专利名称：组织缺氧的体液指标的制作方法
技术领域：
本发明涉及在哺乳动物的体液中检测和测量组织缺氧或可归因于组织缺氧的临床综合征的一种或多种指标。具体而言，本发明涉及在对哺乳动物进行组织缺氧或可归因于组织缺氧的临床综合征的诊断和/或预后中，单独或与其它指标相结合检测氧调蛋白(Oxygen Regulated Protein)(ORP150)或由其衍生而来的多肽片断。
背景技术：
缺血性心脏病和心力衰竭是世界上威胁健康的主要问题，但是目前诊断和控制这些病症的手段还十分有限。
慢性心力衰竭慢性心力衰竭(CHF)是一种常见的临床综合征，它在拥有老年人口的工业化社会中已成为越来越重要的医疗问题。
在过去的20年中心力衰竭的住院率显著升高，而且CHF与预后不良和低生活质量紧密相联。CHF的直接花费占医疗费用的约1-2％，其中绝大部分都与入院治疗有关。
慢性心力衰竭最常见的起因是左室收缩功能障碍(LVSD)。Glasgow(McDonagh等，Lancet 1997；350829-8331)和Birmingham(Davies等，Lancet 2001；358439-444)的筛选研究表明确诊的LVSD的患病率分别为2.9％和1.8％。这两项研究中均有一半的病例未显示出症状。对LVSD患者的确诊可以保证治疗处方的正确性，从而提高每个患者的生活质量和改善预后。目前超声波心动描记法是最常用的LVSD和心力衰竭的检查和诊断方法。
CHF的病理生理学牵涉到许多神经激素系统包括儿茶酚胺、肾素-血管紧张素、内皮素、前房和脑钠尿肽系统的活化。这些系统中一些系统的活化是适应型的(钠尿肽系统)；其它系统虽然在急性条件下是适应型的但是尤其是持续处于慢性状态中时会变为适应障碍型(内皮素、肾素-血管紧张素和儿茶酚胺系统)。钠尿肽激素分泌水平的升高已被作为诊断CHF的方法(McDonagh等，Lancet 1998；3519-13；Hobbs等，Br Med J 2002；3241498-1502)。对于LVSD的检测而言，作为诊断工具脑钠尿肽(BNP)要优于N-末端前心房钠尿肽(N-ANP)(McDonagh等，Lancet 1998；3519-13)。此外，另一种衍生于BNP前体的肽，即N-末端BNP前体(N-BNP)也是鉴别LVSD的合理选择(Hobbs等，Br Med J 2002；3241498-1502)。这两种情况中所检测的预测值为阴性的概率高，说明它们可用于排除CHF。许多CHF病例的病因学都是缺血性心脏病。此外，长期心输出量下降也会导致组织血流灌注不足和组织相对缺氧。
然而，组织缺氧时血浆中被诱导并释放的指标将对心脏病的诊断和预后有很大的利用价值，并可进一步用于这种疾病的监测。
缺血性心脏病缺血性心脏病在发达国家是主要的健康负担，它的主要病因学是动脉粥样硬化。脂质、特别是氧化或修饰的LDL，与巨嗜细胞和其它细胞一起导致斑块生长和不稳性。
氧调蛋白ORP150及其在内质网中作为分子伴侣蛋白的作用氧调蛋白(ORP150)是一种内质网相关的伴侣蛋白，最初从缺氧的星形胶质细胞中克隆得到(Kuwabara等，J Biol Chem 1996；2715025-32)。在大鼠星形胶质细胞、人主动脉血管肌细胞和单核白细胞中，已证实这种蛋白的诱导对缺氧具有特异性，而对其它应激性刺激如葡萄糖丧失、过氧化氢、衣霉素或热休克没有特异性(Kuwabara等，J Biol Chem 1996；2715025-32；Tsukamoto等，J Clin Invest 1996；981930-41)。此外，由人动脉粥样硬化损伤组织制备的组织提取液显示ORP150 mRNA水平和蛋白质表达升高，其中大部分mRNA发现于巨嗜细胞中(Tsukamoto等，J ClinInvest 1996；981930-41)。ORP150主要存在于缺氧细胞的内质网(ER)中，它的功能可能是在动脉粥样硬化的血管壁细胞中作为分子伴侣蛋白(Tsukamoto等，J Clin Invest 1996；981930-41)。它的表达可由于一种已知的血管疾病的危险度因子即氧化或乙酰化低密度脂蛋白(LDL)的存在而进一步增强(Tsukamoto等，J Clin Invest 1996；981930-41)。由于用反义寡核苷酸来降低它的表达可导致单核吞噬细胞对缺氧损伤的易感性增强，因此它的功能包括抗缺氧诱导损伤的保护作用(Tsukamoto等，J ClinInvest 1996；981930-41).
人ORP150的克隆最近证实了所推断的具有999个残基的氨基酸序列，其在C末端带有一个内质网(ER)固定信号(Ikeda等，Biochem BiophysRes Commun 1997；23094-9)。它与其它应激诱导蛋白如葡糖调蛋白(GRP170)和热休克蛋白(HSP70)具有一些同源性。它在ER中的部位说明了它在蛋白质折叠和成熟过程中、尤其是在缺氧条件下作为分子伴侣蛋白的作用。例如，肾细胞ORP150反义转化株表现为糖蛋白GP80成熟延迟，导致后者聚积在ER，这表明ORP150在能量匮乏条件下在细胞ER内对蛋白质成熟和转运起一定作用(Bando等，Am J Physiol Cell Physiol 2000；278C1172-82)。
对小鼠中风模型的观察(Matsushita等，Brain Res Mol Brain Res 1998；6098-106；Tamatani等，Nat Med 2001；7317-23)为ORP150在血管疾病中的作用提供了证据。在小鼠脑缺血模型中，在缺氧的神经元中甚至在缺血区域和能量衰竭区域均有ORP150 mRNA和蛋白的快速诱导作用(Matsushita等，Brain Res Mol Brain Res 1998；6098-106)。在缺血的人脑中，虽然神经元中ORP150的表达只是稍微被诱导，但在星形胶质细胞中却有显著的ORP150诱导作用(Tamatani等，Nat Med 2001；7317-23)。过度表达ORP150的神经元可耐受缺氧应激，而且神经元中过度表达ORP150的遗传工程小鼠在缺血应激作用下中风程度较轻(Tamatani等，Nat Med 2001；7317-23)。细胞保护作用与半胱天冬酶-3样活性抑制和脑源性神经营养因子(BDNF)活性增强有关，这表明ORP150在缺氧条件下的细胞保护作用中起一定作用(Tamatani等，Nat Med 2001；7317-2310)。此外，经转染以过度表达ORP150反义RNA的星形胶质细胞或细胞系对缺氧应激较为易感，从而导致细胞凋亡(Tamatani等，Nat Med 2001；7317-23；Ozawa等，J Biol Chem 1999；2746397-404)。
