专利名称：鉴定响应抗癌疗法的可能性升高的患者的方法
技术领域：
本申请致力于用于鉴定哪些患者会最多地受益于抗癌剂治疗及对患者监测他们对抗癌剂治疗的敏感性和响应性的方法。
背景技术：
癌症是对人类健康的最致命威胁之一。仅在美国，癌症每年影响近130万新患者，而且是位于心血管疾病之后的第二位死因，占4例死亡中的大约I例。实体瘤对大多数那些死亡负有责任。虽然某些癌症的医学治疗中已经取得了重大进步，但是所有癌症的总体5年存活率在最近20年里只改进了约10%。癌症(或称作恶性肿瘤)以不受控制的方式快速生长和转移，使得及时检测和处理极端困难。根据癌症类型，患者通常有数个治疗选项可用，包括化疗、辐射和基于抗体的药物。对于预测不同治疗方案的临床结果有用的诊断方法会大大有利于对这些患者进行临床安排。如此，需要更有效的手段来确定哪些患者会响应哪种治疗、并且将此确定纳入到对患者更有效的抗癌剂疗法治疗方案，无论用作单一药剂或是与其它药剂组合。发明概述本发明提供用于鉴定会响应抗癌剂，例如VEGF-A拮抗剂诸如例如贝伐单抗治疗的患者的方法。本发明的一个实施方案提供鉴定会受益于包含VEGF拮抗剂的抗癌疗法治疗的患者的方法，该方法包括:测定自患者获得的样品中VEGF121的表达水平，其中自患者获得的样品中的VEGF121水平处于或高于参照水平(例如与参照样品相比)指示该患者会受益于该抗癌疗法的治疗。在一些实施方案中，所述癌症选自下组:结肠直肠癌，成胶质细胞瘤，肾癌，卵巢癌，乳腺癌(包括例如局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌)，胰腺癌(包括例如转移性胰腺癌)，胃癌和肺癌。在一些实施方案中，所述自患者获得的样品是选自下组的成员:全血，血浆，血清，及其组合。在一些实施方案中，所述VEGF121水平是蛋白质水平。在一些实施方案中，所述VEGF121蛋白质水平是通过测量VEGF121血浆蛋白质水平而测定的。在一些实施方案中，血浆VEGF121水平处于或高于参照水平指示该患者会受益于该抗癌疗法，更有可能响应该抗癌疗法，或具有升高的受益于该抗癌疗法的可能性。在一些实施方案中，该方法进一步包括对所述患者施用有效量的包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用有效量的选自下组的第二抗癌疗法:细胞毒剂，化疗剂，生长抑制剂，和抗血管发生剂，及其组合。在一些实施方案中，所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂并行施用。在一些实施方案中，所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂序贯施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用有效量的选自下组的第三抗癌疗法:细胞毒剂，化疗剂，生长抑制剂，和抗血管发生剂，及其组合。在一些实施方案中，所述第三抗癌疗法、所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂并行施用。在一些实施方案中，所述第三抗癌疗法、所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂序贯施用。在一些实施方案中，所述VEGF-A拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌(包括例如局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌)且所述第二抗癌疗法是多西他赛(docetaxel)。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌(包括例如转移性胰腺癌)，所述第二抗癌疗法是吉西他滨(gemcitabine),且所述第三抗癌疗法是厄洛替尼(erlotinib)。在一些实施方案中，所述癌症是胃癌，所述第二抗癌疗法是卡培他滨(capecitabine),且所述第二抗癌疗法是顺钼(cisplatin)。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌，所述第二抗癌疗法是吉西他滨，且所述第二抗癌疗法是顺钼。本发明的又一个实施方案提供预测患有癌症的患者对包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法治疗的响应性的方法，该方法包括:测定自患者获得的样品中VEGF121的表达水平，其中自患者获得的样品中的VEGF121水平处于或高于参照水平(例如与参照样品相比)指示该患者更有可能响应该抗癌疗法的治疗。在一些实施方案中，所述癌症选自下组:结肠直肠癌，成胶质细胞瘤，肾癌，卵巢癌，乳腺癌(包括例如局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌)，胰腺癌(包括例如转移性胰腺癌)，胃癌，和肺癌。在一些实施方案中，所述自患者获得的样品是选自下组的成员:全血，血浆，血清，及其组合。在一些实施方案中，所述VEGF121蛋白质水平是通过测量VEGF121血浆蛋白质水平而测定的。在一些实施方案中，血浆VEGF121水平处于或高于参照水平指示该患者会受益于该抗癌疗法，更有可能响应该抗癌疗法，或具有升高的受益于该抗癌疗法的可能性。在一些实施方案中，该方法进一步包括对所述患者施用有效量的包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用有效量的选自下组的第二抗癌疗法:细胞毒剂，化疗剂，生长抑制剂，和抗血管发生齐IJ，及其组合。