5’-核苷酸酶诊断试剂盒及5’-核苷酸酶活性浓度测定方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：5’-核苷酸酶诊断试剂盒及5’-核苷酸酶活性浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种5'-核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5，-核苷酸酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
L矢学研究表明，5'-核苷酸酶(5NT)增高主要见于阻塞性黄胆，也可见于肝癌和肝炎。在胆汁淤积并发胆管炎、原发性和继发性胆汁性肝硬化和慢性肝炎时，5NT升高率高于碱性磷酸酶；肝肿瘤和肝肉芽肿时5NT升高的敏感性高于碱性磷酸酶。因为5'-核苷酸酶活性无生理性升高，对于诊断婴幼儿肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性磷酸酶不但敏感，而且有特异性。因此测定5'-核苷酸酶的活性对于疾病的诊断具有重要意义。
5'-核苷酸酶的活性测定方法很多，主要有同位素底物法、化学强酸测磷法(1925年)。据申请人了解，目前国际上普遍采用同位素底物测试法，方法为5'-核苷酸酶作用于H3-dUMP，终止反应后，通过离子交换层析柱分析结果，求得5'-核苷酸酶活性。或者利用5'-核苷酸酶作用于单磷酸腺苷后产生无机磷，再用化学强酸法分析无机磷含量得以计算出5'-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法复杂还有同位素污染，而且需要同位素测定仪，因此难以切实推广应用。无机磷测定法是1925年发明的方法，准确度不好，强酸污染环境等等，也不适合推广应用。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定5'-核苷酸酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的 5'-核苷酸酶诊断试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行5，-核苷酸酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明5'-核苷酸酶活性浓度测定方法原理如下
核苷单磷酸+水5核苷酸酶核苷+磷酸根
磷酸根+谷氨酰胺+腺苷二磷酸谷氨酰胺合成酶氨离子
+谷氨酸+腺苷三磷酸氨离子+丙酮酸+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶L-丙氨酸+
水+辅酶
核苷单磷酸可以是腺苷单磷酸、肌苷单磷酸、尿苷单磷酸等
这种方法应用5，-核苷酸酶(5'-Nucleotidase; EC3丄3.5)酶(偶)联谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3.1.2)、丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase; EC1.4丄1)酶促反应连续监测法。5，-核苷酸酶酶解核苷单磷酸反应产生磷酸根，再通过(偶)联合谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm 处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算5'-核苷酸酶的活性浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明5，-核苷酸酶诊断试剂较为理想
缓冲液100 mmol/L
稳定剂500 mmol/L
还原型辅酶0.25 mmol/L
谷氨酰胺合成酶10000U/L
丙氨酸脱氢酶12000 U/L
核苷单磷酸8 mmol/L
谷氨酰胺12 mmol/L
腺苷二磷酸12 mmol/L
丙酮酸8 mmol/L
本发明的5'-核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸。试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶。还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是
干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二
磷酸、丙酮酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶。试剂3
缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶。还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，
直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定5，-核苷酸酶活性浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
本实施例的5'-核苷酸酶诊断试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂500 mmol/L
还原型辅酶0.25 mmol/L
谷氨酰胺合成酶6000 U/L
丙氨酸脱氢酶10000 U/L
核苷单磷酸8 mmol/L
谷氨酰胺12 mmol/L
腺苷二磷酸12 mmol/L
丙酮酸8 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8士0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测5，-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一4180。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5，-核苷酸酶的活性浓度大小。
本实施例的5'-核苷酸酶诊断试剂为双试剂，包括试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50 mmol/还原型辅酶核苷单磷酸谷氨酰胺腺苷二磷酸
丙酮酸
0.25 mmol/L 8 mmol/L 12 mmol/L 12 mmol/L 8 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
谷氨酰胺合成酶
500 mmol/L
6000 U/L
10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测5，-核苷酸酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5，-核苷酸酶的活性浓度大小。实施例三
本实施例的5，-核苷酸酶诊断试剂为三试剂，包括试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
10稳定剂
还原型辅酶
核苷单磷酸
谷氨酰胺
腺苷二磷酸
丙酮酸
50 mmol/L 0.25 mmol/L
8 mmol/L 12 mmol/L 12 mmol/L
8 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
丙氨酸脱氢酶
500 mmol/L
10000 U/L
试剂
(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
谷氨酰胺合成酶
500 mmol/L
6000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。测定5'-核苷酸酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长
405nm，
;，-核苷酸酶样品与试剂i、试剂2、试剂3的体积比例为
4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5，-核苷酸酶的活性浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析
仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0015; 吸光度时间反应曲线应呈直线下降；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达300U/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±6%;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《3%;试剂的灵敏度可达0.0003 ± 0.00015 AA/min/U/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
权利要求
1. 一种利用酶比色法及酶联法技术的5’-核苷酸酶活性浓度测定方法，其方法原理如下核苷单磷酸+水 5核苷酸酶 核苷+磷酸根磷酸根+谷氨酰胺+腺苷二磷酸 谷氨酰胺合成酶 氨离子 +谷氨酸+腺苷三磷酸氨离子+丙酮酸+还原型辅酶 丙氨酸脱氢酶 L-丙氨酸+ 水+辅酶核苷单磷酸可以是腺苷单磷酸、肌苷单磷酸、尿苷单磷酸等将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5’-核苷酸酶的活性浓度大小结果。
2. —种5'-核苷酸酶诊断试剂盒，主要成分包括缓冲液 20-稳定剂还原型辅酶谷氨酰胺合成酶<formula>formula see original document page 0</formula>试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶组成。还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶组成。还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于还包括稳定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵 (Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的5’-核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5’-核苷酸酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、核苷单磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出5’-核苷酸酶的活性浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464292SQ20071019149
公开日2009年6月24日申请日期2007年12月19日优先权日2007年12月19日
发明者王尔中申请人:苏州艾杰生物科技有限公司

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5’-核苷酸酶诊断试剂盒及5’-核苷酸酶活性浓度测定方法