其它支持ORP150在血管疾病中作用的证据在于它与血管发生的关联(Tsukamoto等，Lab Invest 1998；78699-706；Ozawa等，Cancer Res 2001；614206-13；Ozawa等，J Clin Invest 2001；10841-50)。肿瘤细胞表达ORP150，其中侵入宿主组织的细胞中有高度的表达(Tamatani，Nat Med2001；7317-23)。侵入常常与血管内皮生长因子(VEGF，一种已识别的血管生成因子)与ORP150的共同表达有关(Ozawa等，Cancer Res 2001；614206-13)，而且转染了反义ORP150的肿瘤细胞侵入力较弱(Ozawa等，Cancer Res 2001；614206-13)，同时VEGF成熟缺陷可导致它在ER中聚积(Ozawa等，Cancer Res 2001；614206-13)。在伤口中，新血管形成与VEGF和ORP150的表达均有关(Ozawa等，J Clin Invest 2001；10841-50)。局部给予带有ORP150的腺病毒可使伤口修复水平升高、促进该位置新血管形成和VEGF表达(Ozawa等，J Clin Invest 2001；10841-50)。经基因工程设计的降低了ORP150表达的巨嗜细胞中存在VEGF成熟缺陷，从而使后者在ER中聚积，而过度表达ORP150却可使VEGF产物成功的导出和分泌(Ozawa等，J Clin Invest 2001；10841-50)。除了ORP150在缺氧应激下抑制细胞凋亡方面的其它细胞内效应，ORP150的表达促进血管发生这一事实将进一步支持它作为细胞保护试剂的作用。
发明概述第一方面，本发明提供了一种用于在哺乳动物中对组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征进行筛选、诊断或预后，用于在哺乳动物中确定组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征所处的阶段或其严重程度，用于鉴别存在发展为组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的风险的哺乳动物，或者在向患有组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的哺乳动物实施治疗后用于监测治疗效果的方法。上述方法包括测量所述哺乳动物的体液样品中第一标志的水平，其中第一标志为氧调蛋白(ORP150)或它的一个片断。
在组织缺氧条件下，组织中ORP150的表达可能升高。ORP150蛋白与内质网相结合而不应被分泌出去。然而，本发明人却出人意料的证实了ORP150或衍生于ORP150的多肽片段最终可以被检测到(在人血浆中，用一种免疫测定法)并且已经能够证实它可以作为一个指标用于CHF的诊断和预后。此外，已发现在心力衰竭和缺血性心脏病(如心肌梗塞)患者血浆中检测到的ORP150或其多肽片段水平较正常个体高。因此，对这些指标的测量可用于辅助诊断心力衰竭和评价心力衰竭的严重程度。
ORP150或其多肽片段还可用于评估缺血性心脏病患者或具有急性冠脉综合征的患者的预后；尤其是心肌梗塞发作后，该种多肽水平升高的患者死亡或由于心力衰竭再次入院的风险均有增加。
如本文所使用的，术语“组织缺氧”指组织或器官的供氧量低于正常水平。供氧量下降的原因可能是由于红细胞数量降低导致氧的利用、运输或流量减少，肺部氧合作用缺陷(如低氧压、肺功能异常、气管梗阻、心脏右向左分流)，血红蛋白释放氧的能力下降，微动脉阻塞、血管收缩，静脉流出损伤或动脉流入减少。术语“指示组织缺氧的临床综合征”指任何发展阶段的由组织缺氧引起或导致组织缺氧的疾病状态或病症。因此它包括如局部缺血，局部缺血的过程，导致细胞坏死的组织损伤，慢性心力衰竭，冠脉循环急性阻塞如缺血性心脏病、心肌梗塞和其它急性冠脉综合征(如非ST升高型心肌梗塞和不稳定型心绞痛)，起因于冠状动脉硬化的临床综合征，中风，大动脉瘤，外周血管疾�。苑尾『椭琢龅炔≈�。
在本发明中，ORP150片段是指具有ORP150特定氨基酸序列的ORP150蛋白片段。
图16提供了人ORP150的氨基酸序列(NCBI数据库登录号AAC50947，登录号NP 006380)，本文使用的“ORP150”包括其变异型和等位基因变异型。虽然片段可能含7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸，但它也可能仅含6个氨基酸那么少。在一种具体形式中，片段含有或由序列LAVMSVDLGSESM组成。分子量可由本领域技术人员熟知的方法如凝胶电泳法或分子排阻色谱法测定。
在本发明中，ORP150可在血浆或其它可由哺乳动物体内获得的体液例如细胞间液、尿液、全血、唾液、血清、淋巴液、胃液、胆汁、汗液和脑脊液中检测到。体液可以是经过处理的(例如血清)也可以是未经过处理的。哺乳动物可以是人。
所测量的ORP150或其片段水平可以与未发生组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征时的ORP150水平相比较。该水平可以是来自一个或多个未发生组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的哺乳动物的ORP150水平，或者是预先测定的在这样的哺乳动物中ORP150或其片断水平的参考范围。这样，这些水平可以与在群体研究中未显示该病症的主体中测定的参考水平相比较以提供诊断或预后的方法。这些个体可以经过年龄和/或性别匹配。在一种具体形式中，指示未发生组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的ORP150水平可在1-5.7fmo/ml之间。指示存在组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的ORP150的水平则可能在956fmol/ml或更高的范围内。在本发明涉及向患有组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的哺乳动物实施治疗后监测治疗效果的部分，所测定的ORP150或其片段水平可以与该个体的基线水平相比较。基线水平可以在治疗开始之前测定。相对于基线水平的差异可表明缺氧状况的加剧或缓解并由此说明该治疗是否有效。ORP150或其片段水平升高表明组织缺氧，反之亦然。
在本发明的方法中，也可以测量第二种在哺乳动物中指示组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的指标。指示组织缺氧的临床综合征可以是心力衰竭或缺血性心脏病。在这种情况下，本发明的方法可进一步包括测量指示心力衰竭或缺血性心脏病的第二指标。第二指标可以是一种钠尿肽，包括天然心房钠尿肽(ANP-参见Brenner等，Physiol.Rev.，1990，70665)、脑钠尿肽(BNP)和C型钠尿肽(CNP-参见Stingo等，Am.J.Physiol.1992，263H1318)，也可以是它的一部分、变异型或嵌合体。优选的钠尿肽是脑钠尿肽(BNP)或N-末端脑钠尿肽前体(N-BNP)。心肌伸张、心肌紧张和心肌损伤可触发左心室心肌细胞释放BNP前体(两种循环形式，BNP(活性肽)和N-BNP(非活性肽)的完整前体)和增加BNP生成。ORP150或其肽片段可以与钠尿肽类(例如N-末端脑钠尿肽前体或N-BNP)结合用于评价缺血性心脏病或急性冠脉综合征患者的预后；在心肌梗塞后，各种肽的组合可用于患者死亡率的风险分层分析。
