专利名称：水相凝胶渗透色谱法检测交联透明质酸体外酶解的方法
技术领域：
本发明涉及一种水相凝胶渗透色谱法检测交联透明质酸体外酸酶的方法，特别是通过检测透明质酸酶解后的分子量变化来确定交联透明质酸是否酶解完全。
背景技术：
开发能应用与临床的皮肤填充剂，就必须对透明质酸进行一系列的化学修饰和处理过程。如果采用非交联的透明质酸作为皮肤填充剂，那么，在皮肤中天然存在的透明质酸酶与自由基就会一个一个的切断聚合起来的透明质酸分子，快速降解非交联的透明质酸。 结果使得透明质酸在组织内的半衰期只有一天到两天，然后经过水的稀释，在肝脏内逐步降解为水和二氧化碳。这样，产品在注射的部位就会很快的失去效用(在一周内)，结果使得非交联的透明质酸在皮肤中的滞留时间受到了很大的限制。因此，非交联的透明质酸起不到一个作为皮肤填充剂应该起到的疗效。所以，采用1，2，7，8_ 二环氧辛烷作为透明质酸的交联剂，将透明质酸的羟基和羧基都交联起来，提高了透明质酸分子的稳定性，有效地防止了透明质酸酶和自由基对透明质酸的降解作用，可明显地提高透明质酸在皮肤内的停留时间，具有量好的作为皮肤填充剂应有的疗效。
因为交联透明质酸在体内的降解的主要因素就是透明质酸酶(hyaluronidase， HAase)，所以，透明质酸的体外酶解实验就可以从一个侧面验证透明质酸在体内的停留时间。通常的酶解方法都是称取一定质量的交联透明质酸凝胶，在37°C下，加入一定量的透明质酸酶，在一段时间后，通过测量酶解前后的质量差，或者通过咔唑法测定酶解后葡萄糖醛酸的含量来确定透明质酸的酶解程度。但是，此种方法选用的都是成为一个整体的大块状的交联透明质酸凝胶，若交联透明质酸被粉碎为微小颗粒并作为产品之后，再用此种方法去检测产品的酶解程度就会具有很大的局限性，因为微小的颗粒会影响检测结果，并造成不小的误差。发明内容
本发明的目的在于提供一种水相凝胶渗透色谱法检测交联透明质酸体外酸酶的方法。采用水相凝胶渗透色谱法(GPC)检测交联透明质酸体外透明质酸酶的酶解程度，通过检测透明质酸酶解后的分子量变化来确定交联透明质酸是否酶解完全。本发明方法简单，容易操作，成本低廉，安全可靠。
本发明提供的一种水相凝胶渗透色谱法检测交联透明质酸体外酸酶的方法包括如下步骤
1)取ImL微小颗粒状的交联透明质酸产品于比色管中，加入300单位的透明质酸酶，用水稀释至2mL，于37°C恒温水浴振荡器中，从稀释后开始计时，从第二十分钟开始，每二十分钟用微量注射器取50 μ L上清液，取出的上清液置于冰箱迅速冷却至5°C ；
2)取3-5小时之内的酶解上清液，分别用水相凝胶渗透色谱(GPC)检测不同时段的上清液分子量，当分子量趋于常数时，则可确定该产品酶解完成。
具体色谱条件与试剂色谱条件色谱柱Waters Part No. WA Toll545 7. 8X300mm Ultrahydrogel 250流动相去离子水；泵Waters 1515 Isocratic HPLC Pump ；^llJWaters 2414 Refractive Index Detector ；柱流量1. OmL/min ；柱温35°C;进样口温度180°C;检测器温度300°C;进样量50 100μ L ；内部加热37°C;柱压IOOOpsi，不高于 2500psi ；pH 范围2 12;有机相< 20 % ；盐浓度< 800mM ；分子量范围:1000< Mn < 6X106 ；柱体积6 12mL ；流动相改变值< 0. 3mL/min。交联透明质酸是用1，2，7，8_ 二环氧辛烷作为透明质酸的交联剂，季铵碱作为碱催化剂与相转移催化剂合成。本发明通过采用水相凝胶渗透色谱仪(GPC)检测透明质酸凝胶微小颗粒的酶解上清液的分子量变化来确定交联透明质酸的酶解程度。其原理在于，透明质酸颗粒被降解后，其被降解的片段会溶解进入上清液，酶解的时间越长，溶入上清液的片段分子量就会越�。鄙锨逡旱姆肿恿壳饔谝桓銎胶獠槐涞某Ｊ保涂扇衔该髦仕嵋丫附馔耆�。本发明所介绍的方法在测量手段上更加简单，所得到的数据也更加直观的展现了交联透明质酸的整个酶解过程。
图1为本发明中的透明质酸分子量与时间关系图。
具体实施例方式实施例1 透明质酸凝胶的制备将0. 5g氢氧化钠溶解于20ml水中，加入5g透明质酸钠(山东福瑞达生物技术有限公司出品)，搅拌12-14h，搅拌至透明质酸钠完全溶解后，再向反应体系中加入5g 1,2, 7，8_ 二环氧辛烷(DEO)，迅速搅拌均勻，在25°C下反应M小时。反应用2mol/L盐酸终止， 调至pH = 5左右，同时在40°C，13. 3Kpa的真空度条件下蒸馏去除反应体系中的水，当蒸馏出的水达到50mL时停止减压蒸馏。分3次用200mL pH = 8-9的含30%乙醇的氢氧化钠溶液浸泡，中和凝胶的盐酸。将中和后的凝胶转入真空干燥箱中，于60°C，40Kpa的条件下干燥IOh使凝胶固化定型，凝胶吸水率为45倍。所得凝胶在90°C，13. 3Kpa真空干燥至衡重， 得交联透明质酸微颗粒。得到的微颗粒经显微镜观察，其粒径范围为100-200 μ m。