在一些实施方案中，所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂并行施用。在一些实施方案中，所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂序贯施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用有效量的选自下组的第三抗癌疗法:细胞毒剂，化疗剂，生长抑制剂，和抗血管发生剂，及其组合。在一些实施方案中，所述第三抗癌疗法、所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂并行施用。在一些实施方案中，所述第三抗癌疗法、所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂序贯施用。在一些实施方案中，所述VEGF-A拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是贝伐单抗。在一些实施方案中，所述抗体是贝伐单抗。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌(包括例如局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌)且所述第二抗癌疗法是多西他赛。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌(包括例如转移性胰腺癌)，所述第二抗癌疗法是吉西他滨，且所述第三抗癌疗法是厄洛替尼。在一些实施方案中，所述癌症是胃癌，所述第二抗癌疗法是卡培他滨，且所述第二抗癌疗法是顺钼。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌，所述第二抗癌疗法是吉西他滨，且所述第二抗癌疗法是顺钼。本发明的还有另一个实施方案提供用于确定有癌症的患者会展现出受益于包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法的可能性的方法，该方法包括:测定自患者获得的样品中VEGF121的表达水平，其中自患者获得的样品中的VEGF121水平处于或高于参照水平(例如与参照样品相比)指示该患者具有升高的受益于该抗癌疗法的可能性。在一些实施方案中，所述癌症选自下组:结肠直肠癌，成胶质细胞瘤，肾癌，卵巢癌，乳腺癌(包括例如局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌)，胰腺癌(包括例如转移性胰腺癌)，胃癌，和肺癌。在一些实施方案中，所述自患者获得的样品是选自下组的成员:全血，血浆，血清，及其组合。在一些实施方案中，所述VEGF121蛋白质水平是通过测量VEGF121血浆蛋白质水平而测定的。在一些实施方案中，血浆VEGF121水平处于或高于参照水平指示该患者会受益于该抗癌疗法，更有可能响应该抗癌疗法，或具有升高的受益于该抗癌疗法的可能性。在一些实施方案中，该方法进一步包括对所述患者施用有效量的包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用有效量的选自下组的第二抗癌疗法:细胞毒剂，化疗剂，生长抑制剂，和抗血管发生剂，及其组合。在一些实施方案中，所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂并行施用。在一些实施方案中，所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂序贯施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用有效量的选自下组的第三抗癌疗法:细胞毒剂，化疗齐IJ，生长抑制剂，和抗血管发生剂，及其组合。在一些实施方案中，所述第三抗癌疗法、所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂并行施用。在一些实施方案中，所述第三抗癌疗法、所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂序贯施用。在一些实施方案中，所述VEGF-A拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是贝伐单抗。在一些实施方案中，所述抗体是贝伐单抗。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌(包括例如局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌)且所述第二抗癌疗法是多西他赛。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌(包括例如转移性胰腺癌)，所述第二抗癌疗法是吉西他滨，且所述第三抗癌疗法是厄洛替尼。在一些实施方案中，所述癌症是胃癌，所述第二抗癌疗法是卡培他滨，且所述第二抗癌疗法是顺钼。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌，所述第二抗癌疗法是吉西他滨，且所述第三抗癌疗法是顺钼。本发明的甚至另一个实施方案提供用于优化包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法的治疗功效的方法，该方法包括:测定自患者获得的样品中VEGF121的表达水平，其中自患者获得的样品中的VEGF121水平处于或高于参照水平(例如与参照样品相比)指示该患者具有升高的受益于该抗癌疗法的可能性。