明的试剂盒包括(I)核酸提取试剂、HSV-I反应液A、HSV-I反应液B、HSV-1内标溶液、阴性质控品、HSV-I强阳性质控品、HSV-I临界阳性质控品，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。根据本发明的一个优选实施方案，其中PCR反应体系包括HSV-I反应液A和HSV-I反应液B。 根据本发明的另一个优选实施方案，其中HSV-I反应液A (引物探针混合液)由正向引物、反向引物、目的寡核苷酸探针、内标寡核苷酸探针和PCR反应缓冲液组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物分别是5 ’ -TTATCCCATTCCTTTTGGTTCTT-3 ’ (SEQID NO 1)和 5’ -GGGTCATGTTGGGGGCTT-3’ (SEQ ID NO 2)。根据本发明的另一个优选实施方案，其特征还在于用于靶多核苷酸扩增的寡核苷酸探针是 5’-X-TGGGGTTGGGTGGTGGAGGAGA-Y-3’ (SEQ ID NO :3)，其中 X/Y 表示荧光标记基团，包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。根据本发明的另一个优选实施方案，其特征还在于用于靶多核苷酸扩增的引物探针浓度均为5 15pmol/人份,优选引物浓度为IOpmol/人份、探针浓度为5pmol/人份。根据本发明的另一个优选实施方案，引物探针混合液中用于内标多核苷酸扩增的寡核苷酸探针是 5’ -X-CCTGCTCTGACTCTGACCATCCCTG-Y-3’ (SEQ ID NO :4)，其中 X/Y 表示荧光标记基团，包括能够与内标多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中引物探针混合液中用于内标多核苷酸扩增的寡核苷酸探针浓度为3 IOpmol/人份，优选探针浓度为5pmol/人份。根据本发明的另一个优选实施方案，HSV-I反应液B由热启动Taq酶、dNTPs、酶稀释液组成。根据本发明的另一个优选实施方案，其特征还在于热启动Taq酶用量为3 7U/人份、dNTPs浓度为O. 20mmol/L,酶稀释液为一般市售的酶稀释液。根据本发明的另一个优选实施方案，H SV-I反应液A包括PCR反应缓冲液，其中PCR 反应缓冲液包含 10mmol/L Tris-HCl (pH8. 8) ,50mmol/L KC1.3. Ommol/L MgCl20根据本发明的一个优选实施方案，阴性质控品为生理盐水，HSV-I强阳性质控品和HSV-I临界阳性质控品均为含有HSV-I病毒株，且浓度分别为5. OX IO6和5. O X 103IU/ml。根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增的最佳反应温度和时间为95°C 15min，l个循环；最后94°C 15s，55°C 45s，40个循环收集荧光信号。根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的待检样品是疱疹液、泌尿生殖道分泌物、生殖道刮片、脑脊液、气管支气管分泌物、支气管肺泡灌洗液等。本发明提供的PCR试剂盒可以检测出单纯疱疹病毒I型的灵敏度为IOOcopies/ml，说明本试剂盒具有非�：玫牧槊舳�。本发明针对单纯疱疹病毒I型基因设计特异性引物和探针，检测的线性范围为2. 5X 102copies/ml-l. OX 108copies/ml,与同种属、感染部位相同或感染症状相似的其他病毒(单纯疱疹病毒II型、人巨细胞病毒、EB病毒等)无交叉反应。本发明与现有技术相比，具有以下优点(现有检测单纯疱疹病毒I型的技术与本技术对比后的优点)(I)全封闭反应，提取DNA以后，直接用于PCR检测，避免了污染发生。(2)试剂盒带有内标物质，可以用于对核酸提取和PCR扩增的整个过程进行监控，从而减少假阴性结果的出现。(3)使用热启动Taq酶，防止低温非特异性扩增，使得试剂盒的灵敏度提高。(4)相对传统的培养方法，通过实时荧光PCR方法可以快速检测样本中核酸DNA。
图I显示HSV-I强阳性质控品、HSV-I临界阳性质控品和阴性质控品的检测结果。HSV-I强阳性质控品、HSV-I临界阳性质控品FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型扩增曲线，且强阳性和临界阳性质控品的定值分别在I. OX 106-5. OXlO7c0Pies/ml和5. 0X 102-5. 0X 104copies/ml范围内，可明确判定为阳性。阴性质控品FAM检测通路扩增曲线无对数增长期，VIC检测通路扩增曲线为对数增长期；可明确判定为阴性，均符合质量控制判断标准。图2显示HSV-I RNA特异性的检测结果。10份特异性参考品的扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。