用与第一指标ORP150或其片段相似的方法，所测量的第二指标的水平可以与指示未发生组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的第二指标的水平相比较。该水平可以是来自一个或多个未发生组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的哺乳动物的第二指标的水平，或者是预先测定的在未发生组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的哺乳动物中第二指标水平的参考范围。指示组织缺氧风险升高的BNP或N-BNP的水平可在5.7fmol/ml或更高的范围内。
指标水平的单位可以是浓度单位、质量单位、摩尔单位、体积单位或任何其它可指示指标存在量的度量。
第一和第二指标的水平可分别由免疫测定法即利用可与指标特异性结合的抗体的方法来测量。这种测定法可以是竞争性或非竞争性免疫测定法。这种测定法既可以是同源性的也可以是非同源性的，它在本领域中众所周知，在方法中使被检测的分析物与用可探测物质如乳胶或金粒子、用荧光物质、用酶、用电化学活性物质等标记的特异性结合配偶体如抗体相结合。或者可将分析物用上述任何一种可探测的物质标记然后使之与有限量的特异性抗体竞争。然后，分析物存在与否或存在的分析物的量可通过检测标记物存在与否或其浓度来测定。这种测定法可通过常规方法利用实验室分析仪器进行，或者通过治疗点(point of care)或家庭测试装置如专利EP291194中所描述的侧向流量免疫测定法来进行。
在一种具体形式中，检测法的完成是通过在如果测定指标存在时会发生免疫特异性结合的条件下使待测试的受试者样品与适当的抗体相接触，然后检测或测量任何通过抗体的免疫特异性结合的量。抗体可与样品接触至少约10分钟、30分钟、1小时、3小时、5小时、7小时、10小时、15小时或1天。可以使用任何适当的免疫测定法，包括但不限于竞争性或非竞争性测定法系统，应用的技术如蛋白质印迹法、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“三明治”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法和蛋白质A免疫测定法。
例如，液体样品中的指标可通过两步的三明治测定法检测。第一步中，用捕获试剂(例如抗指标抗体)捕获指标。可任选将捕获试剂固定在固定相上。第二步中，用直接或间接标记的检测试剂来检测捕获的指标。在一种具体情况中，检测试剂为抗体。另一种具体情况中，检测试剂为凝集素。
一种具体情况中，侧向流量免疫测定装置可以以“三明治”形式应用，其中体液样品中存在的足够的指标将引起测向流量测定法中捕获带内“三明治”相互作用的形成。这里使用的“捕获带”包含捕获试剂如抗体分子、抗原、核酸、凝集素、和适合捕获ORP150和其它本文所述指标的酶。该装置还可引入一种或多种适合于在捕获带内进行捕获的发光标记物，捕获的程度由分析物的存在来确定。合适的标记物包括固定于聚苯乙烯微球中的荧光标记物。为使捕获在捕获带内发生，微球可用免疫球蛋白包衣。
可用于本发明的其它测定法包括但不限于流通装置。
在流通测定法中，一种试剂(通常为抗体)被固定于膜表面一个确定区域。然后将该膜覆盖于一个吸收层上，该吸收层的作用是作为一个贮库不断的将样品体积泵过该装置。固定以后，将膜上剩余的蛋白质结合点封闭以使非特异性相互作用降至最低。使用该测定法时，将含有对该抗体特异性的指标的体液样品加到膜上，并滤过基质以使指标与固定的抗体相结合。
在可选择的第二步中(在第一个反应物为抗体的具体情况下)，可加入或释放可与被捕获指标反应的、标记的二级抗体(酶结合物、与有色乳胶粒子偶联的抗体或掺入到有色胶体内的抗体)以使三明治完整。或者，二级抗体可与样品混合后一次加入。如果指标存在，膜表面会显影有色斑点。
本文使用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子中有免疫活性的部分，即含有可与抗原特异性结合的抗原结合位点的分子。可用于本发明的免疫球蛋白分子可以是任何一类免疫球蛋白分子(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亚类。抗体包括但不局限于多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、人源性抗体和嵌合型抗体、单链抗体、Fab片段和F(ab′)2片段、Fab表达文库产生的片段、抗个体基因型抗体(抗-Id)和上述任何一种抗体的抗原表位结合片段。如果一个抗体优先与抗原结合，并且，例如它与另一分子的交叉反应性小于30％，优选20％、10％或1％，则该抗体或一般来讲任何分子可“特异性结合”该抗原(或其它分子)。抗体的部分包括Fv和Fv′段。
一种可用于检测ORP150的抗体可识别LAVMSVDLGSESM序列。其它合适的抗体可从Immuno-Biological Laboratories Co.Ltd，1091-1Naka，Fujioka-shi，Gunma，375-0005，Japan购买到。
本发明还提供了实施本发明方法的试剂盒。
本发明还提供了一个用于在哺乳动物中对组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征进行筛选、诊断或预后，用于在哺乳动物中确定组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征所处的阶段或其严重程度，用于鉴别存在发展为组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的风险的哺乳动物，或者在向患有组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的哺乳动物实施治疗后用于监测治疗效果的试剂盒，上述试剂盒包含从所述哺乳动物中采集体液样品的说明书；和一种或多种用于测量样品中氧调蛋白(ORP150)或其片段水平的试剂。
该一种或多种试剂可包含特异性结合第一指标的抗体，如上所述。该试剂盒另外还可包含一种或多种如上所述用于在哺乳动物中测量指示组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的第二指标的水平的试剂，特别是该指示组织缺氧的临床综合征是心力衰竭或缺血性心脏病时。
关于从所述哺乳动物中采集体液样品的说明书可以是可选项。此外，本发明的试剂盒还可选包含一种或多种以下部分(1)该试剂盒用于在哺乳动物中对组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征进行筛选、诊断或预后，用于在哺乳动物中确定组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征所处的阶段或其严重程度，用于鉴别存在发展为组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的风险的哺乳动物，或者向患有组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的哺乳动物实施治疗后用于监测治疗效果的使用说明书；(2)试剂盒中存在的任何抗体的标记的结合配偶体；(3)可将任何这种抗体固定于其上的固定相(如试剂条)；(4)管理部门批准用于诊断、预后或治疗或用于这些用途的任何组合的标签或插页。如果没有提供该抗体或每个抗体的标记的结合配偶体，则该抗体或每个抗体本身可以用可探测的标记物例如化学发光、酶、荧光或放射性物质标记。