实施例2
交联透明质酸微颗粒的酶解实验与同步水相凝胶渗透色谱的分子量检测
取由实施例1中制备的微小颗粒状的交联透明质酸ImL于比色管中，加入300单位的透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)，用水稀释至2mL，于37°C恒温水浴振荡器中，从稀释后开始计时，从第二十分钟开始，每二十分钟用微量注射器取50 μ L上清液，取出的上清液置于冰水浴中迅速冷却至5°C以下，以抑制透明质酸酶的活性。取4小时之内的酶解上清液，分别用水相凝胶渗透色谱(GPC)检测不同时段的上清液分子量，当分子量趋于常数时，则可确定该产品酶解完成。如图所示，该产品在160分钟左右时酶解完成。具体色谱条件与试剂
色谱柱Waters Part No. WA Tol 15457. 8 X 300mm Ultrahydrogel 250
流动相去离子水；
泵Waters 1515 Isocratic HPLC Pump ；
检测器:ffaters 2414 Refractive Index Detector ；
柱流量1.OmL/min ；
柱温35°C；
进样口温度180°C;
检测器温度300°C ；
进样量50yL;
内部加热37°C ；
柱压IOOOpsi，不高于 2500psi ；
pH 范围2 12;
有机相< 20 % ；盐浓度< 800mM ；
分子量范围1000< Mn < 6X IO6 ；
柱体积6 12mL ；
流动相改变值< 0. 3mL/min。
权利要求
1.一种水相凝胶渗透色谱法检测交联透明质酸体外酸酶的方法，其特征在于它包括如下步骤1)取ImL微小颗粒状的交联透明质酸产品于比色管中，加入300单位的透明质酸酶，用水稀释至2mL，于37°C恒温水浴振荡器中，从稀释后开始计时，从第二十分钟开始，每二十分钟用微量注射器取50 μ L上清液，取出的上清液置于冰箱迅速冷却至5°C ；2)取3-5小时之内的酶解上清液，分别用水相凝胶渗透色谱(GPC)检测不同时段的上清液分子量，当分子量趋于常数时，则可确定该产品酶解完成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的水相凝胶渗透色谱(GPC)检测的具体色谱条件与试剂色谱条件色谱柱Waters Part No. WA Toll545 7. 8X300mm Ultrahydrogel 250 流动相去离子水；M :Waters 1515 Isocratic HPLC Pump ；检测器:ffaters 2414 Refractive Index Detector ；柱流量:1. OmL/min ；柱温:35°C ；进样口温度180°C ；检测器温度300°C ；进样量50 ΙΟΟμ L ；内部加热37°C ；柱压:1000psi，不高于 2500psi ；pH范围2 12 ；有机相< 20% ；盐浓度< 800mM ；分子量范围1000 < Mn < 6X106 ；柱体积6 12mL ；流动相改变值< 0. 3mL/min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的交联透明质酸是用1，2，7，8-二环氧辛烷作为透明质酸的交联剂合成。
全文摘要
本发明涉及一种水相凝胶渗透色谱法检测交联透明质酸体外酸酶的方法。通过检测透明质酸酶解后的分子量变化来确定交联透明质酸是否酶解完全。取1mL微小颗粒状的交联透明质酸产品于比色管中，加入300单位的透明质酸酶，用水稀释至一倍体积，于37℃恒温水浴振荡器中，从稀释后开始计时，从第二十分钟开始，每二十分钟用微量注射器取50μL上清液，取出的上清液置于冰箱迅速冷却至5℃；取3-5小时的酶解上清液，分别用水相凝胶渗透色谱(GPC)检测不同时段的上清液分子量，当分子量趋于常数时，则可确定该产品酶解完成；本发明方法简单，容易操作，成本低廉，安全可靠。
文档编号G01N30/02GK102495154SQ20111039262
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月1日 优先权日2011年12月1日
发明者李睿智, 简军 申请人:北京爱美客生物科技有限公司
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