特异性样本包括单纯疱疹病毒2型(HSV-2)，水痘-带状疱疹病毒(VZV)，人巨细胞病毒(CMV)，EB病毒等其他病原微生物标本。图3显示线性灵敏度参考品的检测结果。线性灵敏度参考品共6份，标号分别为L1-L6，将HSV-I病毒液提取核酸后测定OD值标定其拷贝数，将已标定的HSV-I病毒液依次稀释至 IX 107copies/ml、I X 106copies/ml、I X 105copies/ml、I X 104copies/ml、lX103copies/ml、2. 5X 102copies/ml作为线性参考品，编号L1-L6。以制备的L1-L6为待检样本进行重复检测2次。图4显示10份HSV-I阳性患者样本的检测结果。10个标本检测结果显示扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。
具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例I :单纯疱疹病毒I型试剂盒的检测方法(I)标本采集、运送和保存标本采集I.脱离细胞I. I疱疹溃疡部位刮片用刮片刮取溃疡病灶处脱落细胞，置入无菌玻璃管，密闭送检。I. 2男性生殖泌尿道分泌物棉拭子用细小棉拭子伸入尿道约2 4厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检(采集分泌物前2小时禁小便)。I. 3女性生殖道分泌物棉拭子用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒钟后旋动棉拭子采集宫颈分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。I. 4女性尿道分泌物棉拭子用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。2.脑脊液按常规标准方法抽取脑脊液O. 5-lml，加入无菌离心管，密闭送检。标本保存和运送所采集的标本可立即用于测试或长期保存于_70°C，-20°C保存期为6个月，标本应避免反复冻融。标本运送采用0°C冰壶。(2)核酸提取将待测样本与阴性质控品、HSV-I强阳性质控品、HSV-I临界阳性质控品进行同步处理。a).在I. 5ml的无菌离心管内加入50 μ I的蛋白酶K ;b).取样本200 μ I加入离心管中；c).再加入200 μ I的裂解工作液(即已含Carrier RNA的病毒裂解液)，盖紧管盖，漩涡振荡15秒以充分混匀，高速离心10秒(防止温育时产生气泡)，72°C 10分钟。同时可将洗脱液置于72°C预热；d).再加入250 μ I无水乙醇，盖紧管盖，振荡15秒；e).将混合液全部吸至离心柱，室温下12，OOOrpm离心I分钟，将离心柱装至新的
收集管；f).将500 μ I的抑制物去除液加入离心柱，室温下12，OOOrpm离心I分钟，将离心
柱装至新的收集管；
g).将500 μ I的去离子液加入离心柱，室温下12，OOOrpm离心I分钟，将离心柱装
至新的收集管；
h).再次将500 μ I的去离子液加入离心柱，室温下12，OOOrpm离心I分钟，将离心
柱装至新的收集管；i).将离心柱-收集管于室温下14，OOOrpm离心3分钟以除去残余的乙醇；j).将离心柱取出，放置于新的I. 5ml离心管。打开离心柱盖子，72°C放置2分钟(使用干式恒温器，不能使用水浴锅)；k).在离心柱的膜的正上方小心加入72°C预热的洗脱液50 μ 1，盖紧离心柱管盖，室温静置I分钟后，14，OOOrpm离心I分钟。离心管内即为病毒核酸溶液,建议立即使用，如需保存，置于_20°C。(3) PCR 检测a)配制体系将27 μ I HSV-I反应液Α，3 μ I HSV-1反应液B，充分混合，然后分装30 μ I至每个PCR反应管。b)加样往上述HSV-I反应管中分别加入提取后的待测样本核酸、阴性质控品、强阳性质控品核酸和临界阳性质控品核酸20 μ I和直接加入离心备用的HSV-I阳性定量参考品20 μ I。盖紧管盖，8，OOOrpm离心数秒后转移至PCR扩增仪。c)扩增程序设置ABI7300/7500荧光PCR扩增仪的参数设置如下Reporter Dyel FAMQuencher Dye noneReporter Dye2 VICQuencher Dye nonePassive Reference noneLightCycler480荧光PCR扩增仪的参数设置如下“Customizes”�？橹醒≡� FAM(483-533)和 VIC(523-568)滤片组合， 扩增温度参数统一设置如下50 0C 15 分钟； 95 0C 15 分钟；40个循环(94°C 15秒一55°C 45秒)，荧光检测选择在55°C 45秒这一环节；保存文件，运行。⑷结果分析反应结束后自动保存结果,根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3 15、End值可设在5 20，在Log图谱窗口设置Threshold的Value值，使基线位于扩增曲线指数期，调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis自动获得分析结果，在Iteport界面察看结果，记录未知样本数值(C)。(5)结果判定如果FAM检测通道无对数增长期，且在VIC检测通道有对数增长期，则判样品为莖纯疱疹病毒I型阴件。
