专利名称：非洲猪瘟病毒的荧光定量pcr检测试剂及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以非洲猪瘟病毒基因片段为靶目标设计合成的生物制剂，尤其是能够对非洲猪瘟病毒进行检测的试剂以及这种试剂的制备方法和应用。
背景技术：
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是猪的一种接触性病毒�。静」セ骶奘傻ズ讼赴湫吞卣魇撬劳雎矢�、皮肤有变红的区域和内脏器官严重出血，在首次发生该病的国家和地区，死亡率可高达100％。在自然条件下，非洲猪瘟病毒寄存在钝缘蜱(Ornithodoros)和隐性感染的非洲野猪、疣猪、南非野猪和大野猪中。目前只发现猪表现临床症状。
非洲猪瘟1909年在东非的肯尼亚首次在欧洲移民带来的家猪群中被发现后，至今非洲猪瘟在非洲、西班牙、葡萄牙和意大利等一些国家相继发生。非洲猪瘟给养猪业和爆发的国家的经济带来了巨大损失。1982年非洲猪瘟进入西非的喀麦�。贾抡飧龉宜鹗Я�80％的猪。在海地发生的非洲猪瘟，使这个国家宰杀了所有的家猪和大部分野猪，养猪业受到了毁灭性的打击。美国科学家认为，如果非洲猪瘟在美国发生，要清除一次疫情，根据发生范围，花费大约在七百五十万到五亿五千万美元，如果清除失败，第二年的损失将是二十亿美元。
国际兽疫局(OIE)将该病确定为A类动物传染�。夜步淙范ㄎ扯镆焕啻静�。本病对国际贸易产生严重影响，世界各国在从该病流行和发生过的国家或地区输入猪时，采取禁止输入或针对本病的严格的检疫措施。我国加入世界贸易组织(WTO)之后，必须参与实施国际间卫生与动植物检疫措施的协定(“SPS”)，应按照OIE的有关规定和技术要求，采用先进技术对非洲猪瘟进行检疫。但是，目前我国尚未进行过该病检疫技术的研究和技术储备，因此，研究建立非洲猪瘟的安全、快速检测技术和配套的检测试剂，为防止重大动物疫病传入我国作好技术储备。
非洲猪瘟病毒(ASFV)属非洲猪瘟相关病毒科(Asfarviridae)类非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)，目前是该科的唯一成员。ASFV是一种具有囊膜、二十面体对称的双链DNA病毒，它是目前唯一的DNA虫媒病毒。至今还没有发现与非洲猪瘟病毒血清学相关的病毒。与其它具有脂蛋白囊膜的病毒相比较，非洲猪瘟病毒缺少糖蛋白，但高度纯化的非洲猪瘟病毒颗粒表面含有二个非蛋白的糖基成分，其分子量分别为230K和90K。据报道，细胞内的非洲猪瘟病毒的多肽结构至少有28种，其中VP73是衣壳的主要成分，也最为保守，内核的主要成分是VP172，而VP73为主要的诊断抗原。
目前，国外对非洲猪瘟诊断方法有红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验、动物接种试验、ELISA、聚合酶链反应(PCR)等。其中红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验的敏感性不高和特异性不强，动物接种试验不安全，ELISA在检疫和诊断中具有很大的实用性，具有敏感、特异、结果具有高度一致性的特点，但是ELISA方法只能检测抗体，不能直接检测病毒。聚合酶链反应(PCR)检测ASFV的方法具有特异、敏感、快速的特点，但有费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点。到目前为止，我国尚未进行过非洲猪瘟病毒快速检测方法研究和相关检测试剂的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用非洲猪瘟病毒VP73基因序列设计合成的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂。
本发明的另一目的是提供这种检测试剂的制备方法。
本发明的再一目的是提供这种检测试剂的应用。
本发明系选择非洲猪瘟病毒VP73基因的保守片段为靶目标，首先应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计合成一大批引物和探针。将设计的多对引物和探针合成和标记后进行最佳配对筛选实验，得到最适合的引物和探针。
本发明所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为66bp，引物和探针序列为引物ASFV-VP73-F5’-TGATATGGTGGGCCACCAT-3’
ASFV-VP73-R5’-CCCTGAATCGGAGCATCCT-3’探针(FAM)5’-TATTGGGTGCATGTCATTCGTCCTGG-3’(TAMRA)。