ORP150过度表达于动脉粥样硬化斑的血管壁上(Tsukamoto等，J ClinInvest 1996；981930-41)，主要存在于巨嗜细胞中。由于本发明的发明者已经证实了心力衰竭和缺血性心脏病(其主要病因是动脉粥样硬化)患者血浆中ORP150升高，因此可能患有其它起因于动脉粥样硬化的临床综合征如缺血性休克、大动脉瘤、外周血管疾病或其它急性冠脉综合征的患者血浆中ORP150水平也会升高，并且该指标可能可以作为这些病症存在或严重程度的指示。与此相似，慢性肺病的患者因其肺部组织可能缺氧我们也预测其血浆中ORP150升高。目前，还没有一种简便地测量肺病患者例如正在进行家庭氧疗法的患者的pO2的方法，因此测量ORP150的另一项应用是用于对这些患者的氧疗法进行监测。由于侵入性肿瘤可能过度表达ORP150(Tsukamoto等，Lab Invest 1998；78699-706；Ozawa等，CancerRes 2001；614206-13；Asahi等，BJU Int 2002；90462-6)以作为血管内皮生长因子的伴侣蛋白，所以它还可作为肿瘤的指标，尤其是可能在其中心区域相对缺氧的侵入性肿瘤。该应用还可以扩展到诊断和监测这些侵入性肿瘤的治疗。
另一方面，本发明提供了氧调蛋白ORP150或其肽片段在哺乳动物中作为组织缺氧指标或指示组织缺氧的临床综合征指标的用途。可归结于组织缺氧的临床综合征可能由心力衰竭、缺血性心脏病、动脉粥样硬化、缺血性休克、大动脉瘤、外周血管疾病、肺病或肿瘤生长引起。
另一方面，本发明提供了氧调蛋白ORP150或其肽片段在哺乳动物个体中作为心脏指标用作确定心力衰竭或缺血性心脏病的存在与否或其严重程度的诊断工具。ORP150或其肽片段可以与其它指示心力衰竭或缺血性心脏病的指标组合应用。其它指标可以是钠尿肽如脑钠尿肽(BNP)或N-末端脑钠尿肽前体(N-BNP)。
本发明还提供了确定组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的存在与否或其严重程度的方法，该方法检测来自哺乳动物的体液样品中是否存在ORP150或其肽片段。指示组织缺氧的临床综合征可以是心力衰竭或缺血性心脏�。逡嚎梢允茄�。将这样得到的结果与由一个或多个健康个体中获得的结果相比较，并基于比较作出诊断或预后。该测量可利用免疫测定法进行。
本发明还提供了检测氧调蛋白(ORP150)或其片段的方法，所述方法包括从哺乳动物个体中获取体液样品和对所述样品进行测量以指示所述蛋白(ORP150)或其片段是否存在和/或其存在的量。
根据需要，可对本发明各个方面优选的特点在细节上进行必要的修改，这些修改也在本发明的范围之内。本文中所提到的现有技术文献均以法律所允许的最大程度引入本文作为参考。
实施例以下将在下列非限制性实施例中对本发明进行更详细的描述。参照如下附图进行说明，其中图1表示ORP150肽竞争性免疫测定法的标准曲线。
一位患者的血浆提取物(由实线连接的实心的圈)被稀释两倍后显示与标准曲线平行。两位患者的尿液提取物(由虚线连接的空心三角)也表明其与标准曲线平行。
图2表示分子排阻色谱和ORP150级分分析的结果。150kD、20kD和6.5kD标记物的洗脱点由箭头标出。在150、约7和约3kD处有三个明显的ORP150免疫反应峰。
图3a和3b分别表示正常受试者、心力衰竭患者和心肌梗塞患者血浆中N-BNP和ORP150水平经自然对数变换的盒形图。
图4a和4b分别表示两种性别的正常受试者和心力衰竭患者血浆中N-BNP和ORP150水平经自然对数变换的盒形图。
图5a和5b分别表示男性和女性血浆中N-BNP和ORP150水平与心力衰竭严重程度(由NYHA类别判定)的关系。
图6表示单独利用N-BNP或ORP150和利用衍生于联合N-BNP和ORP150自然对数模型的预后指数进行心力衰竭诊断的受试者工作特征曲线。
图7表示心肌梗塞发作后的患者血浆中N-BNP和ORP150与Killip类别的关系。
图8表示心肌梗塞发作后的患者血浆中N-BNP和ORP150与左心室功能的关系，其中左心室功能通过超声心动图评价。心室功能分类为正常、轻度、中度或重度受损。
图9表示心肌梗塞发作后患者的N-BNP和ORP150水平与临床死亡结果的比较。
图10表示心肌梗塞发作后患者N-BNP和ORP150水平与由于心力衰竭再入院的临床结果的比较。
图11a和11b表示心肌梗塞发作后患者的存活率分析，将患者按低于或高于血浆N-BNP或ORP150的中值来分组。
图12表示心肌梗塞发作后患者的存活率分析，将患者按血浆N-BNP和ORP150水平都低于或高于中值来分组，同时还有一个其中两种肽之一高于其中值的中间组。
图13表示不稳定型心绞痛/非ST升高型心肌梗塞患者的N-BNP和ORP150水平与临床死亡结果的比较。
图14表示不稳定型心绞痛/非ST升高型心肌梗塞患者的存活率分析，将患者按低于或高于血浆N-BNP或ORP150水平的中值来分组。
图15表示不稳定型心绞痛/非ST升高型心肌梗塞患者的存活率分析，将患者按血浆N-BNP和ORP150水平都低于或高于中值来分组，同时还有一个其中两种肽之一高于其中值的中间组。
图16表示人ORP150的氨基酸序列。
图17表示正在进行冠脉气囊血管成形术治疗的患者血浆中ORP150和BNP(脑钠尿肽-32)的水平。
实施例1研究人群研究了120名心力衰竭患者，全部经超声心动图证实患有左心室收缩功能障碍(左室(LV)射血分数＜45％)。另外还补充了373名心肌梗塞患者。急性心肌梗塞定义为具有三种标准指标中的至少两种，三种标准指标是适当的症状、急性ECG梗塞性变化(ST升高，新的左束支传导阻滞LBBB)和肌酸激酶(CK)升高至至少为正常上限的两倍即＞400IU/L。还对心肌梗塞患者中的177名进行了超声心动图研究，将收缩功能分为正常、轻度功能障碍、中度功能障碍和重度功能障碍。通过广告在当地社区内招募年龄和性别相匹配且LV射血分数＞50％的正常对照受试者。全部受试者均提交了参加这项研究的知情同意书，并经过了地方伦理委员会的批准。
心肌梗塞患者的终点终点的定义为全部原因引起的死亡和标准入院治疗出院后心血管疾病的发病率(由于心力衰竭而重新入院)。在对随访期间临终患者进行检查之后，对除死亡之外的全部终点进行多变量分析。
血样采集和血浆提取对于正常受试者和心力衰竭患者，床上静息15分钟后，将20ml的外周静脉血直接抽入预先冷冻过的含有500IU/ml抑酞酶的Na-EDTA(1.5mg/ml血)试管中。对于心肌梗塞患者，于症状发作后72-96小时之间单次采集血样。将血样在4℃、3000rpm下离心15分钟后，分离血浆并储存于-70℃直至测定。测定之前，将血浆在C18Sep-Pak(Waters)柱上提取并在离心蒸发仪中干燥。对于心力衰竭患者还收集了一些尿样本。这些样品也在如上所述的C18Sep-Pak(Waters)柱上提取。
