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专利名称：胃癌的检测标志物的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症的检测。具体地，本发明涉及遗传和/或蛋白质标志物用于检测癌症的用途，并且更特别地，涉及遗传和/或蛋白质标志物用于检测胃癌的用途。背景在早期检测到癌症并得到治疗时，癌症患者的存活得到很大程度的提高。在胃癌的情况中，与诊断为晚期疾病患者大约10%的5-年存活率相比，诊断为早期疾病的患者具有90%的5-年存活率。然而，大多数胃癌患者通常患有晚期疾病。因此，导致胃癌早期诊断的发展可以导致改善的患者预后。生物样品中特定癌症相关标志物的鉴定可以提供癌症早期诊断的有价值的方法， 导致早期治疗和提高的预后，所述生物样品包括体液，例如，血液、尿液、腹膜冲洗液和粪便提取物。特定癌症标志物还可以提供监测疾病进展的手段，能够追踪外科手术治疗、放疗和化疗的疗效。然而，对于许多主要的癌症，可用的标志物存在灵敏度和特异性不足的问题。 例如，对于胃癌最常用的标志物cal9-9、ca72-4和癌胚抗原(CEA)只能检测出约15-50% 的任一阶段的胃肿瘤，对于早期疾病，降至大约2-11%。因此，存在非常高频率的可导致患者和保健医生认为不存在疾病的假阴性测试，然而实际上，患者患有需要立即注意的严重癌症。此外，这些标志物在高达1/3受到良性胃病影响的个体中产生假阳性信号。发明概述本发明的几个方面提供了可以提供早期癌症检测并且降低假阳性和假阴性测试结果频率的方法、组合物和装置。在特定的实施方案中，分子分析可以用于鉴定在胃肿瘤组织中与非恶性胃组织相比高表达，但不必定是过表达的基因。这样的分析包括微阵列和定量聚合酶链式反应 (qPCR)方法。癌症基因、RNA以及由那些基因编码的蛋白质在此称为胃肿瘤标志物(GTM)。 将理解术语GTM不需要标志物只对胃肿瘤是特异性的。而是，GTM的表达在其他类型的肿瘤中得到提高，所述肿瘤包括恶性或非恶性肿瘤，包括胃癌、膀胱癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、皮肤癌(例如，黑素瘤)、肝癌、食道癌、子宫内膜癌和脑癌。然而，应当理解，术语GTM 不包括现有技术的标志物，如CA19-9、CA72-4、胃蛋白酶原和CEA，或任何其他之前已经鉴定为表示胃肿瘤的标志物。从肿瘤中分泌或逸出一些GTM，其水平足以以高度可靠性来诊断胃癌，并且在其他情况中，两种或多种GTM的测量可以提供可靠的胃癌诊断。由细胞分泌或裂解出来的蛋白质，单独或互相结合，具有作为用于胃癌诊断的血清或体液标志物或作为用于监测已确定疾病进展标志物的效用。可以使用本领域已知的方法，并且包括使用单克隆抗体、多克隆抗血清等，来进行蛋白质标志物的检测。具体地，本发明提供了一种用于检测胃癌的方法，包括(i)提供生物样品；和(ii)检测所述样品中人酶原粒蛋白16( “ZG16”)的水平。在一个方面中，患者中ZG16的过表达表示患者患有胃癌。根据本发明的其他GTM家族成员可以选自黏蛋白5AC( “MUC5AC”)或黏蛋白17 (“MUC17")。该方法可以涉及 ZG16 和 MUC5AC、ZG16 和 MUC17，或 ZG16 和 MUC5AC 和 MUC17 的检测。所述其他GTM家族成员还可以包含一个或多个更多的GTM家族成员，例如， MUC5AC、MUC17、ZG16、羧肽酶 N、多肽 2，83kDa 链(CPN2)、基质金属蛋白酶 12 (MMPU)、抑制素(“讯冊々”)、胰岛素样生长因子7( “IGFBP7”)、Y-谷氨酰水解酶(“GGH”)、富含亮氨酸脯氨酸的蛋白聚糖(“LEPRE1”)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cyStatin)S( “CST4”)、 分泌型卷曲相关蛋白4( “SFRP4”)、aSp0rin( “ASPN”)、具有EF手型结构域的细胞生长调节剂1( “CGREF1”)、激肽释放酶IO(KLKlO)、金属蛋白酶的组织抑制剂1( “TIMP1”)、 分泌型酸性富含半胱氨酸蛋白(“SPARC”)、转化生长因子，13-诱导的(“TGFBI”)、 含有EGF的fibulin-样胞外基质蛋白2( “EFEMP2”)、基膜聚糖(lumican) ( “LUM”)、 stannin ( “SNN”)、分泌型磷蛋白1( “SPP1 ”)、硫酸软骨素蛋白聚糖2 ( “CSPG2”)、N_酰基鞘氨醇酰胺水解酶(“ASAH1”)、丝氨酸蛋白酶11( “PRSS11”)、分泌型卷曲相关蛋白 2( “SFRP2”)J^^_A2，XIIB 组(“PLA2G12B”)、spondin2，胞外基质蛋白(“SP0N2”)、 嗅介蛋白(olfactomedin) 1 ( “0LFM1”)、含有血小板反应蛋白重复1 ( “TSRC1 ”)、血小板反应蛋白2( “THBS2”)、adlican、半胱氨酸蛋白酶抑制剂SA( “CST2”)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN( 乂511”)、赖氨酰氧化酶样酶2( “L0XL2”)、甲状腺球蛋白(“TG”)、转化生长因子 β 1( “TGFB1”)、丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂Clade H成员1 ( “SERPINH1 ”)、丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂Clade B成员5 (“SERPINB5”)、基质金属蛋白酶2 (“ΜΜΡ2”)、前蛋白 (proprotein)转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 5型(“PCSK5”)、乙酰透明质酸(hyaluronan) 糖蛋白连接蛋白 4 ( “ HAPLN4 ”)、CA19-9、CA72-4、胃蛋白酶原、CEA、MUC5AC 和 MUC17。根据本发明的组合GTM标志物的一个实例是MUC5AC、MUC17、ZG16、半胱氨酸蛋白酶抑制剂 SN、serpinHl 和 serpinB5。可以使用任何合适的用于检测GTM水平的方法，并且可以包括检测GTM mRNA、GTM cDNA的水平，使用与所述GTM cDNA的至少一部分互补的寡核苷酸，使用正向引物和反向引物的qRT-PCR方法，检测GTM蛋白的水平，检测GTM肽的水平，例如，使用针对所述GTM的抗体。可以使用任何合适的抗体，并且可以是单克隆抗体或多克隆抗血清。可以使用夹层型免疫试验方法或使用抗体芯片来进行该方法。本发明还提供了一种用于检测GTM的装置，其包括其上具有GTM捕获试剂的基质；和与所述基质相连的检测仪，所述检测仪能够检测与所述捕获试剂相结合的GTM。GTM捕获试剂可以是GTM寡核苷酸、GTM蛋白或GTM肽特异性的寡核苷酸或抗体。本发明的再一个方面是用于检测癌症的试剂盒，其包括其上具有GTM捕获试剂的基质；用于显现所述GTM捕获试剂和GTM的复合物的工具；和使用说明书，其中所述GTM包含人酶原粒蛋白16( “ZG16”)。GTM捕获试剂是对GTM寡核苷酸、GTM蛋白或GTM肽有选择性的GTM特异性寡核苷酸或GTM特异性抗体。本发明还提供了用于检测胃癌的方法，其包括步骤提供来自处于患有胃癌风险中的患者的测试样品；测量所述测试样品中GTM蛋白的存在；和
将所述测试样品中存在的GTM的量与获自未患有胃癌受试者的对照样品的值进行比较，其中所述GTM包含人酶原粒蛋白16( “ZG16”)。在进一步的方面中，本发明提供了一种用于筛选胃癌的方法，其包括步骤提供来自测试受试者的测试样品；测量所述测试样品中GTM的存在；和将所述测试样品中存在的GTM的量与获自未患有胃癌受试者的对照样品的值进行比较，其中所述GTM包含人酶原粒蛋白16( “ZG16”)。 GTM可以是GTM蛋白或肽，或GTM特异性的寡核苷酸。寡核苷酸可以是DNA或RNA。根据该方法，测量步骤可以使用ELISA试验。测试样品可以获自血浆、组织、尿液、胃液、血清和粪便。附图简述参照其特定实施方案和参照附图来描述本发明，其中

图1描绘了微阵列分析表，显示了在肿瘤组织中相对高表达的基因。将肿瘤组织和非恶性组织中每个基因的信号强度进行了分级。该表显示了比现有胃癌标志物CEA(由基因CEACAM5编码)具有更高等级的GTM。图2描绘了显示出抗体阵列分析中所用的血清样品特征的表。图3描绘了直方图，其显示了肿瘤和非恶性样品根据其(a)ZG16和(b)MUC17表达水平的分布。使用RT-qPCR获得了两个基因的表达水平。图4描绘了 boxplot，显示了使用抗体阵列和RCA检测的胃癌患者和对照的血清中 (a)MUC17 禾口 (b)ZG16 的检测。详述定义在详细描述本发明的实施方案之前，提供本文中所用术语的一些定义将是有用的。术语“GTM”或“胃肿瘤标志物，，或“GTM家族成员，，意思是与胃癌相关或另外鉴定与胃癌相关分子的基因、基因片段、RNA、RNA片段、蛋白质或蛋白质片段。作为本发明的一部分公开的GTM不包括现有技术中已知的与胃癌相关的分子，例如，CA19-9、CA72-4、胃蛋白酶原和CEA。然而，本发明的标志物可以与之前公开的GTM以新的和创造性的组合来一起使用。术语“标志物”指与生物学现象的存在定量或定性相关的分子。“标志物”的实例包括多核苷酸，如基因或基因片段、RNA或RNA片段；或基因产物，包括多肽，如肽、寡肽、蛋白质或蛋白质片段；或任何相关的代谢产物、副产物或任何其他鉴定分子，如抗体或抗体片段，不管是否与现象下的机理直接或间接相关。本发明的标志物包括如本文所公开的核苷酸序列(例如，GenBank序列)，特别是全长序列、其任何编码序列、任何片段或任何互补物， 以及上述定义的其任何可测量标志物。如本文所用，“抗体”及类似术语指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有特异结合抗原(与之发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。这些包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、FC、Fab、Fab，和Fal^2片段，以及Fab表达文库。抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD的任何一类，这些类别根据分子中存在的重链的性质而彼此不同。这些还包括亚类，如IgGl、IgG2等。轻链可以是κ链或λ链。本文提及的抗体包括所有类、亚类和类型。还包括嵌合抗体，例如，对超过一种的来源(例如，小鼠或人序列)是特异性的单克隆抗体或其片段。