专利名称：基于时间分辨化学发光的多元免疫分析方法
技术领域：
本发明涉及化学发光免疫分析领域，特别涉及基于时间分辨化学发光的多元免疫分析方法。
背景技术：
化学发光免疫分析法(CLIA)是将化学发光分析与免疫反应结合起来建立的方法，它既具有化学发光分析的高灵敏度，又具有免疫分析的高特异性。早在1977年，Halman等就创建了 CLIA，并用于检测抗原或抗体。由于CLIA具有灵敏度高、检测范围宽、操作简便、检测迅速，并且容易实现自动化检测，替代了放射性同位素，避免了放射性污染等优势，在临床诊断、环境检测、食品安全等领域得到了日益广泛的应用。随着免疫分析技术的高速发展，对单一组分的检测往往不能满足对复杂生物样品检测的实际需要，多组分免疫分析的出现引起了人们的广泛关注。目前，已有的多组分免疫分析方法主要可归为两大类阵列模式和多标记物模式。阵列模式通常是在免疫反应器的不同阵列区域来实现多个组分的同时检测，如采用阵列芯片或传感器阵列。该方法需要复杂的仪器做支撑，并且通常需采用昂贵的阵列型检测器，如C⑶和多通道电化学工作站。多标记物模式是另一种常见的多组分免疫分析模式，其基本原理是以不同的信号探针标记不同组分，通过识别不同探针的信号来检测不同组分如在光谱法中以波长识别，电化学法中以电位识别，质谱法中以荷质比识别，放射法中以射线能量识别。时间分辨突光多组分免疫分析是一种典型的基于多标记物模式的技术，该技术米用具有不同荧光寿命的稀土金属配合物作为探针，分别标记不同组分，然后通过荧光寿命的差异在不同时间窗口实现不同组分的检测。由于荧光寿命短，利用时间分辨荧光需要精密的荧光寿命测量系统，价格昂贵。化学发光反应中存在着类似现象，很多化学发光反应有着截然不同的动力学特征有的是闪光型化学发光反应，即信号迅速达到峰值，之后迅速衰减，发光时间很短，只有零点几秒到几秒；有的是辉光型化学发光反应，即发光试剂混合时初始发光信号极低，但随着时间延长发光信号逐渐增强，发光时间从几分钟到几十分钟，或几小时至更久；有的还是震荡反应，即随时间变化，化学发光信号发生周期性增强和衰减。但是，目前尚未见到有报道将这种现象用于化学发光免疫分析，以实现多种组分的免疫测定。
发明内容
本发明的目的之一在于提供基于时间分辨化学发光的多元免疫分析方法，以实现通过时间分辨化学发光的多组分。为实现上述发明目的，技术方案为
基于时间分辨化学发光的多元免疫分析方法，包括如下步骤
(I)用化学发光反应动力学性质不同的化学发光标记物分别标记不同的抗原或抗体，然后与待测物同时加入包被有相应抗体或抗原的酶标板反应孔中进行免疫反应； (2)向所述反应孔中加入引发化学发光的共反应剂，然后在不同时间窗口分别检测不同的化学发光信号。本发明中，由于不同的化学发光标记物具有不同的化学发光反应动力学性质，因此加入共反应剂后在不同的时间窗口呈现出不同组分的光信号。优选的，所述步骤(I)是用闪光型化学发光标记物和辉光型化学发光标记物分别标记不同的抗原或抗体，然后与待测物同时加入包被有相应抗体或抗原的酶标板反应孔中进行免疫反应。优选的，所述步骤(I)是用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶分别标记克伦特罗和莱克多巴胺，然后与克伦特罗和莱克多巴胺同时加入到包被有克伦特罗抗体和莱克多巴胺抗体的酶标板反应孔中进行免疫反应。优选的，所述包被的具体方法为将克伦特罗抗体和莱克多巴胺抗体溶解于O. 10M pH 8.0 Tris-HCl缓冲液中至克伦特罗抗体浓度为8. O Pg/mL，莱克多巴胺抗体的浓度为10.0 Pg/mL，混匀，得包被液；然后将包被液加入到聚苯乙烯酶标板，然后置于4 °C条件下包被过夜，倒去孔中未结合的抗体溶液，然后每孔用洗液清洗，再向每个孔中加入封闭缓冲液，在37 °C下封闭1. 5小时，将酶标板用洗液清洗3次。