ORP150测定法与人ORP150N-末端结构域(氨基酸33-45)序列(LAVMSVDLGSESM)相对应的肽(Ikeda等，Biochem Biophys Res Commun 1997；23094-9)由Leicester大学MRC毒理学系合成。氨基酸1-32可能代表了该蛋白的信号序列而且可能不存在于成熟的ORP150蛋白中。通过将马来酰亚胺与该序列C-末端上增加的一个半胱氨酸偶联，将匙孔血蓝蛋白与该肽连接起来，并每月向家兔注射。血清中的IgG经蛋白质A凝胶柱纯化。还将上述肽利用生物素-马来酰亚胺在含有(单位mmol/l)NaH2PO4100、EDTA5，pH7.0的缓冲液中生物素化2小时。用过量的半胱氨酸使反应停止后，将示踪物在HPLC上用乙腈梯度纯化。或者，可通过合成的方法在上述肽的C-或N-末端引入生物素化的氨基酸用作示踪物。将血浆提取物和标准品用含有(单位mmol/l)NaH2PO41.5、Na2HPO48、NaCl 140、EDTA1和(单位g/l)牛血清白蛋白1、叠氮化合物0.1的ILMA(免疫发光光度测定法)缓冲液重新溶解。将ELISA盘用100ng抗家兔IgG(Sigma Chemical Co.，Poole，UK)在100μl 0.1mol/l pH 9.6碳酸氢钠缓冲液中的溶液铺膜。用0.5％牛血清白蛋白在碳酸氢盐缓冲液中的溶液封闭各孔。在孔中通过将200ng该IgG与标准品或样品进行预培养来准备进行竞争性免疫发光光度测定法。培养过夜后，向孔中加入50μl稀释的生物素化ORP肽示踪物(2μl/ml贮备液或总量为100-500fmol)。在4℃下再培养24小时后，用洗涤液(NaH2PO41.5mmol/l、NaH2PO48mmol/l、NaCl 340mmol/l、Tween 0.5g/l、叠氮化钠0.1g/l)将各孔洗涤三次。用吖啶甲酯(MAE)标记的链霉抗生物素按照已述方法(Ng等，Clinical Science 2002；102411-416)合成。将各孔用100μl含有链霉抗生物素-MAE(每孔5百万相对光度单位)的ILMA培养2小时。进一步洗涤后，通过先后注射100μl 0.1M硝酸(与H2O2)和100μl NaOH(与溴化十六烷铵)在Dynatech MLX光度计中检测化学发光。检测下限(定义为3倍零肽浓度标准偏差)为每管9.8fmol或者98fmol/ml经提取的血浆。2、30、500fmol/管的测定法内变异系数分别为3.1、4.3和5.9％。从前证实在心力衰竭中升高的肽如ANP、BNP、N-末端BNP前体或CNP未发现有交叉反应性。
N-BNP测定法N-末端BNP前体的测定法是基于Karl等在Scand J Clin Lab InvestSuppl 1999；230177-181中所描述的非竞争性N-末端BNP前体测定法。培养针对人N-末端BNP前体的N-末端(氨基酸1-12)和C-末端(氨基酸65-76)的兔多克隆抗体。将血清中的IgG在蛋白质A凝胶柱上纯化。针对C-末端的抗体(每个ELISA盘孔100μl中含0.5μl)是作为捕获抗体。N-末端抗体经亲合纯化后生物素化。在4℃下、在涂覆C-末端抗体的孔中将样品或N-BNP标准品的等分部分(20μL)与生物素化抗体培养24小时。洗涤后向每孔中加入标记了吖啶甲酯的链霉抗生物素(链霉抗生物素-MAE，5×106相对光度单位/ml)(Ng等，Clinical Science 2002；102411-416)。用Dynatech MLX光度计读盘，方法如前所述(Ng等，Clinical Science 2002；102411-416)。检测下限为5.7fmol/ml未提取血浆。测定法内和测定法间变异系数是可接受的，分别为2.3％和4.8％。与ANP、BNP或CNP无交叉反应性。
血浆提取物的分子排阻色谱法和凝胶电泳法将血浆提取物用恒溶剂分子排阻色谱柱分离纯化，色谱柱为300×7.8mm Bio-Sep SEC S2000柱(Phenomenex，Macclesfield，Cheshire，UK)，流动相为50mmol/l NaH2PO4(pH 6.8)，流速为1ml/min。用于确定分子量的标准品包括IgG(150kD)、BSA(68kD)、卵白蛋白(44kD)、大豆胰蛋白酶抑制剂(20kD)、抑肽酶(6.5kD)和色氨酸(204D)(来自Sigma Chemical Co，Poole，UK)。将每20秒钟收集的级分在离心蒸发仪上干燥，然后如上所述测定ORP150。
统计分析统计分析利用SPSS 11.0版本(SPSS Inc，Chicago，MI)进行。数据表达为平均值±SEM或对于非高斯分布的数据表达为中值(范围)，在分析前将数据转换为对数。对于连续变量使用单项方差分析(ANOVA)。多个独立变量的相互作用通过单变量的一般线性模型方法探寻，并报告最小显著性差异P值。执行Pearson相关性分析并建立盒形图，包括中值、代表四分位数间范围的盒形和代表第2.5到第97.5百分位数的细线。P值小于0.05被认为是显著的。Kaplan Meier存活率分析被用来检验肽水平在MI后风险分层中的有用性。
结果和讨论ORP150测定法的性能图1所示为ORP150肽典型的标准曲线，它表明随着肽浓度的升高化学发光减弱。示踪物结合半数被取代发生在每管约300fmol。心力衰竭患者的血浆和尿液提取物经稀释后显示与标准曲线平行。检测下限为9.8fmol/管。
此外，对人血浆提取物进行了恒溶剂分子排阻色谱法分析(图2)。它分离成为3个主要免疫反应性级分，一个峰在150kD(这是预期的人ORP150蛋白的分子量)，一个较小的峰在6.7至7.4kD，最大的峰在1.8至3.3kD。这表明从血浆中提取的ORP150是断裂的，因此可能存在可用其它抗原表位特异性抗体检测的其它片段。
在人体内检测ORP的结论特异性ORP免疫测定法已经检测到该肽在血浆和尿液中的存在。由于ORP150是一种与内质网相结合的蛋白，这个发现是出乎意料之外的。而且，血浆中的免疫反应性是从几种分子量形式衍生而来，这表明利用抗原表位特异性抗体可能能够检测到ORP150片段。
正常受试者、心力衰竭和心肌梗塞患者中的ORPI50正常受试者、心力衰竭(HF)和心肌梗塞(MI)患者的特征如表1所示。各组的性别经过适当的匹配。虽然MI组的年龄大于其它组(P＜0.001)，但正常组和HF组的年龄是匹配的。分析前肽水平通过对数变换进行标准化。图3显示了正常组、HF和MI患者组的N-BNP和ORP150水平。经ANOVA分析，Log N-BNP(P＜0.0005)和Log ORP150(P＜0.0005)在三组间差异显著。对于N-BNP，HF和MI患者的水平均高于正常患者水平(P＜0.0005，用Tukey′s检验进行多重比较)，但HF和MI组的水平是可比的(P值不显著)。对于ORP150，HF和MI患者水平均高于正常患者水平(P＜0.0005，用Tukey′s检验进行多重比较)。HF组的水平也显著的高于MI组水平(P＜0.0005)。
表1.所研究患者的特征。报告值为平均值[范围]
心力衰竭中的ORP150正常组中N-BNP存在年龄依赖性的变化(相关系数r＝0.438，P＜0.0005)。然而，ORP150与年龄并没有显著相关性。结合正常组和HF组，N-BNP又与年龄相关(r＝0.306，P＜0.0005)，而ORP150与年龄的相关性稍小(r＝0.138，P＜0.02)。
图4显示了正常组和HF组中两种性别的N-BNP和ORP150水平。HF组中男性和女性的肽水平均有所升高(两者均为P＜0.0005，使用单变量一般线性模型(GLM)方法)。两种肽在HF组中的升高与用NYHA类别判定的HF的严重程度有相关性。
