一种定量检测土壤中晚疫病菌带菌量的试剂盒的制作方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：一种定量检测土壤中晚疫病菌带菌量的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量的试剂盒，试剂盒含特异引物和土壤DNA提取以及进行实时定量PCR相关的试剂，可以定量、特异检测土壤中马铃薯晚疫病病菌量，属农业生物技术领域。
背景技术：
马铃薯晚疫病是马铃薯的一种毁灭性病害，己列为世界粮食作物第一大病害。晚疫病在马铃薯种植区普遍发生，田间产量损失达20 % 50 %，窖藏损失可达5 % 30 %，大流行年份甚至会造成绝收。近年来，晚疫病的流行频率和流行程度逐渐加重，成为马铃薯生产的一个重要障碍。马铃薯是世界第四大粮食作物(Reader，2009)，世界马铃薯晚疫病造成的损失已达67亿美元(Haverkort et al. , 2008)中国已是世界上马铃薯生产的第一大国，中国每年因晚疫病损失高达10亿美元。马铃薯晚疫�。饕芍虏∫呙咕鷌/7/^iaas)引起。这种病菌主要以卵孢子和游动孢子的形式在土壤中的带病块茎，残根中过冬、越夏。在适宜的环境条件下，晚疫病菌产生孢子囊随气流传播侵染周围的植株。因而土壤只要含有一定数量病菌或种下极少数的带菌种薯，可能会导致整片地晚疫病的发生(Andrivon，1995 ； Zwankhui ζ en et al., 1998)。因此对种植马铃薯土壤晚疫病菌带菌量进行快速特异性检测，对晚疫病的发生与流行进行预测和防治尤为关键，也是跟踪马铃薯生长过程中晚疫病发生过程进而有效预防病害的主要措施(ZwanWiuizen et al. , 1998)。目前检测土壤和种薯晚疫病菌带菌量的主要方法和技术有①田间检测方法，此法通过观察马铃薯晚疫病引起的主要组织症状作为检测鉴定证据，只有马铃薯组织发生明显的症状时才能进行检测，准确性较差，耗时费力(GB7331-2003中5. 1. 1. 2)；②实验室检测方法，该法利用马铃薯主要致病菌的生理生化特点，通过显微镜、病原菌复苏培养及生化等手段来检测。准确性较田间检测方法高，但检测周期长，对于晚疫病的预防检测滞后 (GB6682)。③分子生物学方法(Judelson and Tooley, 2000; Niepold and Schober -Butin, 1995; Tooley., 1997; Trout et al. , 1997)，这些方法都是利用A ifl/esiafls 基因组DNA序列设计引物，来检测马铃薯叶片、块茎等A infestans的含量，如Niepold等设计引物检测接种晚疫病菌后的马铃薯块茎和叶片，但这种方法只能检测接种马铃薯组织的晚疫病菌，灵敏度较低(Niepold and Schober - Butin. , 1995) ；Trout 等(Trout et al., 1997)利用引物ITS5和PINF来检测天然薯块中的晚疫病菌，灵敏度较高，但特异性较差。Judelson和Tooley根据晚疫病菌全基因组中重复序列设计引物，这种引物能扩增 P. infestans ^ ITS (Internal Transcribed Spaces)序列，特异性高(Judel son and Tooley, 2000)。但该研究并没有直接用于马铃薯晚疫病种薯及叶带菌的检测。徐安传等设计引物08-3和08-4，分别检测马铃薯种薯不同部位晚疫病潜伏情况，灵敏性和特异性均比较高(徐安传等，2004)，但没有实现对马铃薯种植区土壤中的晚疫病菌进行检测。目前检测种薯和叶片晚疫病菌带菌量的试剂盒有①马铃薯晚疫病菌分子检测引物及其用法，这种检测方法主要设计了一对马铃薯晚疫病菌的特异引物(上游引物INFl 和下游引物INF2)，经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在马铃薯晚疫病菌纯DNA、带菌的植株和薯块中特异性地扩增出片段长度为324bp的特异扩增产物(申请号/专利号 200910111735)。但是这种方法，不能为马铃薯生产中晚疫病的检测提供量化指标。最重要的是，作为晚疫病蛰伏和传播的主要场所-土壤中带菌量的检测尚没有有效的检测方法。综合以上分析可以看出，现有技术无法快速、准确，高效、特异性地定量检测土壤马铃薯晚疫病病菌数目，因而无法有效跟踪马铃薯生长过程中晚疫病发生过程、并据此提出有效预防病害措施。鉴于现有技术缺陷，本发明提供了一种快速、准确，高效、特异性地定量检测土壤中马铃薯晚疫病活体病菌的试剂盒，该试剂盒由特异引物和分子生物学试剂组成，可以快速、准确，高效、特异性地定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量，满足人们防治马铃薯晚疫病的生产需要。
参考文献
Andrivon D. Biology, ecology and epidemiology of the potato late blight pathogen Phytophthora infestans in soil. Phytopathology，1995, 85 : 1053-1056.