本发明所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂的制备方法由以下步骤组成一、选择ASFVVP73基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为TGATATGGTGGGCCACCATATATTGGGTGCATGTCATTCGTCCTGGCAGGATGCTCCGATTCAGGG；二、根据ASFV VP73基因序列的特点，首先应用primer Express软件和primerprere5.0软件，设计出一批待测引物和探针；三、引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；四、探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR；五、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物和探针；六、经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量临床样品的检测应用评估，得到如权利要求1所述的扩增效率和特异性好的引物和探针。
研究建立特异、敏感、安全、准确、快速的检测方法，在检疫、诊断、分子流行病学研究具有重要意义。对样品中低含量的非洲猪瘟病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的方法必须具备高敏感性、高特异性和高准确性。本发明的非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR可直接对样品中的ASFV进行准确的定量检测，具有简单、易操作、安全、一次可进行大量样品检测、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点。本发明的优点和积极效果为1、本试剂与常规的PCR相比较，该方法具有快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品等优点。非洲猪瘟病毒荧光定量PCR可对样品中低含量的ASFV病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测，是一种ASFV检测的良好方法。
2、本试剂可对细胞培养物、分泌物、血液、组织等多种样品中的ASFV进行快速检测，样品适用范围广，没有生物安全隐患，使用安全的优点。
3、本荧光定量PCR试剂除了具有特异性高、敏感性强外，可同时进行大量样品检测，具有高通量性，可减少DNA、cDNA或PCR产物污染的风险。比常规PCR快速，无需扩增后的电泳分析。克服了常规PCR产生的产物须电泳检测、费时、不敏感和不能定量的缺点。
4、与常规PCR相比，荧光定量PCR作出一个定量的、客观的估计，判定出阳性、阴性和可疑。CT值为35.00可确定为阳性和阴性的临界值(cut-off)。更重要的是荧光定量PCR特别适用于保存时间长而无法进行分离病毒的大批量样品的检测。
5、本试剂所组成的试剂盒可在收到样品后4小时之内作出定性、定量检测结果。该荧光定量PCR试剂盒是一种检测临床样品中ASFV的敏感和可靠的方法。
具体实施例方式
1、ASFV VP73基因重组质粒的构建按照黄培堂等译《分子克隆实验指南》(第三版)，中国科学出版社，2003年1月，第1217页至第1259页，进行非洲猪瘟病毒VP73基因克隆和测序，构建ASFV VP73基因重组质粒，将重组质粒命名为pBAD-VP73。
2、设计引物和探针本发明选择ASFV VP73基因的保守片段为靶目标，通过对GenBank中报道的ASFV基因的DNA序列和上述1克隆和测序的非洲猪瘟病毒基因DNA序列进行同源性分析比较，选定ASFV基因的最保守片段(66bp)，应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针，引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物和探针，经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量临床样品的检测应用评估，确定扩增效率和特异性最好的一对引物和一条探针，扩增目标片段长度为66bp。
3、DNA提取非洲猪瘟病毒DNA和标准品同时制备。参照黄祯祥主编《医学病毒学基础及实验技术》，科学出版社(1990年)第143-146页，先测定毒价，以Reed和Muench氏法计算TCID50。取100μL病毒原液，参照李永明主编《实用分子生物学方法手册》，科学出版社(1998年)第166-168页，酚/氯仿核酸抽提法提取DNA。用无DNA酶的超纯水溶解总DNA，稀释成相当于10000、1000、100、10、1、0.1TCID50的每个反应管。动物组织、血液(或抗凝血)、血清和细胞组织等材料直接提取DNA。荧光PCR和常规PCR试验用同批次提取的DNA。