还包括驼类抗体(camelid antibody)、鲨鱼抗体或纳米抗体。术语“癌症”和“癌性的”是指或者描述了哺乳动物中通常以异常或失调的细胞生长为特征的生理状态。癌症和癌症病理可以与例如转移、干扰邻近细胞的正常机能、以异常水平释放细胞因子或其他分泌产物、抑制或加重炎性或免疫应答、瘤形成、癌前病变、恶性肿瘤、周围或远距离组织或器官如淋巴结的侵入等相关。特别包括的是黑素瘤。术语“肿瘤”指的是所有肿瘤细胞生长和增殖，不管恶性还是良性的，以及所有癌前和癌细胞和组织。术语“胃癌”指的是源自胃的肿瘤。这些肿瘤能够转移至任何器官。术语“差异地表达” “差异的表达”及相似短语是指相对于在对照受试者(例如， 参照样品)中的表达，在患有病症(特别是癌症，如黑素瘤)的受试者(例如，测试样品) 中的表达被激活至较高或较低水平的基因标志物。该术语还包括其表达在如下情况被激活至较高或较低的水平的标志物在相同疾病的不同阶段；在具有好或差的预后的疾病中； 或在具有较高或较低增殖水平的细胞中。差异表达的标志物可以在多核苷酸水平或多肽水平被激活或抑制，或可以接受选择性剪接而导致不同的多肽产物。例如，这些差异可以通过 mRNA水平、表面表达、多肽分泌或其他分配上的变化而得到证明。差异表达可以包括比较两个或多个标志物(例如，基因或其基因产物)间的表达； 或比较两个或多个标志物(例如，基因或其基因产物)间的表达比率；或比较相同标志物的两种不同加工的产物(例如，转录产物或多肽)，其在正常受试者和患病受试者之间不同； 或在相同疾病的不同阶段之间不同；或在具有好或差的预后的疾病之间不同；或在具有较高和较低增殖水平的细胞之间不同；或在正常组织和患病组织(特别是癌症或黑素瘤)之间不同。差异表达包括基因或其表达产物在例如正�：突疾∠赴�中、或在经历不同疾病事件或疾病阶段的细胞中、或在具有不同增殖水平的细胞中，在时间或细胞表达模式上的定量以及定性差异。术语“表达”包括多核苷酸和多肽的产生，特别地，从基因或基因的一部分产生 RNA(例如，mRNA)，且包括RNA或基因或基因的一部分编码的多肽的产生，以及与表达相关的可检测物质的出现。例如，例如从多肽-多肽相互作用、多肽-核苷酸相互作用等形成复合物，也包括在术语“表达”的范围内。另一个实例是结合配体，如杂交探针或抗体，与基因或其他多核苷酸或寡核苷酸、多肽或蛋白质片段的结合以及结合配体的显影。因此，微阵列、杂交印迹(如Northern印迹)，或免疫印迹(如Wfestern印迹)，或珠阵列上的，或通过 PCR分析的斑点强度，包括在生物分子下的术语“表达”的范围内。术语“表达阈值”和“限定的表达阈值”可以互换使用，并且指的是正谈论的标志物的水平，在该水平外，多核苷酸或多肽作为患者存活的预测标志物。阈值将取决于所建立的预测模型，所述模型从临床研究(如以下实施例中所述的那些)实验性地产生。根据所用的预测模型，设定表达阈值以获得最大的灵敏度，或最大的特异性，或最小的误差(最大的分类级别)。例如，设定较高的阈值，以获得最小误差，但这可能导致较低的灵敏度。因此， 对于任何给定的预测模型，将使用临床研究来设定通常获得最高灵敏度同时具有最小误差率的表达阈值。对于任何情况的表达阈值的确定在本领域技术人员的知识范围内。术语“灵敏度”意思是(通过模型)测试的患病个体为阳性的比例。因此，提高的灵敏度意味着较低的假阴性测试结果。术语“特异性”意思是(通过模型)测试未患病个体为阴性的比例。因此，提高的特异性意味着较低的假阳性测试结果。术语“微阵列”指的是捕获剂(优�。�多核苷酸(例如，探针)或多肽)在基质上的有序或无序排列。参见，例如，Microarray Analysis (微阵列分析)，M. Schena，John Wiley & Sons，2002 ;Microarray Biochip ^Technology (微阵列生物芯片技术)，Μ. Schena 编辑， Eaton Publishing, 2000 ；Guide to Analysis of DNA Microarray Data (DNA 微阵列数据分析指导)，S.Knudsen, John Wiley & Sons, 2004 禾口 Protein Microarray Technology, D. Kambhampati 'ΦΜ, John Wiley & Sons，2004。术语“寡核苷酸”指的是多核苷酸，通常是探针或引物，包括，但不限于，单链脱氧核糖核苷酸、单链或双链核糖核苷酸，RNA: DNA杂合体及双链DNA。寡核苷酸，如单链DNA探针寡核苷酸，经常利用化学方法来合成，例如，使用可购得的自动寡核苷酸合成仪，或通过多种其他方法，包括体外表达系统、重组技术以及在细胞和生物中的表达。术语“过表达”或“过表达的”指的是患者中高于正常组织中所看到的基因或标志物的表达水平。如果是正常组织中表达的1. 2,1. 3,1. 4,1. 5,1. 6,1. 7,1. 8,1. 9、2倍或高于 2倍，则认为表达是过表达的。术语“多核苷酸”，以单数或复数使用时，通常指的是任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。这包括，但不限于，单链和双链DNA、包括单链和双链区域的DNA、单链和双链RNA，以及包括单链和双链区域的RNA， 包含可以是单链或更一般地是双链或包括单链和双链区域的DNA和RNA的杂合分子。还包括包含RNA或DNA或既包含RNA又包含DNA的三链区域。特别包括mRNA、cDNA和基因组 DNA，及其任何片段。该术语包括包含一个或更多个修饰碱基(如，氚化碱基或稀有碱基，如肌苷)的DNA和RNA。本发明的多核苷酸可以包括编码或非编码序列，或正义或反义序列。 将理解本文中每次涉及“多核苷酸”或类似术语，将包括全长序列及其任何片段、衍生物或变体。如本文所用，“多肽”指的是寡肽、肽或蛋白质序列，或其片段，以及天然产生的、重组的、合成的或半合成的分子。其中本文引用的“多肽”指的是天然产生的蛋白质分子的氨基酸序列，“多肽”及类似术语不意味着限定氨基酸序列为全长分子的完整天然氨基酸序列。将理解本文中每次涉及“多肽”或类似术语，将包括全长序列及其任何片段、衍生物或变体。术语“qPCR”或“QPCR”指的是例如PCR Technique Quantitative PCR(PCR 技术 定量 PCR)，J. W. Larrick 编辑，Eaton Publishing，1997 和 A-Z of Quantitative PCR(定量PCR的A-Z)，S. Bustin编辑，IUL Press, 2004中所述的定量聚合酶链式反应。术语RCA是滚环扩增的缩写。RCA是一种涉及环形模版的重复拷贝而以线性方式来扩大信号的技术。杂交反应的“严谨性”是本领域普通技术人员容易测定的，并且通常取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度根据经验计算。通常，较长的探针需要较高的温度，用于正确的退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常取决于在低于解链温度的环境中存在互补链时，变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间所需的同源性程度越高，可以使用的相对温度越高。因此，断定较高的相对温度将倾向于使得反应条件更严谨，而较低的温度因此使反应条件不太严谨。杂交反应严谨性的其他详细内容和解释可以在例如Ausuble 等，Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学通用实验方案)，Wiley Interscience Publishers, (1995)中找至丨J。如本文所定义，“严谨条件”或“高严谨条件”通常为(1)使用低离子强度和高温进行洗涤，例如0. 015M氯化钠/0. 0015M柠檬酸钠/0. 1 %十二烷基硫酸钠，50°C ； (2) 杂交期间使用变性剂，如甲酰胺，例如50% (ν/ν)甲酰胺，与0. 牛血清白蛋白/0. Ficoll/0. 聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6. 5，与750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，42°C ；或(3)使用 50% 甲酰胺，5XSSC(0. 75M NaCl, 0. 075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6. 8)，0. 焦磷酸钠，5X，Denhardt' s溶液，超声波处理的鲑精DNA(50 μ g/ml)，0. 1 % SDS，和10%硫酸葡聚糖，42°C，并在0. 2X SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中于42°C和50%甲酰胺中于55°C洗涤，接着是包括于55°C在含EDTA的0. IXSSC中的高严谨洗涤。“中等严谨条件”可如 Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册)，New York, Cold Spring Harbor I^ress，1989所述的来予以确认， 并且包括使用不如上文所述那么严谨的洗涤溶液和杂交条件(例如，温度、离子强度和 SDS%)0中等严谨条件的一个实例是于37°C在包含20%甲酰胺，5XSSC(150mM NaCl, 15mM 柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7. 6) ,SXDenhardt' s溶液，10%硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切鲑精DNA的溶液中过夜温育，接着在IXSSC中于约37-50°C下洗涤滤器。本领域技术人员将会明了如何按照需要对温度、离子强度等进行调整，以适应诸如探针长度等因素。术语“MUC5AC”意思是黏蛋白5AC (Seq ID No. 1和4)，并且包括标志物MUC5AC，包括多核苷酸，如基因或基因片段、RNA或RNA片段；或基因产物，包括多肽，如肽、寡肽、蛋白质，或蛋白质片段；或任何相关的代谢产物、副产物，或任何其他鉴定分子，如抗体或抗体片段。术语“MUC17”意思是细胞表面结合的人黏蛋白17 (Seq ID No 2和5)，并且包括标志物MUC17，包括多核苷酸，如基因或基因片段、RNA或RNA片段；或基因产物，包括多肽，如肽、寡肽、蛋白质，或蛋白质片段；或任何相关的代谢产物、副产物，或任何其他鉴定分子，如抗体或抗体片段。术语“ZG16”意思是人酶原粒蛋白16 (Seq ID No 3和6)，并且包括标志物ZG16， 包括多核苷酸，如基因或基因片段、RNA或RNA片段；或基因产物，包括多肽，如肽、寡肽、蛋白质，或蛋白质片段；或任何相关的代谢产物、副产物，或任何其他鉴定分子，如抗体或抗体片段。除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、 细胞生物学和生物化学的常规技术，这落入本领域技术范围内。这样的技术在文献中有充分的说明，如Molecular Cloning =A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册)， 第 2 版，Sambrook 等，1989 Oligonucleotide Synthesis (寡核苷酸合成)，MJ Gait 编