优选的，所述共反应剂含有鲁米诺，对碘苯酚，H2O2和碱性磷酸酶底物液。优选的，所述共反应剂含有1. OXlO-4 M的鲁米诺、5. OXlO-6 M的对碘苯酚、IOmM的H2O2和25 mM的碱性磷酸酶底物液。更优选的，所述共反应剂的加入方式为先加入鲁米诺和对碘苯酚，再加入H2O2与ALP底物液的混合物，所述H2O2与碱性磷酸酶底物液体积比为1:1。优选的，所述共反应剂的pH值为9. O。本发明中闪光型化学发光标记物的发光时间很短，只有零点几秒到几秒；辉光型又称持续型，发光时间从几分钟到几十分钟，或几小时至更久。本发明的有益效果本发明公开的基于时间分辨化学发光的多元免疫分析方法，与传统的多标记物模式的分光光度法和常规荧光法相比，无需采用分光系统以分辨不同组分所发出不同波长的光信号；与时间分辨荧光法相比，化学发光法的时间窗口更宽前者的时间窗口在毫秒级，而后者的时间窗口从秒级到小时级不等，因此为发光信号的时间分辨提供了更为便利的条件，无需采用复杂的荧光寿命测量系统，如基于时间相关单光子计数技术的精密测量系统，只需用秒表、时钟等最为常见的计时工具分辨信号；与采用阵列模式的多组分免疫分析法相比，仪器化程度低，操作简便，只需常规的化学发光分析仪即可，无需其常用的复杂仪器设备以及昂贵的阵列型检测器，因而成本较低。
图1为本发明的基于时间分辨的化学发光免疫分析方法的示意图。图2为本发明检测克伦特罗和莱克多巴胺的工作曲线。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1
结合附图1对基于时间分辨化学发光的多元免疫分析法做进一步详细的说明。在实施例中，以克伦特罗(CLE)和莱克多巴胺(RAC)作为模型分析物，辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)作为化学发光标记物分别标记CLE和RAC，采用基于时间分辨化学发光的多元免疫分析法来检测不同的“瘦肉精”类物质。本发明采用竞争免疫模式，具体免疫分析步骤如下
首先将CLE抗体和RAC抗体溶解于O. 10 M pH 8. O Tris-HCl缓冲液中混合后作为包被液，至CLE抗体浓度为8. O Pg/mL，RAC抗体的浓度为10. O Pg/mL，然后将包被液加入到高亲和力的聚苯乙烯96孔酶标板，每孔加入100 UL包被液，然后置于4 °C条件下包被过夜，倒去孔中未结合的抗体溶液，然后每孔用300 μ L的洗液(含体积分数为O. 05%吐温20的Tris-HCl缓冲溶液)清洗3次，再向每个孔中加入150 μ L的封闭缓冲液(SuperBlOck T20， Thermo Fisher Scientific Inc.)在37 °C下封闭1. 5小时,将酶标板用洗液清洗3次；然后，在每个孔中依次加入80 μ L含有不同浓度的CLE和RAC的样品溶液，同时加入含有HRP标记的CLE抗原(10 Pg/mL)和ALP标记的RAC抗原(20 Pg/mL)各10 μ L，继续在37 °〇下孵育1. 5 h，使其充分地发生竞争性免疫结合。孵育结束后清洗酶标板，待进一步检测。在化学发光检测过程中，通过注入共反应剂同时触发两个化学发光反应。共反应剂包括鲁米诺，对碘苯酚，H2O2和ALP底物液。加入方式为先每孔分别加入40 μ L浓度为1.OX 10_4 M的鲁米诺和20 μ L浓度为5. OX 10_6 M的对碘苯酚，然后将触发两个化学发光反应的触发剂10 mM的H2O2与25 mM的ALP底物液按1:1的比例混合，取30 μ 立即注入到待检测的微孔中触发反应，通过光电倍增管收集化学发光信号，光电倍增管的工作电压设置为-800 V，分别在O. 6 s和25 min的两个时间窗口处检测CLE和RAC的化学发光信号。本发明所述的检测过程中，共反应剂的pH值最佳为9.0。对于共反应剂以Tris-HCl为共同的缓冲液体系更为兼容。