在一些实施方案中，所述癌症选自下组:结肠直肠癌，成胶质细胞瘤，肾癌，卵巢癌，乳腺癌(包括例如局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌)，胰腺癌(包括例如转移性胰腺癌)，胃癌，和肺癌。在一些实施方案中，所述自患者获得的样品是选自下组的成员:全血，血浆，血清，及其组合。在一些实施方案中，所述VEGF121蛋白质水平是通过测量VEGF121血浆蛋白质水平而测定的。在一些实施方案中，血浆VEGF121水平处于或高于参照水平指示该患者会受益于该抗癌疗法，更有可能响应该抗癌疗法，或具有升高的受益于该抗癌疗法的可能性。在一些实施方案中，该方法进一步包括对所述患者施用有效量的包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用有效量的选自下组的第二抗癌疗法:细胞毒剂，化疗剂，生长抑制剂，和抗血管发生剂，及其组合。在一些实施方案中，所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂并行施用。在一些实施方案中，所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂序贯施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用有效量的选自下组的第三抗癌疗法:细胞毒剂，化疗剂，生长抑制剂，和抗血管发生剂，及其组合。在一些实施方案中，所述第三抗癌疗法、所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂并行施用。在一些实施方案中，所述第三抗癌疗法、所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂序贯施用。在一些实施方案中，所述VEGF-A拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是贝伐单抗。在一些实施方案中，所述抗体是贝伐单抗。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌(包括例如局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌)且所述第二抗癌疗法是多西他赛。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌(包括例如转移性胰腺癌)，所述第二抗癌疗法是吉西他滨，且所述第二抗癌疗法是厄洛替尼。在一些实施方案中，所述癌症是胃癌，所述第二抗癌疗法是卡培他滨，且所述第三抗癌疗法是顺钼。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌，所述第二抗癌疗法是吉西他滨，且所述第二抗癌疗法是顺钼。本发明的又一个实施方案提供用于治疗患者中的癌症的方法，该方法包括:确定自患者获得的样品具有处于或高于VEGF121参照水平的水平(例如与参照样品相比)，并对所述患者施用有效量的包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法，由此所述癌症得到治疗。在一些实施方案中，所述癌症选自下组:结肠直肠癌，成胶质细胞瘤，肾癌，卵巢癌，乳腺癌(包括例如局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌)，胰腺癌(包括例如转移性胰腺癌)，胃癌，和肺癌。在一些实施方案中，所述自患者获得的样品是选自下组的成员:全血，血浆，血清，及其组合。在一些实施方案中，所述VEGF121蛋白质水平是通过测量VEGF121血浆蛋白质水平而测定的。在一些实施方案中，血浆VEGF121水平处于或高于参照水平指示该患者会受益于该抗癌疗法，更有可能响应该抗癌疗法，或具有升高的受益于该抗癌疗法的可能性。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用有效量的选自下组的第二抗癌疗法:细胞毒剂，化疗齐IJ，生长抑制剂，和抗血管发生剂，及其组合。在一些实施方案中，所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂并行施用。在一些实施方案中，所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂序贯施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用有效量的选自下组的第三抗癌疗法:细胞毒剂，化疗剂，生长抑制剂，和抗血管发生剂，及其组合。在一些实施方案中，所述第三抗癌疗法、所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂并行施用。在一些实施方案中，所述第二抗癌疗法、所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂序贯施用。在一些实施方案中，所述VEGF-A拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是贝伐单抗。在一些实施方案中，所述抗体是贝伐单抗。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌(包括例如局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌)且所述第二抗癌疗法是多西他赛。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌(包括例如转移性胰腺癌)，所述第二抗癌疗法是吉西他滨，且所述第三抗癌疗法是厄洛替尼。