1984 ；Animal Cell Culture, R. I. Freshney 'ΦΜ, 1987 ；Methods in Enzymology ( g| 学方法)，Academic Press, Inc. ；Handbook of Experimental Immunology (实验免疫学手册)，第 4 版，D.M.Weir & CC. Blackwell 编辑，Blackwell Science Inc. , 1987 ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (哺乳动物细胞的基因转移载体)，J. M. Miller & Μ· P. Calos 编辑，1987 ;Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学通用实验方案)，F. Μ· Ausubel 等编辑，1987 ；以及 PCR :The Polymerase Chain Reaction (PCR 聚合酶链式反应)，Mullis等编辑，1994。将理解以上术语可以指蛋白质、DNA序列和/或RNA序列。还将理解以上术语还指具有本文所示同源序列的非人蛋白质、DNA和/或RNA。发明详述通常，肿瘤标志物在肿瘤组织和相应的非恶性组织之间差异地表达。这提供了一种区分患有和未患有癌症的患者的方法。然而，很可能即使那些标志物在肿瘤组织中不是过表达的，肿瘤组织的解剖学结构和生理学特征也将导致血清和其他生物液体中标志物累积的差异。特别地，预测与非恶性组织相比，异常的肿瘤细胞极性、渗漏的脉管系统和肿瘤组织的高间隙压力将促进特定的标志物流出肿瘤组织。因此，猜测在胃肿瘤组织中以非常高的水平表达，但与非恶性胃组织相比未必是过表达的分泌蛋白质将构成有用的胃癌标志物。使用微阵列分析和定量聚合酶链式反应(qPCR)的组合，已经鉴定出用于胃癌检测的新标志物。这种新的胃肿瘤标志物(GTM)，在胃癌的早期检测中提供了更多工具。具体地，本发明包括新的 GTM :MUC5AC6eq ID No 1 和 4)、MUC17 (kq ID No 2 和 5)和 ZG16 (kq ID No 3 和 6)。新的GTM可以单独使用，或备选地，可以组合在一起作为标记(包含两种或多种 GTM)。根据本发明的标记包括MUC5AC、MUC17和ZG16中的至少一种，和至少一种另外的GTM， 其可以是根据本发明的GTM，或任何其他GTM，包括已知的GTM。已知的适于结合本发明公开的GTM—起使用的GTM包括羧肽酶N、多肽2，83kDa链 (CPN2)、基质金属蛋白酶12(MMP12)、抑制素(“INHBA”)、胰岛素样生长因子7 (“ IGFBP7”)、 Y-谷氨酰水解酶(“GGH”)、富含亮氨酸脯氨酸的蛋白聚糖(“LEPRE1”)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂S( “CST4”)、分泌型卷曲相关蛋白4( “SFRP4”)、aSp0rin( “ASPN”)、具有EF手型结构域的细胞生长调节剂1( “CGREF1”)、激肽释放酶IO(KLKlO)、金属蛋白酶的组织抑制剂1( “TIMP1”)、分泌型酸性富含半胱氨酸蛋白(“SPARC”)、转化生长因子，13-诱导的 (“TGFBI”)、含有EGF的fibulin-样胞外基质蛋白2( “EFEMP2”)、基膜聚糖(“LUM”)、 stannin ( “SNN”)、分泌型磷蛋白1( “SPP1 ”)、硫酸软骨素蛋白聚糖2 ( “CSPG2”)、N_酰基鞘氨醇酰胺水解酶(“ASAH1”)、丝氨酸蛋白酶11( “PRSS11”)、分泌型卷曲相关蛋白 2( “5卩1^2”)、磷脂酶六2，父1仍组(“PLA2G12B”)、spondin2，胞外基质蛋白(“SP0N2”)、嗅介蛋白1 (“0LFM1”)、含有血小板反应蛋白重复1 (“TSRC1”)、血小板反应蛋白2 (“THBS2”)、 adlican、半胱氨酸蛋白酶抑制剂SA( “CST2”)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN( “CST1”)、赖氨酰氧化酶样酶2( “L0XL2”)、甲状腺球蛋白(“TG”)、转化生长因子β1( “TGFB1”)、丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂Clade H成员1( “SERPINH1”)、丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂Clade B成员5( “SERPINB5”)、基质金属蛋白酶2 ( “ΜΜΡ2”)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 5型(“PCSK5”)、乙酰透明质酸糖蛋白连接蛋白4( “HAPLN4”)、CA19-9、 CA72-4、胃蛋白酶原和CEA，或之前已经鉴定为表示胃肿瘤的任何其他标志物。CN 102459646 A说明书8/21 页通过术语“可靠性”，我们包括假阳性和/或假阴性的低发生率。因此，使用较高可靠性的标志物，与使用该标志物形成的诊断相关的假阳性和/或假阴性较低。因此，在特定的实施方案中，提供了允许以高于现有技术标志物的可靠性约50%的可靠性来检测胃癌的标志物。在其他实施方案中，提供了可靠性高于约70%的标志物；在其他实施方案中，高于约73 %，在更多的其他实施方案中，高于约80 %，在更进一步的实施方案中，高于约90 %， 在其他实施方案中，高于约95 %，在更多的实施方案中，高于约98%，并且在特定的实施方案中，约100%的可靠性。癌症检测的一般方法以下列出了用于测定表达水平的一般方法，尽管将认识到用于测定表达水平的任何方法将是合适的。定量PCR(qPCR)可以使用GTM特异性引物和探针，对肿瘤样品、血清和血浆进行定量PCR(qPCR)。 在受控的反应中，PCR反应中形成的产物量(Sambrook, J.，E Fritsch, E.和T Maniatis, Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册)，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press =Cold Spring Harbor)与起始模板的量相关。可以通过 PCR 反应处于对数期时，在试剂变得限制之前，停止PCR反应来进行PCR产物的定量。然后将PCR 产物在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中电泳，用溴化乙锭或相当的DNA染色剂进行染色，并且通过密度测定法来测量染色强度。或者，可以使用PCR仪器，如Applied Biosystems'Prism 7000或Roche LightCycler来测定PCR反应的进展，这些仪器实时地测量产物积累。实时 PCR测量DNA嵌入染料如Sybr绿进入合成的PCR产物中的荧光，或报告分子从淬灭分子中裂解出来时释放的荧光；报告分子和淬灭分子结合至寡核苷酸探针中，所述寡核苷酸探针在DNA链从引物寡核苷酸延伸后与目标DNA分子杂交。寡核苷酸探针在下一个PCR循环中通过Taq聚合酶的酶作用得到置换和降解，将报告分子从淬灭分子中释放出来。在一种称为korpion 的变型中，探针与引物共价连接。反转录PCR (RT-PCR)RT-PCR可以用于比较正常以及用或未用药物治疗的肿瘤组织中不同样品群中的 RNA水平，以表征表达模式、分辨密切相关的RNA和分析RNA结构。对于RT-PCR，第一步是从目标样品中分离出RNA。起始材料通常是分别从人肿瘤或肿瘤细胞系以及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。可以从多种样品分离RNA，样品例如为来自乳房、肺、结肠(例如，大肠或小肠)、结直肠、胃、食管、肛门、直肠、前列腺、脑、 肝脏、肾脏、胰腺、脾脏、胸腺、睾丸、卵巢、子宫、膀胱等组织的肿瘤样品，来自原发性肿瘤或肿瘤细胞系，以及来自从健康供体收集的样品。如果RNA来源是肿瘤，例如，可以从冷冻或存档的石蜡包埋和固定的(例如，福尔马林固定的)组织样品中提取出RNA。通过RT-PCR制作基因表达谱的第一步是将RNA模板反转录为cDNA，接着在PCR反应中进行指数扩增。两种最常用的反转录酶是禽成髓细胞瘤病毒反转录酶(AMV-RT)和莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(MMLV-RT)。反转录步骤通常利用特异性引物、随机六聚体或寡聚dT引物引发，这将视情况和制作表达谱的目标而定。例如，可以利用GeneAmp RNA PCR 试剂盒(Perkin Elmer，CA，USA)，按照生产商的说明，对提取的RNA进行反转录。然后将所得到的cDNA在随后的PCR反应中用作模板。