4、ASFV荧光定量PCRASFV荧光定量PCR采用50μL体积反应液，在7000型荧光定量PCR仪中，按下列反应参数进行95℃预变性5min；95℃变性15sec，60℃1min，扩增40个循环。
引物和探针的浓度进行精确筛�。曰竦米畹偷腃T值和较高的荧光强度增加值(ΔRn)。每次检测时，设立用水代替病毒DNA样品的4个阴性对照(或正常组织、细胞阴性对照)；设立相当于1000、100、10、1TCID50/每反应管的ASFV标准各4个对照；每个样品检测做3管平行试验。在4个阴性对照为阴性、阳性对照为阳性时，整个试验有效，可进一步判定结果。每个样品须作多个备份，以进行稳定性、重复性试验。
5、常规PCR常规PCR的上游引物和下游引物与荧光定量PCR相同，扩增目标片段长度为66bp，按常规方法进行扩增。检测用3％琼脂糖电泳分析，阳性扩增结果出现一条66bp特异性条带。
6、ASFV荧光定量PCR的特异性、敏感性用SFV、TGEV、PRSV、FMDV以及正常BHK21细胞、野外采集猪的组织样品和血液进行特异性比较检测。对ASFV DNA、动物组织样品进行10倍系列稀释，用常规PCR和荧光定量PCR检测，比较它们的敏感性。
7、荧光定量PCR稳定性和重复性试验在评估ASFV荧光定量PCR检测ASFV方法中的组内和组间试验的重现性、稳定性时，用相当于1000TCID50的样品DNA，在同样反应条件下，反复进行荧光定量PCR检测，每次试验的每个样品做6个平行的反应管，重复12次。
8、标准阳性对照样品的制备、标准曲线的建立及核酸拷贝数的计算上述1构建的重组质粒pBAD-VP73，转化大肠杆菌TOP10，LB培养基(含Amp100μg/mL)增殖，碱裂解法提�。约梁写炕柿Ｅǘ扔梅止夤舛燃撇釵D260定量。模板浓度的计算在作绝对定量时，首先制备标准曲线。对标准品进行10-1、10-2、10-3、10-4～10-7稀释，通过测OD知道质粒原液(标准品)的浓度后，计算出每个PCR管中模板的数量。例如，已知pBAD/Thio TOPO载体长4436bp，插入的ASFV VP73基因片段长1185bp，每个碱基的平均分子量是330，(每对碱基/bp是660，)质粒原液约13μg/mL，阿弗加德罗常数(每mol的微粒数)是6.02×1023/mol。那么每2μL的绝对模板数量是(13μg/mL×2μL×6.02×1023/mol)/[(4436+1185)bp×660g/(mol×bp)]＝4.2×1018。据此，10-4～10-7质粒的模板分子数是4.2×1014～1011。做荧光定量PCR检测，以拷贝数的对数为X轴，CT值为Y轴作回归曲线，获得标准曲线。
9、引物和探针及其浓度的筛选选择引物、探针、模板的最佳浓度配比，获得荧光定量PCR反应的最低CT值和最高ΔRn，提高扩增效率和敏感性。应用含有目的片段的质粒标准品pBAD-VP73，经系列稀释，制备DNA不同含量的检测样品。对设计的引物和探针，选用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的引物和探针终浓度，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度。
10、对灭活的ASFV样品和对照样品的检测用荧光定量PCR对灭活的ASFV、猪正常组织、SFV、TGEV、PRSV、FMDV以及正常BHK21细胞、野外采集猪的组织样品等试验样品进行检测。提取的DNA稀释后检测，阳性样品的CT值均小于或等于35.0，阴性对照样品的CT值均大于38.0或无CT值，试验特异性强。经对大量阳性和阴性样品检测结果的统计分析，确定了CT值38.0可作为阳性和阴性的临界值(cut-off)。CT值大于38.0可判为阴性，CT值小于或等于35.0可判为阳性，在35.0-38.0之间为可疑，须重新试验。荧光定量PCR检测ASFV的特异性强，敏感性高，重复性很好。
11、ASFV荧光定量PCR标准化试剂和检测程序11.1试剂盒组成(50μl反应×50次)根据上述1～10试验结果，按照反应条件优选、对比试验和验证试验确定的反应条件，配制如下试剂盒组份
11.2操作方法11.2.1总DNA提取(1)参照李永明主编《实用分子生物学方法手册》，科学出版社(1998年)第166-168页，酚/氯仿核酸抽提法提取DNA。。
(2)也可从生物试剂公司购买商品化的动物组织基因DNA提取和纯化试剂盒，提取样品DNA。
11.2.2反应组份配制(1)取一支200μl光学PCR反应管，反应总体积为50μl，向反应管中加入下列反应物