Haverkort AJ. et al. Societal costs of late blight in potato and prospects of durable resistance through cisgenic modification. Potato Res. 2008， 51 47-57.
Judelson HS.， and Tooley PW. Enhanced PCR methods for detection and quantification of Phytophthora infestans in plants. Phytopathology, 2000， 90:1112-1115.
Niepold F. B. and S. But in· Application of the PCR technique to detect Phytophthora infestans in potato tubers and leaves. Microbiol Res, 1995， 150: 379-385.
Reader J. Potato: A History of the Propitious Esculent. 2009 Yale Univ. Press.
Tooley P. W. , Bunyard B. A. , Carras MM. and Hatziloukas E. Development of PCR primers from internal transcribed spacer region 2 for detection of Phytophthora species infecting potatoes. Appl. Environ. Microbiol, 1997，63:1467-1475.
Trout C.L.， Ristaino J.B.，Madritch Μ. and Wangsomboondee Τ. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight potatoes and tomatoes using PCR. Plant Dis, 1997，81:1042-1048.
Wangsomboondee T. and Ristaino JB. Optimization of Sample Size and DNA Extraction Methods to Improve PCR Detection of Different Propagules of Phythphtoora infestans. Plant Dis. 2002, 86 (3) :247-253.
Zwankhuizen M.J. F. , Govers J.C., Zadoks. Development of potato late blight eipidemics: disease foci, disease gradients and infeciton sources. Phytopathology, 1998，88 : 754-763.徐安传，罗文富，杨艳丽.赵海燕马铃薯晚疫病种薯带菌的分子检测.中国马铃薯，2004，18(2) 72-76.

发明内容
本发明的目的是提供一种定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量的试剂盒。其特征在于该试剂盒含有以下几种试剂
①、试剂A:
DNA 提取液100 mmol/L, Tris-HCl, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L 磷酸钠，1. 5mol/L NaCl，2% CTAB，pH8. 0。②、试剂B:
普通PCR 反应液10 X Tris-HCl 缓冲液(pH8. 3,500mM KCl, 15mM MgCl2);dNTP(2. 5mM)； Taq 酶(5υ/μ 1)以及 Blotto (10% 脱脂奶粉和 0. 2% NaN3)。特异性引物浓度10μΜ，序列为
正向引物(PIF) 5，- CGGCGGCTGCTGGCTTTAT -3，；反向引物(PIR) 5，- GCTCAGACCGAAGTCCAAACG -3，
③、试剂C:
Real Time PCR 反应液SYBR-Green 荧光标记试剂混合物(SYBR green PCR Master Mix, Applied Biosystems)
④试剂D
标准菌株 0°. infestans ATCC) DNA 液浓度为 IOOng/μ 1。该试剂盒可用于定量检测土壤中晚疫病菌带菌量。该试剂盒使用方法如下