虽然PCR步骤能够利用多种热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶，但通常采用Taq DNA 聚合酶，其具有5’_3’核酸酶活性，但缺乏3’_5’校对核酸内切酶活性。因此，TaqMan qPCR 通常利用Taq或Tth聚合酶的5’核酸酶活性来水解结合目标扩增子的杂交探针，但任何具有等同5’核酸酶活性的酶均可使用。可以利用两个寡核苷酸引物来产生PCR反应典型的扩增子。设计第三个寡核苷酸或探针来检测位于两个PCR引物之间的核苷酸序列。探针是不能通过Taq DNA聚合酶延伸的，并用报告荧光染料和淬灭荧光染料标记。当两种染料如其在探针上一样位置紧靠在一起时，任何激光诱导的报告染料的发射将被淬灭染料淬灭。在扩增反应期间，Taq DNA聚合酶以模板依赖性的方式切割探针。所得到的探针片段在溶液中解离，并且来自所释放的报告染料的信号不受第二个荧光团的淬灭作用的影响。每合成一个新的分子，就释放一分子的报告染料，并且未淬灭的报告染料的检测提供了数据定量解释的基础。TaqMan RT-PCR可以使用可购得的设备来进行，如，例如ABI PRISM 7700序列检测系统(Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)或 Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，德国)。在优选的实施方案中，在实时定量PCR装置 (如ABI PRISM 7700序列检测)上运行5’核酸酶程序。该系统由热循环仪、激光、电荷耦合器件(CCD)、照相机和计算机组成。该系统在热循环仪上以96孔的形式扩增样品。在扩增过程中，通过光纤光缆实时采集所有96个孔的激光诱导的荧光信号，并在CCD处进行检测。该系统包括用于运行仪器和用于分析数据的软件。5’核酸酶试验数据最初表达为Ct或阈值循环。如上文所讨论的那样，在每一循环中记录荧光值，其代表在扩增反应中到该点时所扩增的产物量。第一次记录到具有统计学显著性的荧光信号时的点为阈值循环。实时定量PCR (qRT-PCR)RT-PCR技术较为新近的一种变型是实时定量PCR，其通过双重标记的荧光生成探针(即TaqMan探针)测量PCR产物的积累。实时PCR与定量竞争PCR和定量比较PCR都兼容。前者利用每个目标序列的内部竞争物进行标准化，而后者利用样品内所含的归一化基因或持家基因进行RT-PCR。更多细节由例如Held等，Genome Research 6:986-994(1996) 来提供。可以使用固定的、石蜡包埋的组织作为RNA来源来测定表达水平。根据本发明的一个方面，设计PCR引物，使其在待扩增的基因中存在的内含子序列的两侧。在该实施方案中，引物/探针设计的第一步是描述出基因内的内含子序列。这可以通过公众可获得的软件来进行，如由 Kent，W. J. ,Genome Res. 12(4) =656-64(2002)开发的 DNA BLAT 软件，或 BLAST软件，包括其变型。后续步骤按照PCR引物和探针设计的成熟方法来进行。为了避免非特异性信号，在设计引物和探针时遮蔽内含子内的重复序列是有用的。这可以通过使用Baylor College of Medicine在线获得的R印eat Masker程序容易地实现，该程序相对于重复元件文库筛选DNA序列，并返回其中已经遮蔽了重复元件的查询序列。然后可以将已经遮蔽的序列用于设计引物和探针序列，利用任何可购得的或其他公众可获得的引物/探针设计包，如I^imer Express (Applied Biosystems) ；MGB设计试验 (Applied Biosystems) ；Primer3(Steve Rozen 禾口 Helen J. Skaletsky(2000)Primer3 on the VIMNV for general users and for biologist programmers (用于一般使用者禾口生物学家程序员的 VIMNV 上的 Primer3)，见Krawetz S, Misener S (编辑)Bioinformatics Methods and Protocols =Methods in Molecular Biology(生物信息学方法和实验方案 分子生物学方法),Humana Press, Totowa, NJ, 365-386 页)。PCR引物设计中考虑的最重要的因素包括引物长度、解链温度(Tm)和G/C含量、特异性、互补引物序列和3'端序列。通常，最佳PCR引物一般为17-30个碱基长，并含有约 20-80%,如，例如约50-60%的G+C碱基。通常优选50_80°C，例如，约50_70°C的解链温度。 有关PCR引物和探针设计的更多指南，参见，例如Dieffenbach，C. W.等，General Concepts for PCR Primer Design (PCR 弓 L i殳 i十白勺一M g )， H :PCR Primer, A Laboratory Manual (PCR 引物，实验室手册)，Co Id Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, 133-155 页 Jnnis 和 Gelfand，Optimization of PCR(PCR 的优化)，见PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (PCR 实验方案，方法和应用指导)，CRC Press, London, 1994, 5-11 页；禾口 Plasterer, Τ· N. Primerselect Primer and probe design (引物选择引物和探针设计)，Methods Mol.Biol.70 :520-527 (1997)，在此特意将其全部公开内容明确引入作为参考。微阵列分析差异表达也可以使用微阵列技术来鉴定或验证。因此，可以使用微阵列技术在新鲜或者石蜡包埋的肿瘤组织中测量GTM的表达谱。在这种方法中，在微芯片基质上覆盖或排列目标多核苷酸序列(包括cDNA和寡核苷酸)。排列的序列(即，捕获探针)随之与来自目标细胞或组织(即，靶标)的特异性多核苷酸杂交。与RT-PCR方法一样，RNA来源通常为从人肿瘤或肿瘤细胞系以及相应的正常组织或细胞系中分离出来的总RNA。因此，RNA 可以分离自多种原发性肿瘤或肿瘤细胞系。如果RNA的来源是原发性肿瘤，则可以例如从冷冻或存档的福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织样品和固定的(例如，福尔马林固定的)组织样品中提取RNA，这些样品在日常的临床实践中都是常规制备和保存的。在微阵列技术的特定实施方案中，向基质上施加PCR扩增的cDNA克隆的插入片段。基质可以包括高达1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或75个核苷酸序列。在其他方面中，基质可以包括至少10，000个核苷酸序列。固定在微芯片上的微阵列序列适合于在严谨条件下杂交。作为其他实施方案，用于微阵列的靶标可以为至少50、100、200、400、500、 1000 或 2000 个碱基长；或 50-100、100-200、100-500、100-1000、100-2000 或 500-5000 个碱基长。作为另外的实施方案，用于微阵列的捕获探针可以为至少10、15、20、25、50、75、80 或 100 个碱基长；或 10-15、10-20、10-25、10-50、10-75、10-80 或 20-80 个碱基长。通过反转录从目标组织提取的RNA，通过荧光核苷酸的掺入可以生成荧光标记的 cDNA探针。施加到芯片上的标记cDNA探针与阵列上的每个DNA斑点特异性地杂交。严谨洗涤以除去非特异性结合的探针后，通过共焦激光显微镜或通过另一种检测方法(如CCD 照相机)来扫描芯片。对每个阵列化元素的杂交的定量允许评估相应mRNA的丰度。利用双色荧光，从两个RNA源生成分开标记的cDNA探针，其成对地与阵列杂交。由此，对应于每个特定基因的来自两个来源的转录物的相对丰度可以得以同时确定。这种小型化规模的杂交提供了对大量基因表达模式的方便快捷的评价。此类方法已经证明具有检测微量转录物和可再现地检测至少大约两倍的表达水平差异所需的灵敏度，其中所述微量转录物仅以每个细胞几个拷贝的水平表达Gchena等，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 93(2) :106-149(1996))。微阵列分析可以通过可购得的设备按照生产商的实验方案来进行，如使用Affymetrix GenChip技术、Illunima微阵列技术或hcyte微阵列技术。 对大规模分析基因表达的微阵列方法的研发，使得可以在多种肿瘤类型中系统地寻找癌症分类和结果预测的分子标志物。RNA分离、纯化和扩增用于mRNA提取的一般方法是本领域公知的，并公开在分子生物学的标准教科书中，包括 Ausubel 等，Current Protocols of Molecular Biology (分子生物学通用实验方案)，John Wiley and Sons (1997)。例如，Rupp 禾口 Locker, Lab Invest. 56 :A67 (1987)，以及De Sandres等，BioiTechniques 18 :42044(1995)中公开了从石赌包埋的组织中提取RNA 的方法。特别地，可以使用来自商业生产商如Qiagen的纯化试剂盒、成套缓冲液和蛋白酶， 按照生产商的说明，来进行RNA分离。例如，可以使用Qiagen RNeasy微型柱从培养细胞分离总RNA。其他可购得的RNA分离试剂盒包括MasterPure Complete DNA和RNA纯化试剂盒(EPICENTRE(D，Madison，WI)和 Paraffin Block RNA 分离试剂盒(Ambion, Inc.) 可以使用RNA Mat-60 (Tel-Test公司)从组织样品分离总RNA。例如，可以通过氯化铯密度梯度离心分离由肿瘤制备的RNA。利用固定的石蜡包埋的组织作为RNA来源进行基因表达谱制作的代表性实验方案的步骤包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增，在多篇发表的期刊文章中给出(例如 Τ. E. Godfrey 等，J. Molec. Diagnostics 2 :84-91 (2000) ；K. Specht 等，Am. J. Pathol. 158 419-29(2001))。简言之，一个代表性方法从切割约10微米厚的石蜡包埋肿瘤组织样品切片开始。然后提取RNA，除去蛋白质和DNA。分析RNA浓度后，如果需要，可以包括RNA修复和/或扩增步骤，并且利用基因特异性启动子反转录RNA，接着进行RT-PCR。最后，分析数据以基于所研究的肿瘤样品中鉴定到的特征性基因表达模式来确定患者可用的最佳治疗选择。免疫组织化学和蛋白质组学免疫组织化学法也适用于检测本发明的增殖标志物的表达水平。因此，利用每种标志物特异性的抗体或抗血清，优选多克隆抗血清，最优选单克隆抗体，来检测表达。可以通过用例如放射性标记、荧光标记、半抗原标记(如，生物素)，或酶(如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)直接标记抗体本身来检测抗体。或者，可以将未标记的一级抗体与标记的二级抗体联合使用，所述二级抗体包括一级抗体特异性的抗血清、多克隆抗血清或单克隆抗体。免疫组织化学实验方案和试剂盒是本领域公知的并且可商购。蛋白质组学可以用来分析特定时间点样品(例如，组织、器官或细胞培养物)中存在的多肽。