对碘苯酚作为增强剂，其浓度过大会影响HRP催化的鲁米诺-H2O2的动力学特征，使反应时间延长，故优选为5. OX 10_6 M。在上述实验方法和条件下,测定了浓度为I ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL的CLE标准溶液和RAC标准溶液，结果如图2所示。由检测结果可知，CLE和RAC在1. 0-500 ng/mL范围内化学发光峰高呈良好的线性关系，其相关系数(R2)分别为O. 9985 和 O. 9913，检测限(S/N=2)都为 O. 50 ng/mL。本实施例中利用了 HRP催化的鲁米诺-H2O2反应在一定浓度的增强剂对碘苯酚的作用下在O. 6s即达到发光峰值，之后迅速衰减，呈现出闪光型化学发光信号；而ALP催化的金刚烷二氧丁环磷酸盐水解反应初始发光极低，随着时间延长发光信号增强，整个发光过程可持续增强数小时，呈现辉光型化学发光信号。由于两者的发光动力学特征差异较大，这就为以时间分辨法识别不同组分提供了可能途径。在本实施例闪光型-辉光型化学发光组合研究中，将两个体系进行配对组合，结果显示，呈现出时间分辨化学发光的现象，两者兼容性较好，相互干扰性较小。为了进一步评估本发明所述方法的可行性，对其交叉干扰性进行了研究。检测时，在待检测样品中只加入一种分析物CLE (100 ng/mL)或RAC (100 ng/mL)，然后进行检测。同时，对空白样品进行检测作为对照实验。检测结果当检测只含有CLE的样品时，由于CLE与其抗体的竞争免疫反应，与对照实验相比，窗口 I的信号明显降低，窗口 2的信号基本不变。同样的，当检测只含有RAC的样品时，由于RAC与其抗体的竞争免疫反应，与对照实验相比，窗口 2的信号明显降低，而窗口 I的信号基本不变。由此表明，其交叉干扰性可有效地避免。实施例2
以猪尿为样品，将猪尿用Tris-HCl缓冲液(pH7. O)稀释5倍，分别加入CLE和RAC，至CLE和RAC的浓度都为10 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL。在包被CLE抗体和RAC抗体的酶标板上封闭并清洗，然后每孔分别加入80 μ L含CLE和RAC的猪尿稀释液，同时加入含有HRP标记的CLE抗原(10 Pg/mL)和ALP标记的RAC抗原(20 Pg/mL)各10 μ L，在37 V下孵育1. 5 h，使其发生竞争性免疫反应。孵育结束后再清洗酶标板。在上述优化的反应条件下触发化学发光反应，分别在O. 6 s和25 min的两个时间窗口处检测CLE和RAC的化学发光信号，检测结果如表I所示 表1.空白猪尿样品中克伦特罗和莱克多巴胺的加标回收率
I i￥i I克伦特罗I莱克多巴胺
I 样品 I 2I I I3
I 加_重(ng.mL) ' 10 一 I ^100 + 10 ' 50100 —
IIj:
+检出重(ng.mL) . 8.6 —— 54.7 104.4 —「11—2 技1 . 88.7 —
RSD (%) ' 7.6 —— 6J5J ' 7.2 . 6.53J
■回收率—( ) ' 86109104 j 11290 —「38 —
I_1..1I_
由表I可知，利用本发明的方法测得CLE和RAC的加标回收率分别为86-104%和88-112%，两者的标准偏差均低于7. 6%。本发明中，也可以用吖啶酯-H2O2与ALP-金刚烷二氧丁环磷酸盐体系组合进行检测，吖啶酯-H2O2化学发光反应为典型的闪光型发光，在O. 4秒时达到峰值，反应条件较为简单，在H2O2的稀碱性溶液中即能发光。因此，能够与ALP-金刚烷二氧丁环磷酸盐体系组合并呈现出良好的化学发光时间分辨现象。