①、标准曲线的构建过程用试剂D，10倍稀释DNA至lOSg/μ l，10ng/l·! l，lng/l·! 1， KT1Iig/ μ 1，l(T2ng/ μ 1，l(T3ng/ μ 1，l(T4ng/ μ 1 ；在 Real Time PCR 扩增管中加入 DNA 模板 1 μ 1(浓度分别为 lO—ng/y l，i(T2ng/y l，i(T3ng/y l，l(T4ng/y l，l(T5ng/y 1)，加入试剂 C ομ ，以及试剂B中的特异性引物PIF/PIR (10μΜ)各0.5μ 1，无菌去离子水至总体积20μ1。每个反应做3个平行实验。实时荧光定量PCR仪的设置程序为50°C-5 min, 95°C -10 11^11;然后以951-208，601-11^11，循环；35次；最后在721保温51^11。整个循环完成后，样品在35°C梯度下，0.03°C /s，从60°C增加到95°C。反应结束后，导出EXCEL表格，根据反应的溶解曲线判断每个样品的扩增效率，每组反应取平均值，舍弃Ct大于30的反应(thresho 1 ds cyc 1 es，Ct)，以DNA模板含量的1 og值为横坐标，反应Ct为纵坐标作图，并计算曲线的相关性，R2 ^ 0. 99认为相关性好，扩增结果可信。②、取土壤0. 5克，加入试剂盒内的试剂Al. anl，按照CTAB法提取DNA，通过紫外分光光度法测定提取DNA的质量，标准为0拟60/280为1. 8左右，作为下几步的DNA模板。③、在扩增管中加入DNA模板2 μ l(50ng)，加入试剂盒内试剂B缓冲液3 μ 1 ；dNTP (2. 5mM)2y 1 ；特异引物(PIF/PIR, 10 μ M)各 1 μ 1 ；Taq 酶(5U/μ 1)0. 2μ 1 以及 2% Blotto (10%脱脂奶粉和0. 2% NaN3),加入无菌去离子水至总体积25 μ 1。④、对上述反应体系进行普通PCR扩增，具体程序为95 °C -^iin;然后以 950C -55s, 600C _lmin，72°C -45s，循环 40 次；最后在 72°C保温 5min。
⑤、将扩增后的样品在琼脂糖凝胶电泳检测，看IOlbp处有无条带，若有，说明有马铃薯晚疫病菌存在，若没有发现明显扩增条带，说明该菌不存在或含量很低。⑥、在Real Time PCR扩增管中加入DNA模板Iul (浓度分别为KT1Iig/μ 1，l(T2ng/ μ 1，lOlg/μ 1，KT4Ilg/μ 1，KT5Ilg/μ 1)，加入试剂盒内试剂C 10μ 1,以及试剂B中的特异性引物PIF/PIR (10 μ Μ)各0.5 μ 1，无菌去离子水至总体积20 μ 1。⑦、对上述反应体系进行Real Time PCR扩增，具体程序为 500C -5min, 95°C -IOmin ；然后以 95°C -20s, 60°C -lmin，循环；35 次；最后在 72°C保温 5min。整个循环完成后，样品在35°C梯度下，0. 03°C /s，从60°C增加到95°C。⑧、检测样品得到的Ct值，通过Ct=-3. 32821og[DNA]+31. 994计算得到相应的样品马铃薯晚疫病菌的DNA含量。由于土壤样品马铃薯晚疫病菌的DNA含量与土壤中晚疫病菌带菌量成正比，所以可以通过土壤样品马铃薯晚疫病菌DNA含量的高低间接定量土壤样品马铃薯晚疫病菌带菌量的高低，从而达到定量检测土壤中晚疫病菌带菌量的目的。
具体实施例方式
实施例1标准曲线的构建过程
用试剂 D，10 倍稀释至 102ng/ μ 1，IOng/ μ 1，Ing/ μ 1，KT1Iig/ μ 1，l(T2ng/ μ 1，l(T3ng/ μ 1，10_4ng/ μ 1 ；在Real Time PCR扩增管中加入DNA模板1μ 1(浓度分别为KT1ng/ μ 1， l(T2ng/ μ 1，10_3ng/ μ 1，10_4ng/ μ 1，10_5ng/ μ 1)，加入试剂 C 10 μ 1，以及试剂 B 中的特异性引物PIF/PIR (10 μ Μ)各0.5 μ 1，无菌去离子水至总体积20 μ 1。每个反应做3个平行实验。实时荧光定量PCR仪的设置程序为50°C - 5 min, 95°C - 10 min ；然后以95°C-20s, 60°C -lmin，循环35次；最后在72°C保温5min。整个循环完成后，样品在35°C梯度下， 0. 030C /s,从60°C增加到95°C。反应结束后，导出EXCEL表格，根据反应的溶解曲线判断每个样品的扩增效率，每组反应取平均值，舍弃Ct大于30的反应(thresholds cycles, Ct), 以DNA模板含量的log值为横坐标，反应Ct为纵坐标作图，并计算曲线的相关性，得到相关性较高的标准曲线(R2=O. 9984)，扩增结果可信。

实施例2定量检测土壤中晚疫病菌带菌量