特别地，蛋白质组学技术可以用来评估样品中多肽表达的全局变化(也称为表达蛋白质组学)。蛋白质组学分析通常包括(1)通过2-D凝胶电泳Q-D PAGE)分离样品中单独的多肽；(2)鉴定从凝胶中回收的单独的多肽，例如，通过质谱或N-端测序，和(3)利用生物信息学分析数据。蛋白质组学方法对于其他基因表达谱研究方法是有价值的补充， 并且可以单独使用或与其他方法结合使用，以检测本发明的增殖标志物的产物。使用标志物选择性的核酸探针的杂交方法这些方法涉及将核酸探针结合支持体，并且在合适的条件下与源自测试样品的 RNA 或 cDNA 杂交(Sambrook, J. ，E Fritsch, E.禾口 T Maniatis，Molecular Cloing :ALaboratory Manual (分子克隆实验室手册)，第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press =Cold Spring Harbor (2001))。这些方法适用于源自肿瘤组织或液体样品的GTM。 通常用荧光或放射性分子来标记RNA或cDNA，以能够检测和定量。在一些应用中，可以用分支的、荧光标记的结构将杂交DNA标记，以增强信号强度(Nolte，F. S. Branched DNA signal amplification for direct quantitation of nucleic acid sequences in clinical specimens (用于临床样品中核酸序列的直接定量的分支DNA信号扩增)，Adv. Clin. Chem. 33，201-35 (1998))。在通过凝胶图像的荧光检测或密度测定定量杂交量之前， 通过在低盐溶液(如，0. 1XSSC，0. 5% SDS)中强烈洗涤来除去未杂交的标记。支持体可以是固体，如尼龙或硝基纤维素膜，或由在液体悬浮液中时杂交的微球体或珠子组成。为了可以洗涤和纯化，珠子可以是磁性的(Haukanes，B-I和Kvam，C.，Application of magnetic beads in bioassays (磁性珠子在生物试验中的应用)，Bio/technology 11,60-63(1993)) 或是荧光标记的，以能够进行流式细胞术(参见，例如Spiro，Α.，Lowe, Μ.和Brown，D.， A Bead-Based Method for Multiplexed Identification and Quantitation of DNA Sequences Using Flow Cytometry (使用流式细胞术的用于DNA序列的多路鉴定和定量的基于珠子的方法)，Appl. Env. Micro. 66，4258-4265 (2000))。杂交技术的一种变型是 QuantiGene Plexe 测定(Genospectra，Fremont)，其结合了荧光珠子支持体和分支DNA信号扩增。杂交技术的再一种变型是Quantikine mRNA测定(R&D Systems, Minneapolis).方法按照生产商的说明书中所述的。简言之，测定使用与洋地黄毒苷缀合的寡核苷酸杂交探针。在比色试验中，使用偶联碱性磷酸酶的抗洋地黄毒苷抗体来检测杂交。其他的方法是本领域公知的，并且在本文中不需要更多描述。酶联免疫测定(ELISA)简言之，在夹层ELISA测定中，将对抗GTM的多克隆或单克隆抗体结合固相支持体(Crowther，J. R. The ELISA guidebook (ELISA 参考指南)，Humama Press :New Jersey (2000) ；Harlow, Ε.禾口 Lane, D. , Using antibodies :a laboratory manual (使用抗体实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press :Cold Spring Harbor (1999)) 或悬浮液珠子。其他方法是本领域公知的，并且在本文中不需要更多描述。单克隆抗体可以是杂交瘤衍生的，或选自噬菌体抗体文库(Hust M.和Dubel S. ,Phage display vectors for the in vitro generation of human antibody fragments (用于体夕卜产生人抗体片段的噬菌体展示载体)，Methods Mol Biol. 295 :71-96(2005))。用非目标蛋白制备物和去污剂将非特异性结合位点阻断。然后用来自含有GTM抗原的患者的样品或组织的制备物温育捕获抗体。在用检测目标GTM的二级抗体温育抗体/抗原复合物之前，洗涤混合物。二级抗体通常缀合荧光分子或可以在酶反应中检测或用缀合报告子的第三抗体检测的其他报告分子(Crowther，同上)。或者，在直接ELISA中，含有GTM的制备物可以结合支持体或珠子，并且用抗体-报告子缀合物直接检测目标抗原(Crowther，同上)。用于生产单克隆抗体和多克隆抗血清的方法是本领域公知的，并且在本文中不需要更多描述。免疫检测这些方法还可以用于免疫检测在外科手术取出肿瘤前后取自胃癌患者的血清或血浆中的标志物家族成员、免疫检测患有其他癌症的患者中的标志物家族成员，所述其他癌症包括但不限于，结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肝癌、食道癌、胃癌、子宫内膜癌和脑癌，以及免疫检测来自胃癌患者的尿液和粪便中的标志物家族成员。还可以使用其他标准免疫检测技术，如免疫印迹或免疫沉淀，来检测组织或样品中的 GTM(Harlow，E.禾口 Lane，D.，Using antibodies :a laboratory manual (使用抗体实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press :Cold Spring Harbor (1999))。在免疫印迹中，将来自含有GTM的组织或液体的蛋白质制备物在变性或非变性条件下通过聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后将蛋白质转移至膜支持体上，如尼龙。然后按照对免疫组织化学所述的，将GTM与单克隆或多克隆抗体直接或间接反应。或者，在一些制备物中，可以将蛋白质直接点在膜上，而没有之前的电泳分离。可以通过密度测定来定量信号。在免疫沉淀中，用抗GTM的单克隆或多克隆抗体温育含有GTM的可溶性制备物。然后用惰性珠子温育反应物，所述惰性珠子由具有共价连接的A蛋白或G蛋白的琼脂糖或聚丙烯酰胺制备。A或G蛋白珠子与抗体特异性地反应，形成结合珠子的抗体-GTM-抗原的固定化复合物。洗涤后，可以通过免疫印迹或ELISA检测和定量结合的GTM。阈值测定对于使用GTM的测试，将得到能够使样品对于胃癌称为阳性或阴性的阈值。这些阈值将通过正在研究胃癌存在的患者群的分析来测定。阈值对于不同的测试应用将不同； 例如，使用大部分无泌尿科症状的患者群来测定用于群筛选测试中的阈值，并且这些阈值不同于用于监测胃癌复发患者的测试中所用的那些。可以选择阈值，以在所需的临床背景中提供实际水平的测试特异性；即，允许合理灵敏度但没有过量接受假阳性结果患者的特异性。该特异性可以在80-90%的范围内。获得测试阈值的备选方法是对于不同的测试阈值，将灵敏度相对于特异性作图(R0C曲线)，然后选择曲线的拐点。作为单个阈值的备�。�测试可以使用测试间隔，其提供了不同程度的疾病存在的可能性，并且其具有与这些可能性相关的不同临床结果。例如，测试可以具有三个间隔；一个与高风险(例如，90%)的胃癌存在相关，第二个与低风险的胃癌相关，而第三个认为是怀疑患病的。“怀疑”的间隔将与限定的时间段内的重复测试的推荐相关。胃癌标志物的抗体在其他方面中，本发明包括制备针对GTM的抗体。使用本文中所述的方法，可以使用微阵列和/或qRT-PCR方法来鉴定新的GTM。一旦鉴定出推定的标志物，可以足量生产以适合于引发免疫应答。在一些情况中，可以使用全长GTM，而在其他情况中，GTM的肽片段足够作为免疫原。可以将免疫原注入合适的宿主中(例如，小鼠、兔子等)，并且如果需要，可以注入佐剂，如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，以提高免疫应答。可以认识到制备抗体在免疫学领域中是常规的，并且在本文中不需要更多描述。因此，可以产生针对使用本文中所述方法鉴定的GTM的抗体，包括单克隆或噬菌体展示抗体。在进一步的实施方案中，可以制备针对本文中鉴定的肿瘤标志物的蛋白质或蛋白质核心的抗体或针对对于GTM独特的寡核苷酸序列的抗体。尽管特定的蛋白质可以糖基化，因此在特定的情况中，糖基化模式的变化可导致缺乏常规糖基化模式的GTM形式的错误检测。因此，在本发明的特定方面中，GTM免疫原可以包括脱糖基化的GTM或脱糖基化的 GTM片段。可以使用一种或多种本领域已知的糖苷酶来完成脱糖基化。或者，GTMcDNA可以在缺乏糖基化的细胞系中表达，如在原核细胞系中表达，包括大肠杆菌等。可以制备其中具有GTM编码寡核苷酸的载体。许多这样的载体可以基于本领域已知的标准载体。载体可以用于转染多种细胞系，以产生GTM-产生细胞系，其可以用于产生所需量的GTM，用于研发特定的抗体或其他试剂，用于检测GTM或用于标准化为GTM研发的测定法。试剂盒基于本发明的发现，可以设想和产生几种类型的测试试剂盒。首先，可以制备具有预先装载了检测分子(或“捕获试剂”)的检测装置的试剂盒。在用于检测GTM mRNA的实施方案中，这样的装置可以包括基质(例如，玻璃，硅，石英，金属等)，在其上结合了寡核苷酸，作为与待检测的mRNA杂交的捕获试剂。在一些实施方案中，可以通过mRNA(用cy3、 cy5、放射性标记或其他标记来标记)与基质上的寡核苷酸杂交来完成mRNA的直接检测。在其他实施方案中，可以通过首先制备所需mRNA的互补DNA(cDNA)来完成mRNA的检测。然后，可以将标记的cDNA与基质上的寡核苷酸杂交，并检测。抗体还可以作为捕获试剂用于试剂盒中。在一些实施方案中，基质(例如，多孔平板)可以具有与其连接的特异性GTM捕获试剂。在一些实施方案中，试剂盒可以包括阻断试剂。阻断试剂可以用于降低非特异性结合。例如，可以使用过量的来自不含有GTM寡核苷酸的任何常规来源的DNA(如，鲑精DNA)来降低非特异性的寡核苷酸结合。可以使用过量的阻断蛋白(如，血清白蛋白)来降低非特异性的抗体结合。可以认识到用于检测寡核苷酸和蛋白质的多种方法是本领域已知的，并且可以使用特异性地检测GTM相关分子的任何策略，并且认为在本发明的范围内。结合固相支持体时，例如，使用抗体芯片时，也可以使用抗体，抗体芯片允许使用单个芯片检测多种标志物。