将吖啶酯和ALP各10 Ul混合于待检测的反应孔中，其浓度分别为5 X 10_9 M和O. 05 Pg/mL，将含有O. 06%H202的碱性缓冲液20 ul与25 mM的ALP底物液20 ul混合之后，立即加入到待检测的反应孔中触发反应，通过光电倍增管检测化学发光信号，在第一个时间窗口 O. 4秒处出现第一个信号值，随着时间延长，第二个信号的化学发光强度逐渐增强，可选择15 min作为第二个时间窗口读取信号。应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.基于时间分辨化学发光的多元免疫分析方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)用化学发光反应动力学性质不同的化学发光标记物分别标记不同的抗原或抗体，然后与待测物同时加入包被有相应抗体或抗原的酶标板反应孔中进行免疫反应； (2)向所述反应孔中加入引发化学发光的共反应剂，然后在不同时间窗口分别检测不同的化学发光信号。
2.根据权利要求1所述基于时间分辨化学发光的多元免疫分析方法，其特征在于所述步骤(I)是用闪光型化学发光标记物和辉光型化学发光标记物分别标记不同的抗原或抗体，然后与待测物同时加入包被有相应抗体或抗原的酶标板反应孔中进行免疫反应。
3.根据权利要求1所述基于时间分辨化学发光的多元免疫分析方法，其特征在于所述步骤(I)是用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶分别标记克伦特罗和莱克多巴胺，然后与克伦特罗和莱克多巴胺同时加入到包被有克伦特罗抗体和莱克多巴胺抗体的酶标板反应孔中进行免疫反应。
4.根据权利要求3所述基于时间分辨化学发光的多元免疫分析方法，其特征在于所述包被的具体方法为将克伦特罗抗体和莱克多巴胺抗体溶解于O. 10 M pH 8.0 Tris-HCl缓冲液中至克伦特罗抗体浓度为8. O Pg/mL，莱克多巴胺抗体的浓度为10.0 Pg/mL，混匀，得包被液；然后将包被液加入到聚苯乙烯酶标板，然后置于4°C条件下包被过夜，倒去孔中未结合的抗体溶液，然后每孔用洗液清洗，再向每个孔中加入封闭缓冲液，在37 °C下封闭1.5小时，将酶标板用洗液清洗3次。
5.根据权利要求1-4任一项所述基于时间分辨化学发光的多元免疫分析方法，其特征在于所述共反应剂含有鲁米诺，对碘苯酚，H2O2和ALP底物液。
6.根据权利要求5所述基于时间分辨化学发光的多兀免疫分析方法,其特征在于所述共反应剂含有1. 0Χ1(Γ4 M的鲁米诺、5. 0Χ1(Γ6 M的对碘苯酚、IOmM的H2O2和25 mM的碱性磷酸酶底物液。
7.根据权利要求6所述基于时间分辨化学发光的多兀免疫分析方法,其特征在于所述共反应剂的加入方式为先加入鲁米诺和对碘苯酚，再加入H2O2与碱性磷酸酶底物液的混合物，所述H2O2与碱性磷酸酶底物液体积比为1:1。
8.根据权利要求5所述基于时间分辨化学发光的多兀免疫分析方法,其特征在于所述共反应剂的pH值为9.0。
全文摘要
本发明公开了基于时间分辨化学发光的多元免疫分析方法，包括以下步骤，用化学发光反应动力学性质不同的化学发光标记物分别标记不同的抗原或抗体，然后与待测物同时加入包被有相应抗体或抗原的酶标板反应孔中进行免疫反应；再向所述反应孔中加入引发化学发光的共反应剂，最后在不同时间窗口分别检测不同的化学发光信号；利用该方法，通过时间分辨在不同的时间窗口分别检测不同组分的化学发光信号，以实现不同组分的免疫分析，无需使用精密的荧光寿命测量系统，只需采用常规化学发光分析仪和普通计时工具即可完成多组分的检测。
文档编号G01N33/558GK103018441SQ20121058915
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者付志锋, 韩静, 高鸿飞 申请人:西南大学
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