如果FAM，VIC检测通道均有对数增长期且FAM检测通道Ct值彡40 ;或FAM检测通道有对数增长期且Ct值< 40，VIC检测通道无对数增长期，则判样品为单纯疱疹病毒I型阳性。 实施例2 :单纯疱疹病毒I型试剂盒中质控品的使用单纯疱疹病毒I型试剂盒中质控品包括HSV-I强阳性质控品，HSV-I临界阳性质控品，阴性质控品，用于临床试验中质量控制，操作方法同待检样本。阴性质控品FAM检测通路扩增曲线无对数增长期，VIC检测通路扩增曲线为对数增长期；强界阳性质控品FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，且FAM检测通道扩增曲线Ct值< 33 ；临界阳性质控品FAM检测通道扩增曲线有明显对数增长期，且FAM检测通道扩增曲线Ct值< 37 ；以上要求须在同一次实验中同时满足，否则，本次实验视作无效，需重新进行。检测结果(见附图I):阴性质控品的扩增曲线不呈S型，阳性质控品的扩增曲线为明显S型曲线，阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求，因此待检标本的检测结果是有效的。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种荧光PCR检测单纯疱疹病毒I型的试剂盒，试剂盒包括(1)核酸提取试剂、HSV-I反应液A、HSV-I反应液B、HSV-1内标溶液、阴性质控品、HSV-I强阳性质控品、HSV-I临界阳性质控品，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR反应体系包括HSV-I反应液A和HSV-I反应液B，其特征在于HSV-I反应液A中用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物分别是5’-TTATCCCATTCCTTTTGGTTCTT-3’ (SEQ ID NO:I)5’ -GGGTCATGTTGGGGGCTT-3’ (SEQ ID NO 2) 用于靶多核苷酸扩增的寡核苷酸探针是5’-X-TGGGGTTGGGTGGTGGAGGAGA-Y-3’ (SEQ IDNO :3)，其中X/Y表示荧光标记基团，包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针； 用于内标多核苷酸扩增的寡核苷酸探针是5’-X-CCTGCTCTGACTCTGACCATCCCTG-Y-3’ (SEQ ID NO :4)，其中X/Y表示荧光标记基团，包括能够与内标多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。
2.根据权利要求I的试剂盒，其特征还在于正、反向引物的浓度均为IOpmol/人份，目的寡核苷酸探针、内标寡核苷酸探针的浓度均为5pmol/人份。
3.根据权利要求I的试剂盒，其特征还在于HSV-I反应液B由热启动Taq酶、dNTPs、酶稀释液组成，其中热启动Taq酶用量为3 7U/人份、dNTPs浓度为O. 20mmol/L，酶稀释液为一般市售的酶稀释液。
4.根据权利要求I的试剂盒，HSV-I反应液A包括PCR反应缓冲液，其中PCR反应缓冲液包含 10mmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 8)、50mmol/L KC1、3. Ommol/L MgCl20
5.根据权利要求I的试剂盒，其特征还在于PCR扩增的最佳反应温度和时间为950C 15min, I个循环；最后94°C 15s，55°C 45s, 40个循环(收集荧光信号)。
全文摘要
本发明涉及-种荧光PCR检测单纯疱疹病毒I型的试剂盒，特别是涉及以实时荧光聚合酶链反应技术快速、定性检测单纯疱疹病毒I型感染的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对样本中单纯疱疹病毒I型核酸DNA进行定性检测，适用于单纯疱疹病毒I型感染的辅助诊断，抗病毒治疗的疗效监测和流行病学研究。
文档编号G01N21/64GK102618665SQ20121001438
公开日2012年8月1日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者丁渭, 李明, 陈华云 申请人:中山大学达安基因股份有限公司
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