除了基质以外，测试试剂盒可以包含捕获试剂(如，探针)、洗涤溶液(例如，SSC、 其他盐、缓冲剂、去污剂等)，以及检测部分(例如，cy3、cy5、放射性标记等)。试剂盒还可以包括使用说明书和包装。可以使用任何合适的技术来检测样品中的癌症标志物，这些技术可以包括，但不限于，寡核苷酸探针、QPCR或针对癌症标志物产生的抗体。将认识到待测试的样品不限于怀疑是肿瘤的组织样品。标志物可以分泌至血清或其他体液中。因此，样品可以包括任何身体样品，并且包括生检样品、血液、血清、腹膜冲洗物、脑脊髓液、尿液和粪便样品。还将认识到本发明不限于人类的癌症检测，而且还适于任何动物的癌症检测，包括，但不限于，狗、猫、马、牛、绵羊、鹿、猪和已知患癌症的任何其他动物。体液中胃癌标志物的测试在几个实施方案中，理想地可以对获自血液、血浆、血清、腹膜液(例如，获自腹膜冲洗物)或其他体液(如，尿液、淋巴、脑脊液、胃液)的样品或粪便样品进行GTM测定。通常，测试这些液体中寡核苷酸、蛋白质和肽的方法是本领域已知的。可以使用如 Northern印迹、Southern印迹或微阵列方法，或qPCR的杂交方法来进行寡核苷酸的检测。 用于检测蛋白质的方法，包括如酶联免疫吸附测定(ELISA)、具有抗体的蛋白质芯片、悬浮液珠子放射免疫测定(RIA) ,Western印�：湍�集素结合。然而，为了说明的目的，可以使用夹层型酶联免疫吸附测定(ELISA)来定量GTM的液体水平。对于血浆测定，将5uL等份的适当稀释的样品或连续稀释的标准GTM和75uL的过氧化物酶缀合的抗-人GTM抗体加入微量滴定平板的孔中。在30°C下30分钟的温育期后，用磷酸缓冲盐水{PBS}中的0.05% 吐温20洗涤孔，来除去未结合的抗体。然后在30°C下用含有邻-亚苯基二胺的H2A温育结合的GTM和抗-GTM抗体复合物15分钟。通过加入IM H2SO4来停止反应，并且用微量滴定平板读出器来测量492nm处的吸光值。可以认识到抗-GTM抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗血清。还可以认识到可以合适地研究任何其他体液。在生理学意义上，标志物不必是分泌的才是有用的。相反，标志物蛋白质或基因进入血清的任何机制在产生可检测的、可定量水平的标志物中是有效的。因此，可溶性蛋白从细胞的正常分泌、膜蛋白从质膜的脱落、选择性剪接形式的mRNA或从其表达的蛋白质的分泌、细胞死亡(或凋亡)可以产生足够水平的有用标志物。对于使用血清标志物作为诊断和/或评价多种癌症类型疗效的工具，存在越来越多的支持。Yoshikawa等，(Cancer Letters, 151 :81-86 Q000))，描述了胃癌患者血菜中的基质金属蛋白酶-1的组织抑制剂。Rudland 等，(Cancer Research 62 :3417-3427(2002))描述了骨桥蛋白作为人乳
癌中的转移相关蛋白。Buckhaults 等，(Cancer Research 61 :6996-7001 (2002))描述了结直肠肿瘤中特定分泌的和表达的细胞表面基因。Kim等，(JAMA 287(13) :1671-1679(2002))描述了骨桥蛋白作为卵巢癌的潜在诊断生物标志物。Hotte 等，(AJ. American Cancer Society 95(3) :507-512 Q002))，描述了血菜骨桥蛋白作为人体液中可检测的蛋白质，并且与特定的恶性肿瘤相关。Martin^, (Prostate Cancer Prostatic Dis. 2004^3^ 9 日(PMID :15007379) (摘要))，描述了人激肽释放酶2，前列腺特异性抗原(PSA)和游离PSA作为检测前列腺癌的标志物的用途。Hall 等，(Laryngoscope 113(1) :77-81 (2003) (PMID U679418)(摘要))，描述了血清甲状腺球蛋白在甲状腺癌中的预测价值。Mazzaferri 等，(J. Clin. Endocrinol. Metab. 88 (4) 1433-1441 Q003)(摘要))， 描述了甲状腺球蛋白作为甲状腺癌患者的潜在监测方法。Whitley 等，(Dim Lab. Med. 24(1) =29-47(2004)(摘要))，描述了甲状腺球蛋白作为甲状腺癌的血清标志物。Kuo 等，(Clin. Chim. Acta. 294(1-2) 157-168 Q000)(摘要))，描述了 HCF-和 HBV-感染患者中的血清基质金属蛋白酶-2和-9。Koopman 等，(Cancer Epidemiol. Biomarkers Prey 13(3) :487-491 O004)(摘要))，描述了骨桥蛋白作为胰腺癌的生物标志物。Pellegrini 等，(Cancer Immunol. Immunother. 49(7) :388-394(2000)(摘要))， 描述了可溶性癌胚抗原和TIMPl作为入侵前结直肠癌的标志物的测量。
Melle 等，(Clin. Chem. 53 (4),629-635 (2007)(摘要))，描述了 HSP27 作为胰腺癌的血清标志物。Leman 等，(Urology, 69 (4) 714-20 (2007)(摘要))，描述了 EPCA-2 作为前列腺癌的血清标志物。Tsigkou 等，(I Clin Endocrinol Metab，92 (7) 25洸_31 (2007)(摘要))，描述了总抑制素作为卵巢癌的潜在血清标志物。Marchi 等，(Cancer 112，1313-13M ^)08)(摘要))，描述了前载脂蛋白 AI 作为肺癌患者脑部转移的血清标志物。方法使用以下的一般方法来评价多种方法对胃肿瘤相关标志物的分子鉴定的适用性。肿瘤收集从首尔国立大学医院(Seoul National University Hospital)切除的外科手术样本收集胃肿瘤样品和非恶性胃组织。基于症状、生理发现和组织的组织学检查来进行胃癌的诊断。RNA 提取在一些实施方案中，通过测定取自肿瘤的样品中的RNA水平来分析胃肿瘤相关基因的表达。将冷冻外科手术样本包埋在OCT介质中。使用切片机从组织块切出60微米的切片，在TriReagent 水(3 1)混合物中均质化，然后氯仿萃取。然后使用RNeasy 程序(Qiagen)从水相纯化总RNA。总共从58个胃肿瘤和58个非恶性(“正常”)胃组织样品中提取了 RNA，并用于以下所述的微阵列分析中。还从16个癌细胞系中提取出RNA，并合并作为参照RNA。微阵列载玻片制备环氧涂布的玻璃载玻片获自MWG Biotech AG，K^ersberg，德国，并且根据生产商的实验方案，使用Gene Machines微阵列机器人用_30，000个50mer寡核苷酸印刷。RNA标记和杂交在含有5-(3-氨基烯丙基)_2’脱氧尿苷_5’ -三磷酸盐的反应物中，使用 Superscript II反转录酶(Invitrogen)从IOug总RNA转录cDNA。然后将反应物在 Microcon柱中去离子，接着在室温下，在碳酸氢盐缓冲液中用Cy3或Cy5温育。使用 Qiaquick柱^jiagen)除去未结合的染料，并且将样品在SpeedVac中浓缩至15ul。然后将 Cy3和Cy5标记的cDNA与Ambion ULTRAhyb缓冲液混合，在100°C下变性2分钟，并在杂交室中，在42°C下，与微阵列载玻片杂交16小时。然后洗涤载玻片，并在Axon 4000A扫描仪中，在两个功率设定下扫描两次，以产生基因表达的原始荧光数据。归一化程序为了测量肿瘤和非癌组织中癌基因的表达，通过减去局部背景荧光强度来校正由 Genepixta软件检测的中值荧光强度。排除了背景校正强度低于零的点。为了促进归一化， 将强度比例和整体点强度进行了对数转化。使用LOCFITta包中实现的局部回归对染料和空间偏差校正了对数转化的强度比例。同时对于整体点强度和位置回归了对数转化的强度比例。局部回归的残差提供了校正的对数-倍数变化。对于质量控制，相对于点强度和位置， 对每个归一化的微阵列的比例作图。随后目测检查图的可能剩余的假象。此外，方差分析(ANOVA)模型适用于针尖(pin-tip)偏差的检测。将归一化的所有结果和参数插入用于统计学分析的Postgres-数据库中。标志物选择根据每个基因在肿瘤和非恶性组织中的相对信号强度，将29，718个基因的每个微阵列基因表达数据进行分级。进一步的分析限于(i)编码分泌蛋白的基因，( )在肿瘤组织中具有高于对编码现有肿瘤标志物CEA的基因(CEACAiK)观察到的强度等级的基因和 (iii)在血液或脉管组织中不具有显著表达的基因，如通过Unigene数据库中的EST计数所测定的(Wheeler DL等，200 。通过鉴定预期含有N-端信号肽的转录物来预测分泌蛋白。丢弃具有不在头20个N-端氨基酸的预测的跨膜螺旋的蛋白[Krogh A.等，2001]。使用TARGETP[Emanuelsson O等，2000]预测更多的亚细胞定位。相关寡核苷酸的参考号(MWG寡聚物#)，以及选定GTM的NCBImRNA和蛋白质参考序列显示于图1中。图1还显示了选定的GTM在肿瘤和非恶性组织中的等级强度。下文中显示了本发明的GTM的全部DNA序列。定量实时PCR在其他实施方案中，可以将实时或定量PCR(qPCR)用于PCR模板拷贝数的绝对或相对定量。使用 Primer Express V 2. OTM(Applied Biosystems)设计 MUC17 的引物组(正向GAGGTGGTCAGCAGCATTGAC ；反向CCTGGGAAGAGTG GTTTTTTAGC)，并使用 STOR 绿色标记来检测扩增的产物。通过Assay-on-Demand 表达试验Hs. 00380609_ml (Applied Biosystems)来表示ZG16。在ABI Prism 7000序列检测系统上在标准循环条件下进行了扩增。使用由单个cDNA表示的每个RNA样品在两个96孔平板上进行试验。分析了高达 45个来自胃肿瘤和非恶性胃组织的RNA样品。每个平板含有参照cDNA标准曲线，在625-倍浓度范围内，以一式两份进行。分析由计算ACT组成(目标基因CT-平均参照cDNA CT) 0 ACT与负log2倍数变化成正比。然后计算相对于中值非恶性log2倍数变化的log2倍数变化(log2倍数变化-中值正常log2对数变化)。然后将这些倍数变化聚类成频率级并作图。蛋白质表达和抗体产生为了证实蛋白质水平的ZG16，必须产生抗重组蛋白的新抗体。使用正向引物 CACCAATGCCATTCAGGCCAGGT 和反向引物 TCAGCATCTGCTGCAGCTA 从人细胞系 cDNA PCR 扩增 ZG16的编码区17-167。将PCR产物凝胶纯化并且克隆至来自hvitrogen的“(Gateway”进入载体“pENTR/dTOPO”中，然后测序以证实序列的正确插入。