图5显示了两种性别中的两种肽都是随着NYHA类别的升高而增加。对于N-BNP，正常受试者的值与NYHA类别I、II、III和IV均有差异(全部为P＜0.0005，使用Tukey′s检验)。对于ORP150，正常受试者的值与NYHA类别I、II、III和IV均有差异(分别为P＜0.002、0.0005、0.0005、0.0005，使用Tukey′s检验)。
利用单变量GLM方法，入选年龄作为协同变量，性别和NYHA类别作为因素，心力衰竭患者的对数标准化N-末端BNP前体水平分析得出该模型的r2为0.675(P＜0.0005)，年龄、性别和NYHA类别为显著性预测变量(全部P＜0.0005)。性别和NYHA类别之间存在显著的相互作用，这表明随着NYHA类别的升高N-BNP的增加可能在男性和女性间会有差异(P＜0.007)。对于对数标准化ORP150数据进行的类似分析得出该模型的r2为0.512(P＜0.0005)，而只有NYHA类别是显著性预测变量(P＜0.0005)。虽然性别与NYHA类别之间存在显著的相互作用(P＜0.001)，但年龄和性别都不是显著性预测变量，这再一次表明随着NYHA类别的升高ORP150的增加在男性和女性之间有差异。虽然大部分HF患者的病因是缺血性心脏�。谜庑╇募觳釮F却与其病因无关。
例如，若将956fmol/ml作为ORP150的临界值，基于以上所述的血浆提取物的测定技术这个水平可诊断出95％的HF病例，特异性为39.4％。这样，在该例中ORP150的阳性预测值为51.1％而阴性预测值为92.2％。使用这样的临界值可以有效的在诊断中排除HF。
这样的临界值可能会受到测定法的影响，对于新的ORP150测定法，无论是竞争性的或非竞争性的，无论使用或不使用肽或蛋白标准品(参见以下测定法注解)，都应建立新的临界值。
下面列出了用于HF诊断的各种灵敏度的N-BNP和ORP150的临界值(单位fmol/ml)，并且报告了其特异性。
表II.用于诊断心力衰竭的N-BNP和ORP150的临界值，单位为fmol/ml
逐步对数回归分析被用来预测HF存在与否，以N-BNP和ORP150的对数作为预测变量。之所以没有使用年龄和性别是因为正常组与HF组是经过年龄和性别匹配的。N-BNP(肽水平升高50％的优势比为1.56，肽水平升高10倍的优势比为12.29，P＜0.0005)和ORP150(肽水平升高50％的优势比为2.46，肽水平升高10倍的优势比为163.98，P＜0.0005)都是独立的预测HF存在的指标，无论是使用正向或反向的逐步分析方法，它们的总r2(Cox和Snell)为0.55，Nagelkerker2为0.74。
对数回归包括将数据拟合于形式为“logit(p)＝a+b1x1+b2x2+b3x3+...”的方程中，其中logit(p)＝loge(p/(1-p))，p代表患有HF的概率，a是常数，b1和b2代表被变量x1和x2(在该例中x1和x2为log10(N-BNP)和log10(ORP150))所乘的系数。该模型可通过测量然后输入log10转换的N-BNP和ORP150水平来计算发生心力衰竭的概率。
logit(p)＝-21.642+2.509*log10(N-BNP)+5.1*log10(ORP150)如此，如果p大于0.102，则检测到HF的灵敏度为95％，特异性为68.3％。注意用这种算法检测心力衰竭比单独使用两肽中的任何一种检测的特异性都高(灵敏度为95％时，N-BNP和ORP150的特异性仅分别为40.6％和39.4％)。
由上述模型导出的预后指数(成为HF组成员的概率)被用来构建受试者工作特征(ROC)曲线(图6)。用于鉴别HF时该模型的ROC面积为0.95，大于单独的N-BNP(0.91)或ORP150(0.84)。
下表报告了该对数模型通过以上算法利用log10转换的N-BNP和ORP150水平确定的各种概率临界值的灵敏度和特异性。根据计算者期望HF诊断的灵敏度最大化还是特异性最大化，他可以选择该模型不同的概率临界值。
表III.对数模型对概率临界值的灵敏度和特异性
心力衰竭中ORP150的结论这些发现表明虽然在HF中N-BNP和ORP150都有所升高(并且随着HF严重程度的增加而升高)，但N-BNP更多地受受试者年龄和性别的影响(随年龄升高而升高，在女性中水平较高)。相比之下，ORP150则没有年龄依赖的成分，受性别影响也不大。虽然两种肽都可以有效地鉴别HF，但是若将两者相结合则可能将二者诊断HF的潜力相加合。
心肌梗塞中的ORP150心肌梗塞(MI)组患者的特征如表1所示，虽然该组性别与正常组是匹配的但年龄比正常组稍大(P＜0.0005)。心肌梗塞后2-3天采集的血浆中N-BNP和ORP150均有升高(两者都是P＜0.0005，图3)。N-BNP水平与肌酐激酶峰值水平有相关性(r＝0.24，P＜0.0005)，这可表明其与梗塞大小的关系。然而，ORP150水平与肌酐激酶峰值水平没有显著相关性(r＝0.05，P不显著)。
N-BNP与年龄(r＝0.39，P＜0.0005)和肌酐(r＝0.38，P＜0.0005)均有相关性，即使考虑到性别和梗塞的影响，部分相关系数仍保持显著(与年龄(r＝0.39，P＜0.0005)，与肌酐(r＝0.36，P＜0.0005))。相比之下，ORP150与年龄没有显著相关性，与肌酐只有很弱的相关性(r＝0.20，P＜0.0005)，若考虑性别和梗塞的影响，部分相关系数则进一步降低(与肌酐(r＝0.12，P＜0.007)。
利用逐步线性回归分析以年龄和肌酐为协同变量，以MI存在与否和性别为因素求解对数标准化的ORP150的行列式。只有MI存在与否(P＜0.0005)和肌酐(P＜0.004)为ORP150水平的显著独立预测变量，占总差异的14％(P＜0.0005)。对N-BNP水平进行类似的分析，确定了年龄、性别、肌酐和MI存在与否均为显著的独立预测变量(全部P＜0.0005)。因此，这一发现证实了在HF组中，ORP150水平不象N-BNP水平那样容易受年龄和性别的影响。
我们使用了对数回归分析以MI存在与否作为因变量，以年龄、性别、N-BNP和ORP150作为自变量来预测MI的存在。通过正向和反向逐步回归分析全部4个自变量都确定为预测MI存在与否的独立预测变量，该模型的r2为0.56(Cox和Snell)或0.79(Nagelkerke)。优势比如下对于N-BNP(肽水平升高50％为1.94，P＜0.0005)；对于ORP150(肽水平升高50％为1.61，P＜0.0005)。
血浆中N-BNP水平与患者的Killip类别有关(图7，P＜0.0005)。与之相反，全部MI患者的ORP150水平均有所升高而与Killip类别无关(图7)。在进行了超声心动图扫描的177名患者中，我们发现N-BNP水平与LV功能障碍的程度有关(图8，P＜0.0005)。而ORP150水平则相反，其在全部MI患者中均有所升高而与LV功能障碍的程度无关，甚至LV功能看似“正常”的患者ORP150水平也有升高(图8)。
MI后果我们调查了MI发作后所有原因的死亡率和由于心力衰竭引起的再入院率，以研究ORP150在预测这些结果上的有用性。出院后的随访期为5-764天，平均为426天。在这367例中，有39例在随访期间死亡，还有22例由于心力衰竭而再次入院。