(2)定量按需要对标准品(溶液F)进行稀释后制作标准曲线，至少7个稀释度。
(3)设立对照阳性对照和阴性对照各设2管。
11.2.3扩增按下列参数设置反应条件
11.2.4结果分析和判定(1)结果分析条件设定直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
(2)质控标准——阴性对照无Ct值，并且无扩增曲线，一直为水平线。
——阳性对照的Ct值应小于35.0，并出现典型的扩增曲线，2个阳性对照扩增曲线基本重合，特别是在Threshold(荧光临界值)附近。否则，此次实验视为无效。
——定量用的标准品扩增曲线出现典型的扩增曲线，指数区较明显，7个点具良好的线性范围，平台区汇于一起，相关系数在0.98以上。
(3)结果描述及判定——阴性Ct值应大于38.0或无扩增曲线，表示样品中无非洲猪瘟病毒。
——阳性Ct值小于或等于35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在非洲猪瘟病毒。
——有效原则Ct值在35.0～38.0的样品建议重做。重做结果Ct值大于38.0或无扩增曲线者为阴性，否则为阳性。
——定量根据标准曲线作出定量。
权利要求
1.一种非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂，其特征在于包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为66bp，引物和探针序列为引物ASFV-VP73-F5’-TGATATGGTGGGCCACCAT-3’ASFV-VP73-R5’-CCCTGAATCGGAGCATCCT-3’探针(FAM)5’-TATTGGGTGCATGTCATTCGTCCTGG-3’(TAMRA)。
2.按照权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂的制备方法，其特征在于由以下步骤组成(一)、选择非洲猪瘟病毒特异和保守的VP73基因序列的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为TGATATGGTGGGCCACCATATATTGGGTGCATGTCATTCGTCCTGGCAGGATGCTCCGATTCAGGG；(二)、根据VP73基因的特点和引物、探针设计的原则，设计引物和探针；(三)、引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；(四)、探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR；(五)、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物和探针；(六)、经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，从候选引物和探针中确定最佳引物和探针，并经过大量临床样品的检测应用评估，得到如权利要求1所述的扩增效率和特异性最好的引物和探针。
3.权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂在制备ASFV荧光定量PCR标准化试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种以非洲猪瘟病毒基因片段为靶目标设计合成的生物制剂，尤其是能够对非洲猪瘟病毒进行检测的试剂以及这种试剂的制备方法和应用。本发明系选择非洲猪瘟病毒特异和保守的VP73基因片段为靶目标，根据VP73基因的特点和引物、探针设计的原则，设计合成引物和探针。将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，并经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，得到最适合的引物和探针。本发明所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为66bp。本试剂可对非洲猪瘟病毒进行快速检测。
文档编号G01N21/64GK1840698SQ20061001061
公开日2006年10月4日 申请日期2006年1月6日 优先权日2006年1月6日
发明者花群义, 周晓黎, 董俊, 杨云庆, 徐自忠, 肖荣海, 尹尚莲 申请人:云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心
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