使用“(Gateway”系统，然后从 pENTR/dTOPO将ZG16克隆至含有N端6XHIS标记物的hvitrogen表达载体pDEST17中。 在BL21-AI大肠杆菌细胞(Invitrogen)中进行ZG16的表达，将细胞在37°C下在摇床上生长，直至它们处于中间对数期(0D_ = 0. 5)，由此在0. 2%最终浓度的阿拉伯糖下诱导，并且在37°C下在摇床上再生长3小时。通过在6000 X g下离心15分钟来收集细胞，并将上清液丢弃。将细胞重悬浮于PBS(pH7.0)中，并且使用60%功率的Sonics Vibra cell通过超声波来裂解。通过在12000 Xg下离心10分钟来澄清裂解的细胞，并且丢弃上清液。将细胞沉淀物在含有0. 5% TritonX-100的PBS缓冲液(pH7. 0)中洗涤三次，接着用PBS (pH7. 0) 洗涤一次。然后，使用PBS中的8M脲(pH8. 0)将沉淀物再洗涤一次。通过在12000Xg下离心来澄清每个洗涤步骤，并且丢弃上清液。然后将沉淀物溶解于含有IOmM TRIS (pH8. 0)、 8M脲、IOOmM NaCl的增溶缓冲液中，在室温下过夜。将增溶缓冲液在12000 Xg下进一步离心，通过0. 45nm膜过滤，并且装载于用含有PBS (ρΗ7. 0)、8M脲和20mM咪唑的洗涤缓冲液预先洗涤过的Mkpharose柱上。装载后，用10柱体积的洗涤缓冲液洗涤柱子，并且将溶解的蛋白质在补充500mM咪唑的洗涤缓冲液中洗脱。将洗脱的蛋白质脱盐至PBS(pH7.0) 和8M脲缓冲液中，并且在含有50mM乙酸钠(pH4. 5)、0. IM NDSB-201、10%甘油、lmM/0. ImM GSH/GSSH的重折叠缓冲液中通过逐滴稀释来重折叠。通过在12000Xg下离心来澄清重折叠缓冲液，并且使用具有IOKDa标称分子截留的Centripr印滤器(Millipore)来浓缩重折叠蛋白。使用G25脱盐柱将重折叠蛋白缓冲液交换至补充了 10%甘油的含有IOOmM乙酸钠的缓冲液(PH5.0)中，并且将等份试样存储在_80°C。考马斯染色的10% SDS PAGE凝胶和 Western印迹分析总体表明了高达95%纯度的18KDa的His-标记的蛋白质的存在。切除 18KDa考马斯染色带并通过MALDI-T0F/T0F MS/MS鉴定含有ZG16。通过用纯化的ZG16蛋白淘选噬菌体展示抗体文库来获得抗ZG16的抗体 (Antibodies by Design ；Morphosys AG 的一个分部，德国。www, morphosys. com)。抗体阵列使用抗体阵列来证实候选标志物。血清样品获自胃癌、结直肠癌(外科手术前后)患者，和获自非恶性疾病的外科手术患者。通过Dunedin Public Hospital，新西兰，和Christchurch Cancer Society组织库，Christchurch，新西兰，来制备样品。使用 GeneMachines OminGrid 100阵列机器人将获自商业来源或选自噬菌体文库(Morphosys) 的抗ZG16和MUC17的抗体印刷在玻璃载玻片上(Schott Nexterion Slide H)。用疏水笔将每个阵列圈上范围。然后将载玻片在3 X PBS-0. 5 %吐温20 (3 X PBS-T)中洗涤，接着用50mM 硼酸钠缓冲液中的50mM乙醇胺，pH8. 0来封闭，接着用酪蛋白酸盐封闭缓冲液(3XPBS-T，
酪蛋白酸钠)封闭。然后将生物素标记的血清样品添加至载玻片上，接着在4°C下温育过夜。然后将载玻片在3XPBS-T中洗涤，接着空气干燥。然后使用滚环扩增(RCA)来检测结合的抗体，之前有大量描述(Haab BB, Lizardi PM, RCA-enhanced protein detection arrays (RCA增强的蛋白质检测阵列)，Methods Mol Biol. 2006 ；328 15-29)。简言之，用已经缀合寡核苷酸引物(5’-CCT GGT GCT CAA ATT TCA GTT CTG C-3’)的抗生物素抗体温育载玻片。然后在潮湿的密封室中在37°C下将环状DNA模板与载玻片杂交30min，接着将载玻片在递减浓度的PBS-T(3XPBS-0. 05%吐温20，IXPBS-0. 05%吐温20和0. 1XPBS-0. 05% 吐温20)中洗涤并干燥。然后使用？11口9在301下将模板延伸池！·，接着洗涤载玻片，并通过离心干燥。然后使用同源荧光标记的探针来检测扩增的模板。用Axon 4000A扫描仪扫描载玻片，并用GenePix Pro 6. 1. 0. 4软件测量信号。使用来自R的li_a (Smith，200 包(用于统计计算的R包(R Development Core)的normalizeBetweenArrays函数，使用分位数归一化来调节Cy5荧光强度。分位数归一化调节强度值，通过将来自不同区组的强度分位数设定至相同值，使得强度分布对于每个区组是相同的(每个区组对应于单独的样品)。每个强度值的等级在该程序过程中没有改变，只有强度的相对量值发生了改变。设想描述抗原浓度范围的潜在概率分布函数对于所有样品是相同的。该程序提高了所有样品见的区组之间信号的平均相关性，并且还在考虑仅参照的区组时，其表明了数据质量的改进。在采取重复之间的中值来获得每种抗体的归一化强度之前，除去Gen印ix-标记的点。因此，我们已经鉴定出对于研发试剂、检测和评价胃癌的装置和试剂盒有用的三种基因和/或蛋白质。可以使用一个或多个胃癌标志物，单独或结合使用，以提供用于胃癌的可靠分子测试。
实施例在此所述的实施例是为了说明本发明的实施方案的目的。其他实施方案、方法和分析类型在分子诊断领域的普通技术人员的能力范围内，并且在本文中不需要详细描述。 认为本领域范围内的其他实施方案是本发明的一部分。实施例1 胃恶性肿瘤的标志物的鉴定使用获自胃肿瘤和非恶性样品的基因表达数据来选择标志物。将以下标准用于标志物选择(i)分泌蛋白特征性的信号序列的存在，(ii)肿瘤组织中微阵列信号强度等级和(iii)血液或脉管组织中相应EST的水平。这些标准的使用能够鉴定在肿瘤组织中大量表达但可能在血清、血液或血浆中具有低背景的分泌标志物。图1描绘了一张表，其显示了使用以上标准选择的胃恶性肿瘤的三个标志物，MUC5AC，MUC17和ZG16。图1包括基因符号 (“符号”)、MWG寡聚物号、NCBI mRNA参照序列号、蛋白质参照序列号、使用肿瘤组织衍生的阵列上基因的等级强度和使用非恶性组织衍生的阵列上基因的等级强度。所有三个GTM 具有比CEACAM5高的表达(强度)等级，CEACAM5是编码现有胃癌标志物CEA的基因。最低的表达等级可能是四，718。等级的检查还显示出这些GTM在肿瘤组织中的表达与非恶性组织相当，表明基因在癌形成过程中未得到强烈下调。血液和脉管组织中这三个GTM的 unigene EST 计数(Wheeler 等，2003)全部为零。实施例2 qRT-PCR分析使用更灵敏和精确的基因表达定量技术qPCR，在肿瘤组织中证实了 GTM ZG16和 MUC17的丰度和身份。使用方法部分中所述的引物和探针，通过RT-qPCR分析了来自相同患者的高达45个胃肿瘤样品和等量的非恶性胃组织样品。使用达到产物扩增阈值水平(Ct) 所需的PCR循环数来定量这些基因的表达。qPCR分析证实了阵列数据通过qPCR容易地在肿瘤组织中检测到两个标志物，并且不存在肿瘤组织与非恶性组织相比表达显著下降的证据。通过图加-b中的直方图说明了这些RNA在肿瘤组织中与非恶性组织相比的丰度。实施例3 血清中胃肿瘤标志物蛋白的检测在特定的实施方案中，可以使用针对完整蛋白质、蛋白质片段(肽)或蛋白质核心的抗体来完成GTM蛋白的检测。检测和定量蛋白质和肽表达的方法是本领域已知的，并且可以包括依赖于相对蛋白质或肽产生的特异性抗体的方法。可以使用本领域公知的方法来制备单克隆抗体和多克隆抗血清，并且在本文中不需要更多描述。为了检测血清中的GTM，使用Gene Machine OmniGrid 机器人技术将抗GTM的抗体印刷在玻璃载玻片上。将每个抗体在阵列上重复8次。然后在用抗体载玻片温育之前，用生物素标记来自33名胃癌患者和41名对照的血清样品。用抗-生物素抗体检测结合的蛋白，并且使用滚环扩增(RCA)和荧光标记来扩增信号。使用Axon 4000a扫描仪和Gem5Pix 6. 1. 0. 4软件来定量结合的蛋白质的含量。患者的特征显示于图2中。
将来自阵列上每个抗体的荧光信号归一化，并且将8个重复的中值信号以任意荧光单位来表示。说明数据分布的盒形图显示于图3中。对于MUC17的中值信号，胃癌患者为18，836AU，对照组为16，130。这些中值是显著差异的(p = 0. 007)。对于获自MorphoSys 的两个噬菌体展示ZG16抗体(5902和5905)，观察到中值之间的显著差异。胃癌患者样品中ZG16_5902的中值信号为2139AU，相比，对照的为1837AU ；患者中的中值ZG16_5905信号为3063AU，相比，对照的为1675AU。患者和对照之间对于ZG16_5902和ZG16_5905的中值信号是显著不同的(各自为P = 0.05和ρ = 0.005)。该数据证明MUC17和ZG16以显著高于对照的水平存在于胃癌患者的血清中。患者和对照组之间的更多区别将通过免疫学测试程序的改进、对目标抗原具有更高特异性的抗体的鉴定和标志物的联合使用来实现。实施例8 用含有GTM的载体转染的细胞在进一步的实施方案中，提供了可以表达GTM、GTM片段或肽标志物的细胞。因此可以使用原核细胞和真核细胞。例如，大肠杆菌(原核细胞)可以用来产生大量缺乏成熟糖基化的GTM (如果特定GTM通常是糖基化的)。COS细胞、293细胞和多种其他真核细胞可以用于产生糖基化的GTM，或具有正确的折叠，并且因此，具有天然形式的GTM蛋白的三维结构。转染这些细胞的方法是本领域已知的，并且在本文中不需要更多描述。实施例9:试剂盒基于本发明的发现，可以产生几种类型的测试试剂盒。首先，可以制备具有预先装载了检测分子(或“捕获试剂”)的检测装置的试剂盒。在用于检测GTM mRNA的实施方案中，这样的装置可以包括基质(例如，玻璃，硅，石英，金属等)，其上的寡核苷酸作为与待检测的mRNA杂交的捕获试剂。在一些实施方案中，可以通过mRNA (用cy3、cy5、放射性标记或其他标记来标记)与基质上的寡核苷酸杂交来完成mRNA的直接检测。在其他实施方案中，可以通过首先制备所需mRNA的互补DNA(cDNA)来完成mRNA的检测。然后，可以将标记的cDNA与基质上的寡核苷酸杂交，并检测。与所用的检测方法无关，测试GTM表达与表达的标准测量的比较是所希望的。例如，可以将RNA表达对总细胞DNA、组成型表达的RNA (例如，核糖体RNA)的表达或其他相对不变的标志物标准化。