死亡患者的N-BNP和ORP150水平显著升高(分别为P＜0.0005和P＜0.001，图9)。此外，那些后来由于心力衰竭而再入院的患者的两种肽的水平均有升高(对于N-BNP P＜0.0005，对于ORP150，P＜0.025，图10)。
我们利用对数回归分析，用年龄、肌酐、既往梗塞病史、Killip类别和logN-BNP或LogORP150来研究死亡作为一种后果的预测变量。死亡的显著预测变量包括N-BNP(肽水平升高10倍的优势比为3.95，P＜0.002)和ORP150(肽水平升高10倍的优势比为4.58，P＜0.05)，其Nagelkerke r2为0.32。正向和反向回归分析证实了这两个独立预测变量，但是需要肌酐的协助(升高10倍的优势比为19.56，P＜0.05)。这些发现表明ORP150是不依赖于N-BNP水平的MI后死亡率的预测变量。
为证实这些发现，我们进行了Kaplan Meier存活率分析。当把受试者分为低于中值组和高于中值组时，无论使用的肽是N-BNP(趋向时序检验P＜0.0005)还是ORP150(趋向时序检验P＜0.002)，这两组之间的存活率均存在显著差异(图11)。重要的是，即使在单独由N-BNP或ORP150定义的低于中值组中也存在着确定的死亡率(虽然较高于中值组低)。我们利用按N-BNP和ORP150水平定义的组的排序，得出一个全新的预后指数，将患者分为3组(两种肽均低于中值、两种肽之一高于中值和两种肽均高于中值)。图12表示了用这种新预后指数进行的存活率分析，它表明观测期内两种肽均低于中值的组中无患者死亡，两种肽均高于中值的患者死亡率很高，而两种肽之一高于中值的患者的死亡率居间(趋向时序检验P＜0.0005)。
MI中ORP的结论在缺血性心脏病中，血浆ORP150水平与在心肌梗塞中所显示的相同，同样有所升高。N-BNP的水平在这些患者中也有升高，但与之不同的是，ORP150水平对年龄、LV功能障碍、症状和体征(如通过Killip类别所确定的)和肾功能的依赖性较小。两种肽对于由于心肌梗塞而标准入院治疗的后果如死亡率或由心力衰竭引起的再入院率都是很好的预测变量。尤其是将两种肽结合起来对心肌梗塞后的风险分层(死亡率预测)特别有用。
血管疾病中关于ORP的全部结论上述数据证明了ORP150是被分泌到人血浆中的而且也可以在尿液中发现。体液中可能存在ORP150片段。ORP150水平在心力衰竭和缺血性心脏病中均升高，它的测量不易受年龄和性别的干扰。由于动脉粥样硬化是引发血管疾病的主要原因，ORP150可能在其它存在组织缺氧的病症如中风、外周血管疾病、动脉瘤或急性冠脉综合征的诊断和预后中有用。在心力衰竭中，除了它本身作为诊断辅助工具之外，它还可作为N-BNP测量的补充。在心肌梗塞中，它可作为预后指标，既预测死亡率也预测由于心力衰竭引起的再入院率。无论独立地或是与N-BNP相结合，对它的测量是心肌梗塞后风险分层有效的辅助工具，这种风险分层能够检测出风险极低或极高的患者群。这可能会影响患者治疗选择的规划。
实施例2另外对114名不稳定型心绞痛或非ST升高型心肌梗塞(心内膜下心肌梗塞，定义为肌酐激酶水平升高至正常上限2倍以下)患者进行了研究。所有患者均有休息时的胸痛并进行入院治疗。平均(范围)年龄为66.8岁(38-93)，男性74名，女性40名。血样于入院后3-5天采集，利用如实施例1中祥述的方法分析肌钙蛋白T(Roche Diagnostics)、ORP150蛋白和N-BNP水平。
对患者进行如实施例1中所述的心肌梗塞患者终点的随访。
在平均为401天(范围26-764天)的随访期中发生了9例死亡。与存活患者的肌钙蛋白T水平(0.19(0.005-0.557)μg/L)相比，肌钙蛋白T水平在死亡的患者中未见显著差异(0.12(0.005-1.14)μg/L)。
与之相反，与存活的患者相比，ORP150和N-BNP水平在死亡的患者中显著升高(分别为P＜0.006和P＜0.05，图13)。
利用N-BNP和ORP150水平(低于或高于中值)通过Kaplan Meier存活率分析进行病例分层。当受试者被分为低于中值组和高于中值组时，无论所用的肽是N-BNP(趋向时序检验P＜0.016)还是ORP150(趋向时序检验P＜0.015)，这两组间的存活率均存在显著差异(图14)。当同时用两种肽将患者分为3组时(两种肽都低于中值、两种肽之一高于中值和两种肽都高于中值)，存活率分析表明两种肽都低于中值的患者在观察期内无死亡发生，而两种肽都高于中值的患者死亡率很高(趋向时序检验P＜0.002，图15)。因此，与在ST升高型心肌梗塞(如上所述)患者中所述相似，这个新的不稳定型心绞痛/非ST升高型心肌梗塞预后指数使风险分层成为可能。
利用如上所述的提取样品的竞争性测定技术，得到在这个具体实施例中ORP150水平的中值为1680fmol/ml。对于使用不同标准品的其它测定形式，可确定不同的中值临界值(参见以下方法注释)。
不稳定型心绞痛/非ST升高型MI中ORP的结论与不稳定型心绞痛/非ST升高型MI中所显示的相同，血浆ORP150和N-BNP水平在缺血性心脏病中有所升高。两种肽都是后果如死亡率的很好的预测变量。尤其是将两种肽相结合后对不稳定型心绞痛/非ST升高型MI(死亡率预测)后的风险分层特别有用。使用这样的预后指数将使死亡风险高的患者能够进行再血管形成术或药理试剂治疗。
实施例中建立ORP150临界值方法的注释以上祥述的临界值是基于血浆中的ORP150提取物，使用由CLAVMSVDLGSESM组成的肽标准品，其中LAVMSVDLGSESM衍生于ORP150序列的N-末端。由于N-末端有一个半胱氨酸(以在第一个实施例中生成用于免疫的结合物)，该肽倾向于形成二聚体。标准品中二聚体和单体比例的不确定会导致免疫反应性的差异，并因此造成实际临界值的差异。
当用完整的蛋白序列作为标准品(例如全长ORP150)时，或将上述肽CLAVMSVDLGSESM用二硫苏糖醇还原并与N-乙基马来酰胺反应以防止形成二聚体时，这种抗原表位对所产生的抗体的免疫反应性可能不同，因此临界值也可能不同。对于不同的标准品或不同的测定形式(例如非竞争性形式与竞争性形式相比)，需要应用的校正因子可能会高达上面提及的临界值的10-100倍。但是，很可能临界值会在10-10,000fmol/ml范围内，并且为了将每个新的测定法应用于实施例中所述的用途，我们可能需要对每个特定的目的(诊断或预后)赋予新的测定法自己的临界值。如上述实施例中所说明的，这些临界值还会随着该测试是用于诊断心力衰竭，还是用于预估心肌梗塞或不稳定性心绞痛后的预后而不同。
实施例3对19名患有冠状动脉疾病并正在接受气囊血管成形术以治疗动脉粥样硬化的患者进行了急性梗阻在气囊血管成形术中对冠脉循环的影响的评价。在进行血管成形术之前和之后2小时、6小时和12小时采集血浆。用如上所述的方法测量ORP150水平。此外还利用免疫发光光度测定法在C18柱上测量了一种已知的指示心室壁应激的心脏指标、即B型或脑钠尿肽(BNP)的水平，已知这种心脏指标的水平在其它冠脉闭塞事件如心肌梗塞后会升高。
图17显示了血管成形术后血浆中ORP150水平的变化并与BNP水平的变化相比较。两种指标随时间均有显著的变化(多次测量方差分析P＜0.001)。此外，两种肽水平都在血管成形术后2小时达到峰值，此后降回至基线水平。ORP150水平在2小时处的峰值与基线水平(P＜0.02)和6小时及12小时的水平(两者均为P＜0.001)均有显著差异。对于BNP，在2小时处的峰水平与基线水平(P＜0.001)和6小时及12小时的水平(两者均为P＜0.005)均有差异。