1、分别取三种马铃薯种植土壤(沙土 Sandy、粘土 Clay和腐殖土 Muck)各0. 5g，加入试剂盒内的试剂Al. anl，按照CTAB法提取DNA，通过紫外分光光度法测定提取DNA的质量，标准为0D260/280为1. 8左右。2、在扩增管中加入DNA模板2 μ 1 (50ng)，加入试剂盒内试剂B缓冲液3 μ 1 ；dNTP (2. 5mM)2y 1 ；特异引物(PIF/PIR, 10 μ Μ)各 1 μ 1 ；Taq 酶(5U/μ 1)0. 2μ 1 以及 2% Blotto (10%脱脂奶粉和0. 2% NaN3),加入无菌去离子水至总体积25 μ 1。3、对上述反应体系进行普通PCR扩增，具体程序为95 °C -^iin ；然后以 950C -55s, 600C _lmin，72°C -45s，循环 40 次；最后在 72°C保温 5min。4、将扩增后的样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，三种土壤的DNA扩增结果显示在 IOlbp处均有明显扩增条带，说明该菌存在或含量较高。5、在Real Time PCR扩增管中加入DNA模板 1 μ 1 (浓度分别为 KT1Iig/μ 1，l(T2ng/ μ 1，lOlg/μ 1，KT4Ilg/μ 1，KT5Ilg/μ 1)，加入试剂盒内试剂C 10μ 1,以及试剂B中的特异性引物PIF/PIR (10 μ Μ)各0.5 μ 1，无菌去离子水至总体积20 μ 1。6、在 Real Time PCR 分析仪上扩增，程序为50°C _5min，95°C-IOmin ；然后以 95°C -20s, 60°C -lmin，循环；35次；最后在72°C保温5min。整个循环完成后，样品在
梯度下，0. 030C /s，从60°C增加到95°C。7、扩增结束后，把检测样品得到的Ct值，再通过Ct=_3. 32821og[DNA]+31. 994 (R2=O. 9984)计算得到相应的样品马铃薯晚疫病菌的DNA含量(如下表)。
权利要求
1.一种定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量的试剂盒，其特征在于该试剂盒含下述试剂①、试剂A:DNA 提取液100 mmol/L, Tris-HCl, 100 mmol/L EDTA，100 mmol/L 磷酸钠，1. 5mol/L NaCl，2% CTAB，pH8.0 ；②、试剂B:普通PCR 反应液10 X Tris-HCl 缓冲液(pH8. 3,500mM KCl, 15mM MgCl2);dNTP(2. 5mM)； Taq 酶(5υ/μ 1)以及 Blotto (10% 脱脂奶粉和 0. 2% NaN3)；特异性引物浓度10μΜ，序列为正向引物(PIF) 5，- CGGCGGCTGCTGGCTTTAT -3，；反向引物(PIR) 5，- GCTCAGACCGAAGTCCAAACG -3，③、试剂C:Real Time PCR 反应液SYBR-Green 荧光标记试剂混合物(SYBR green PCR Master Mix, Applied Biosystems)；④试剂D标准菌株 0°. infestans ATCC) DNA 液浓度为 IOOng/μ 1。
2.一种定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量的试剂盒，其特征在于该试剂盒中所采用的引物为下述引物对，这些引物的两端可以添加不定数的保护碱基，酶切位点或接头正向引物(PIF) 5，- CGGCGGCTGCTGGCTTTAT -3，；反向引物(PIR) 5，- GCTCAGACCGAAGTCCAAACG -3，。
3.根据权利要求1至2中任意一项所述的一种定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量的试剂盒，其特征在于该试剂盒中所采用的引物可以在合成时使引物带上荧光标记或是同位素标记。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的一种定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量的试剂盒，其特征在于该试剂盒在定量检测土壤中晚疫病菌DNA含量，并间接推知土壤中晚疫病菌带菌量中应用。
全文摘要
本发明提供一种定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量的试剂盒，该试剂盒含有下述试剂:试剂ADNA提取液；试剂B普通PCR反应液，特异引物5’-CGGCGGCTGCTGGCTTTAT-3’和5’-GCTCAGACCGAAGTCCAAACG-3’，试剂CRealTimePCR反应液；试剂D标准菌株DNA液。使用本试剂盒，可快速、灵敏、准确地定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量。
文档编号G01N21/64GK102453756SQ20101052208
公开日2012年5月16日申请日期2010年10月28日优先权日2010年10月28日
发明者万东石, 李永泉, 邵旭平申请人:兰州大学

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一种定量检测土壤中晚疫病菌带菌量的试剂盒的制作方法