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专利名称：甘氨酸诊断/测定试剂盒及甘氨酸的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种甘氨酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定甘氨 酸浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
背景技术：
甘氨酸是一种重要的精细化工中间体，广泛应用于农药、医药、食品、 化肥、饲料等行业。根据甘氨酸的制备工艺和产品的纯度可分为食品级、 医药级、饲料级和工业级四种规格产品。
在20多种氨基酸中，甘氨酸是最简单的一种，它是组成蛋白质的一种 成分，为非人体必需氨基酸。《食品添加剂使用卫生标准》规定，甘氨酸 允许使用的范围为调味料和豆奶，最大使用量是lg/kg。国家质检总局曰 前进行的一项专项监督检查结果表明，国内部分乳饮料企业为提高产品中 蛋白质含量，在生产加工中违规使用价格低得多的甘氨酸代替奶粉，个别 企业问题严重。据业内人士介绍，使用甘氨酸替代奶粉，可以使产品成本 至少减少一半。人体若摄入甘氨酸的量过多，不仅不能被人体吸收利用， 而且会打破人体对氨基酸的吸收平衡而影响其它氨基酸的吸收，导致营养 失衡而影响健康。
目前各地方的检测标准均采用氨基氮测定法测定甘氨酸含量。较新的方 法，采用HPLC法(高效液相色谱柱后衍生法)测定其中的甘氨酸。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用双倍扩增法(Doubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及偶联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm 波长处吸光度的变化，得以测定甘氨酸浓度的方法，同时，本发明还将给 出用以实现该方法的甘氨酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外 /可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行甘氨酸浓度测定，而且测定 速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明甘氨酸浓度测定方法原理如下
甘氨酸+水+辅酶甘氨酸脱氢酶 乙醛酸+氨+
还原型辅酶+lT
肌苷单磷酸+氨+辅酶鸟苷单磷酸还原酶鸟苷单磷酸+
还原性辅酶
这种方法应用甘氨酸脱氢酶(glycine dehydrogenase; EC 1.4丄10)偶联 鸟苷单磷酸还原酶(GMP reductase; EC 1.7丄7)酶促反应速率比色法/终 点法。甘氨酸脱氢酶酶解甘氨酸反应产生氨，并同时将辅酶(在340nm处 没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，另外，再通 过偶联鸟苷单磷酸还原酶和氨的作用，第二次再将辅酶(在340nm处没有 吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以二倍测 定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸 光度上升的程度/速度，可以测算甘氨酸的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明甘氨酸诊断/测定试剂盒较为理想
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
甘氨酸脱氢酶 10000 U/L
鸟苷单磷酸还原酶 12000 U/L
肌苷单磷酸 8 mmol/L
本发明的甘氨酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、甘氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶、肌苷
单磷酸。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、肌苷单磷酸。试剂2
缓冲液、稳定剂、甘氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶。辅酶、甘氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶、肌苷单磷酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、肌苷单磷酸。试剂2
缓冲液、稳定剂、鸟苷单磷酸还原酶。试剂3
缓冲液、稳定剂、甘氨酸脱氢酶。辅酶、甘氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶、肌苷单磷酸在试剂l、试剂
2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是千粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定甘氨酸浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的甘氨酸诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
甘氨酸脱氢酶 10000 U/L
鸟苷单磷酸还原酶 12000 U/L
肌苷单磷酸 8 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光
度《0.1，测试主波长340nm,测试副波长405nm，被测甘氨酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出甘氨酸的浓度大小。实施例二
本实施例的甘氨酸诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
辅酶
肌苷单磷酸
100 mmol/L50 mmol/L3 mmol/L8 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 50 mmol/L
甘氨酸脱氢酶鸟苷单磷酸还原酶
10000U/L
12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。在全自动生化分析仪上设定温度37i:，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甘氨酸样品与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析
仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出甘氨酸的浓
度大小。
实施例三
本实施例的甘氨酸诊断/测定试剂为三试剂，包括试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 50 mmol/L
辅酶
肌苷单磷酸
3 mmol/L8 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂
鸟苷单磷酸还原酶
100 mmol/L500 mmol/L12000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 500 mmol/L
甘氨酸脱氢酶
10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定甘氨酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm,被测甘氨酸样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出甘氨酸的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析
仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0010;吸光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达1Ommol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±7%;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.1038士0.0450AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
权利要求
1. 一种双倍扩增法、酶比色法及酶联法的甘氨酸的浓度测定方法，其方法原理如下甘氨酸+水+辅酶 <u>甘氨酸脱氢酶</u> 乙醛酸+氨+ 还原型辅酶+H+肌苷单磷酸+氨+辅酶 <u>鸟苷单磷酸还原酶</u> 鸟苷单磷酸+还原性辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出甘氨酸的浓度大小测定结果。
2. —种甘氨酸诊断/测定试剂盒，主要成分包括:缓冲液稳定剂20-500 mmol/L-4000 mmol/L6 mmol/L甘氨酸脱氢酶鸟苷单磷酸还原酶肌苷单磷酸1000-80000 U/L1000-80000 U/L1- 50mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述甘氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、甘氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶、肌苷单磷酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述甘氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、甘氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶、肌苷单磷酸组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、肌苷单磷酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、甘氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶组成。辅酶、甘氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶、肌苷单磷酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述甘氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、甘氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶、肌苷单磷酸组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、肌苷单磷酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、鸟苷单磷酸还原酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、甘氨酸脱氢酶组成。辅酶、甘氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶、肌苷单磷酸在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述甘氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂l"OOO mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用双倍扩增法、酶比色法及酶联法技术的甘氨酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定甘氨酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、肌苷单磷酸、甘氨酸脱氢酶、鸟苷单磷酸还原酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出甘氨酸的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464272SQ20071019142
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司