气囊阻塞后ORP150水平的快速升高表明它可以作为冠脉循环急性阻塞如心肌梗塞或其它急性冠脉综合征(例如非ST升高型心肌梗塞或不稳定型心绞痛)的指标。
权利要求
1.一种用于在哺乳动物中对组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征进行筛选、诊断或预后，用于在哺乳动物中确定组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征所处的阶段或其严重程度，用于鉴别存在发展为组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的风险的哺乳动物，或者向患有组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的哺乳动物实施治疗后用于监测治疗的效果的方法，所述方法包括测量所述哺乳动物体液样本中第一指标的水平，其中所述第一指标为氧调蛋白(ORP150)或其片段。
2.权利要求1所述的方法，其中的体液为血浆。
3.权利要求1或2所述的方法，其中将第一指标的水平与指示未发生组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的第一指标的水平相比较。
4.权利要求3所述的方法，其中指示未发生组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的第一指标的水平是一个或多个未患有组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的哺乳动物的第一指标的水平，或者是预先测定的未患有组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的哺乳动物的第一指标的参考范围。
5.前述任一权利要求所述的方法，其中第一指标的水平通过将样品与一种特异性结合第一指标的抗体相接触，并测量抗体与样品中至少一种物质间发生的结合来测定。
6.权利要求5所述的方法，其中的抗体为单克隆抗体。
7.前述任一权利要求所述的方法，其中指示组织缺氧的临床综合征为心力衰竭或缺血性心脏病。
8.权利要求7所述的方法，另外包括测量指示心力衰竭或缺血性心脏病的第二指标。
9.权利要求8所述的方法，其中第二指标为一种钠尿肽。
10.权利要求9所述的方法，其中的钠尿肽为脑钠尿肽(BNP)或N-末端脑钠尿肽前体(N-BNP-)。
11.权利要求8、9或10所述的方法，其中将第二指标的水平与指示未发生组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的第二指标的水平相比较。
12.权利要求11所述的方法，其中指示未发生组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的第二指标的水平是一个或多个未患有组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的哺乳动物的第二指标的水平，或者是预先测定的未患有组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的哺乳动物的第二指标的参考范围。
13.权利要求8至12中任一项所述的方法，其中第二指标的水平通过将样品与一种特异性结合第二指标的抗体相接触，并测量抗体与样品中至少一种物质间发生的结合来测定。
14.权利要求13所述的方法，其中的抗体为单克隆抗体。
15.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中指示组织缺氧的临床综合征为动脉粥样硬化、缺血性休克、大动脉瘤、外周血管疾病、肺部疾病或肿瘤生长。
16.用于实施前述任一权利要求中所述的方法的试剂盒。
17.一种用于在哺乳动物中对组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征进行筛选、诊断或预后，用于在哺乳动物中确定组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征所处的阶段或其严重程度，用于鉴别存在发展为组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的风险的哺乳动物，或者向患有组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的哺乳动物实施治疗后用于监测治疗的效果的试剂盒，所述试剂盒包含从所述哺乳动物采集体液样品的说明书；和一种或多种用于测量样品中氧调蛋白(ORP150)或其片段的水平的试剂。
18.权利要求17所述的试剂盒，其中的体液为血浆。
19.权利要求17或18所述的试剂盒，其中的一种或多种试剂含有与第一指标特异性结合的抗体。
20.权利要求19所述的试剂盒，其中的抗体为单克隆抗体。
21.权利要求17至20中任一项所述的试剂盒，其中指示组织缺氧的临床综合征为心力衰竭或缺血性心脏病。
22.权利要求21所述的试剂盒，另外包含一种或多种用于测量指示心力衰竭或缺血性心脏病的第二指标的水平的试剂。
23.权利要求22所述的试剂盒，其中的第二指标是一种钠尿肽。
24.权利要求23所述的试剂盒，其中的钠尿肽为脑钠尿肽(BNP)或N-末端脑钠尿肽前体(N-BNP)。
25.权利要求22、23或24所述的试剂盒，其中用于测量第二指标的一种或多种试剂含有与第二指标特异性结合的抗体。
26.权利要求25所述的试剂盒，其中的抗体为单克隆抗体。
27.权利要求17至20中任一项所述的试剂盒，其中指示组织缺氧的临床综合征为动脉粥样硬化、缺血性休克、大动脉瘤、外周血管疾病、肺部疾病或肿瘤生长。
全文摘要
本发明提供了一种用于在哺乳动物中筛选、诊断或预后组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征，用于在哺乳动物中确定组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征所处的阶段或其严重程度，用于鉴别存在发展为组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的风险的哺乳动物，或者向患有组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的哺乳动物实施治疗后用于监测治疗的效果的方法和试剂盒。通过测量所述哺乳动物体液样品中氧调蛋白(ORP150)或其片段的水平来提供关于组织缺氧或指示组织缺氧的临床综合征的信息。
文档编号G01N33/577GK1742205SQ200380109053
公开日2006年3月1日 申请日期2003年11月21日 优先权日2002年11月21日
发明者L·额 申请人:因沃耐斯瑞士医学有限公司
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