抗体也可以用于试剂盒中作为捕获试剂。在一些实施方案中，基质(例如，多孔平板)可以具有与其连接的特异性GTM捕获试剂。在一些实施方案中，试剂盒可以包括封闭试剂。封闭试剂可以用于降低非特异性结合。例如，可以使用来自不含有GTM寡核苷酸的任何常规来源的过量DNA(如，鲑精DNA)来降低非特异性的寡核苷酸结合。可以使用过量的封闭蛋白(如，血清白蛋白)来降低非特异性的抗体结合。可以认识到用于检测寡核苷酸和蛋白质的多种方法是本领域已知的，并且可以使用特异性地检测GTM相关分子的任何策略，并且认为在本发明的范围内。在依赖于抗体检测的实施方案中，可以基于每个细胞，或基于全部细胞、组织或液体蛋白、液体体积、组织质量(重量)来表示GTM蛋白或肽。此外，可以基于相对高丰度血清蛋白(如，白蛋白)来表示血清中的GTM。除了基质，测试试剂盒可以包括捕获试剂(如，探针)、洗涤溶液(例如，SSC、其他盐、缓冲液、去污剂等)以及检测部分(例如，cy3、cy5、放射性标记等)。试剂盒还可以包括使用说明书和包装。尽管参照其特定实施方案描述了本发明，但将认识到可以使用涉及使用所公开标志物的其他实施方案，而没有脱离本发明的范围。工业实用性检测GTM家族成员的方法包括使用微阵列和/或实时PCR方法来检测核酸，以及检测蛋白质和肽。本发明的组合物和方法可用于诊断装置和试剂盒的制备、疾病的诊断、评价疗效和生产适用于测量生物样品中GTM家族成员表达的试剂。参考文献Emanuelsson 0, Nielsen H, Rrunak S, von Heiine G. PredictinR subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence. J Mol Biol.2000 Jul 21 ；300 (4) :1005-16.KroRh A,Larsson B,von Heiine G,Sonnhammer EL. PredictinR transmembrane protein topology with a hidden Markov model -application to complete genomes. J. Mol Biol. 2001 Jan 19 ；305 (3) :567-80.Smyth, G. K. (2005) · Limma : 1 inear models for microarray data. In ' Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R and Bioconductor' . R. Gentleman,V. Carey,S. Dudoit,R. Irizarry,ff. Huber(eds), Springer, New York, pages 397—420.R Development Core Team(2008) · R:A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0，URL http://www. R-proiect. org.Wheeler DL, et al. Database Resources of the National Center for Biotechnology. Nucl Acids Res 31 :28-33 ；2003.
权利要求
1.一种用于检测胃癌的方法，包括⑴提供生物样品；和( )检测所述样品中人酶原粒蛋白16 ( “ZG16”)的水平。
2.权利要求1的方法，其中生物样品中ZG16的过表达表明癌症。
3.权利要求1或权利要求2的方法，包括检测一种或多种其他GTM家族成员的水平。
4.权利要求1至3任一项的方法，其中所述方法进一步包括检测选自黏蛋白 5AC( “MUC5AC”)和黏蛋白17( “MUC17”)的其他GTM家族成员的水平。
5.权利要求1至4任一项的方法，其中所述一种或多种其他GTM家族成员选自由 MUC5AC、MUC17、ZG16、羧肽酶N、多肽 2，83kDa链(“CPN2”)、基质金属蛋白酶 12 (“MMP12”)、抑制素(“ INHBA”)、胰岛素样生长因子7 (“IGFBP7”)、γ -谷氨酰水解酶(“GGH”)、富含亮氨酸脯氨酸的蛋白聚糖(“LEPRE1”)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂S( “CST4”)、分泌型卷曲相关蛋白 4(“SFRP4”)、aSp0rin(“ASPN”)、具有EF手型结构域的细胞生长调节剂1 (“CGREF1”)、激肽释放酶10 (KLKlO)、金属蛋白酶的组织抑制剂1( “TIMP1”)、分泌型酸性富含半胱氨酸蛋白 (“SPARC”)、转化生长因子，13-诱导的(“TGFBI”)、含有EGF的fibulin-样胞外基质蛋白 2 ( “EFEMP2”)、基膜聚糖(Iumican) ( “LUM”)、stannin ( “SNN”)、分泌型磷蛋白 1 ( “SPP1”)、 硫酸软骨素蛋白聚糖2( “CSPG2”)、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(“ASAHl”)、丝氨酸蛋白酶 11 ( “PRSS11”)、分泌型卷曲相关蛋白 2( “SFRP2”)、磷脂酶 A2，XIIB 组(“PLA2G12B”)、 spondin 2，胞外基质蛋白(“SP0N2”)、嗅介蛋白(olfactomedin) 1 ( “0LFM1”)、含有血小板反应蛋白重复1( “TSRC1”)、血小板反应蛋白2( “THBS2”)、adlican、半胱氨酸蛋白酶抑制剂SA( “CST2”)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN( 乂511”)、赖氨酰氧化酶样酶2( “L0XL2”)、甲状腺球蛋白(“TG”)、转化生长因子i31(“TGFBl”)、丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂Clade H成员1( “SERPINH1”)、丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂Clade B成员5( “SERPINB5”)、 基质金属蛋白酶2( “匪 2”)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/1 ^^1 5型(“PCSK5”)、乙酰透明质酸糖蛋白连接蛋白4( “HAPLN4”)、CA19-9、CA72-4、胃蛋白酶原和CEA组成的组。
6.权利要求1至5任一项的方法，其中所测试的GTM标志物包括MUC5AC、MUC17、ZG16、 半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白Hl和丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B5。
7.权利要求1至6任一项的方法，其中通过检测GTMmRNA的水平进行所述检测步骤。
8.权利要求1至6任一项的方法，其中通过检测GTMcDNA的水平进行所述检测步骤。
9.权利要求8的方法，其中使用与所述GTMcDNA的至少一部分互补的寡核苷酸进行所述检测步骤。
10.权利要求8的方法，其中使用正向引物和反向引物用qRT-PCR方法进行所述检测步马聚ο
11.权利要求1至6任一项的方法，其中通过检测GTM蛋白的水平进行所述检测步骤。
12.权利要求1至6任一项的方法，其中通过检测GTM肽的水平进行所述检测步骤。
13.权利要求11或12的方法，其中使用针对所述GTM的抗体进行所述检测步骤。
14.权利要求11至13任一项的方法，其中使用夹层型免疫测定方法，或使用抗体芯片进行所述检测步骤。
15.权利要求11至13任一项的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
16.权利要求11至14任一项的方法，其中所述抗体是多克隆抗血清。
17.一种用于检测GTM的装置，其包括 基质，其上具有GTM捕获试剂；和与所述基质相连的检测仪，所述检测仪能够检测与所述捕获试剂结合的GTM，其中所述 GTM包括人酶原粒蛋白16 ( “ZG16”)。
18.权利要求17的装置，其中所述GTM捕获试剂是寡核苷酸。
19.权利要求17的装置，其中所述GTM捕获试剂是对GTM寡核苷酸、GTM蛋白或GTM肽特异的抗体。
20.一种用于检测癌症的试剂盒，其包含 基质，其上具有GTM捕获试剂；用于显示所述GTM捕获试剂和GTM复合物的工具； 试剂；和使用说明书，其中所述GTM包括人酶原粒蛋白16( “ZG16”)。
21.权利要求20的试剂盒，其中所述GTM捕获试剂是GTM-特异性寡核苷酸。
22.权利要求20的试剂盒，其中所述GTM捕获试剂是对GTM寡核苷酸、GTM蛋白或GTM 肽选择性的GTM特异性抗体。
23.一种检测胃癌的方法，包括步骤提供来自处于患胃癌风险中的患者的测试样品；测量所述测试样品中GTM蛋白的存在；和将所述测试样品中存在的GTM的量与获自不患胃癌受试者的对照样品的值进行比较， 其中所述GTM包含人酶原粒蛋白16 ( “ZG16”)。
24.一种用于筛选胃癌的方法，包括步骤 提供来自测试受试者的测试样品； 测量所述测试样品中GTM的存在；和将所述测试样品中存在的GTM的量与获自不患胃癌受试者的对照样品的值进行比较， 其中所述GTM包括人酶原粒蛋白16( “ZG16”)。
25.权利要求M的方法，其中所述GTM是GTM蛋白或肽。
26.权利要求M的方法，其中所述GTM是GTM特异性的寡核苷酸。
27.权利要求沈的方法，其中所述寡核苷酸是DNA。
28.权利要求沈的方法，其中所述寡核苷酸是RNA。
29.权利要求M至观任一项的方法，其中所述测量步骤使用ELISA测定法。
30.权利要求M至四任一项的方法，其中所述测试样品获自血浆。
31.权利要求M至30任一项的方法，其中所述测试样品获自组织、尿液、胃液、血清和粪便。
全文摘要
肿瘤的早期检测是肿瘤(包括胃肿瘤)患者存活的主要决定因素。GTM基因家族的成员可以在胃肿瘤组织中差异地表达，并且因此可以用作检测胃癌和其他类型癌症的标志物。本发明提供了用于检测肿瘤(包括胃肿瘤)的新GTM，并且特别是人酶原粒蛋白16(ZG16)。GTM可以单独使用或与其他已知GTM一起使用，来提供用于肿瘤(包括胃肿瘤)检测的新标记。
文档编号G01N33/53GK102459646SQ201080031553
公开日2012年5月16日 申请日期2010年5月14日 优先权日2009年5月15日
发明者P·J·吉尔福德 申请人:环太平洋生物技术有限公司