在一些实施方案中，所述癌症是胃癌，所述第二抗癌疗法是卡培他滨，且所述第二抗癌疗法是顺钼。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌，所述第二抗癌疗法是吉西他滨，且所述第二抗癌疗法是顺钼。本发明的另一个实施方案提供用于确定患者是否会受益于包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法治疗的试剂盒，该试剂盒包含用于测定至少一种生物标志物水平的化合物套组来预测患者对包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法治疗的响应性，其中VEGF121水平处于或高于参照水平(例如参照样品中的VEGF121水平)指示该患者会受益于包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法的治疗。在一些实施方案中，所述化合物是蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗体。本发明的又一个实施方案提供用于检测VEGF121的水平的化合物套组，该套组包含至少一种能够特异性结合VEGF121的化合物。优选地，所述化合物套组用于预测患者对包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法的治疗的响应性。在一些实施方案中，所述化合物是蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗体。
通过下面的详述来进一步描述这些和其它实施方案。附图简述
图1:在正在为局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌接受治疗的患者中，对贝伐单抗(低或高剂量)加多西他赛疗法较之安慰剂加多西他赛疗法，总体生物标志物群的无进展存活的Kaplan Meier曲线。短虚线代表安慰剂加多西他赛。实线代表低剂量贝伐单抗(每3周7.5mg/kg)加多西他赛。长虚线代表高剂量贝伐单抗(每3周15mg/kg)加多西他赛。图2:正在为局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌接受治疗的患者中，对贝伐单抗(低剂量)加多西他赛疗法较之安慰剂加多西他赛疗法，生物标志物在后续抗瘤疗法开始之前无进展存活的�：Ρ菷orest图(安慰剂和低剂量贝伐单抗)，一项两分分析。图3:正在为局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌接受治疗的患者中，对贝伐单抗(高剂量)加多西他赛疗法较之安慰剂加多西他赛疗法，生物标志物在后续抗瘤疗法开始之前无进展存活的�：Ρ菷orest图(安慰剂和高剂量贝伐单抗)，一项两分分析。图4:正在为局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌接受治疗的患者中，对贝伐单抗(低或高剂量)加多西他赛疗法较之安慰剂加多西他赛疗法，低VEGFA表达水平(<125pg/ml)(图4A)和高VEGFA表达水平(彡125pg/ml)(图4B)在后续抗瘤疗法开始之前无进展存活的Kaplan Meier曲线。短虚线代表安慰剂加多西他赛。实线代表低剂量贝伐单抗(7.5mg/kg每3周)加多西他赛。长虚线代表高剂量贝伐单抗(15mg/kg每3周)加多西他赛。图5:正在为局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌接受治疗的患者中，对贝伐单抗(低或高剂量)加多西他赛疗法较之安慰剂加多西他赛疗法，低VEGFR2表达水平(〈llng/ml)(图5A)和高VEGFR2表达水平(彡llng/ml)(图5B)在后续抗瘤疗法开始之前无进展存活的Kaplan Meier曲线。短虚线代表安慰剂加多西他赛。实线代表低剂量贝伐单抗(7.5mg/kg每3周)加多西他赛。长虚线代表高剂量贝伐单抗(15mg/kg每3周)加多西他赛。图6:正在为局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌接受治疗的患者中，对贝伐单抗(低或高剂量)加多西他赛疗法较之安慰剂加多西他赛疗法，VEGFA和VEGFR2的低组合表达水平(公式1〈-0.132)和高组合表达水平(公式I > -0.132)在后续抗瘤疗法开始之前无进展存活的Kaplan Meier曲线。实线代表安慰剂加多西他赛。长虚线代表低剂量贝伐单抗(7.5mg/kg每3周)加多西他赛。短虚线代表高剂量贝伐单抗(15mg/kg每3周)加多西他赛。图7:正在为局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌接受治疗的患者中，对贝伐单抗(低或高剂量)加多西他赛疗法较之安慰剂加多西他赛疗法，VEGFA和PLGF的低组合表达水平(公式2〈-0.006)和高组合表达水平(公式2 ^ -0.006)在后续抗瘤疗法开始之前无进展存活的Kaplan Meier曲线。实线代表安慰剂加多西他赛。长虚线代表低剂量贝伐单抗(7.5mg/kg每3周)加多西他赛。短虚线代表高剂量贝伐单抗(15mg/kg每3周)加多西他赛。
图8:SEQ ID NO:1, VEGFA的示例性氨基酸序列。图9:SEQ ID NO:2，VEGFR2的示例性氨基酸序列。
图10:SEQ ID NO:3，PLGF的示例性氨基酸序列。图11:提高VEGFm、VEGF121, VEGF165和VEGF189浓度的测量，如在MPACT芯片上测量的。图12:提高VEGF11Q、VEGF121和VEGF165浓度的测量，如在自动化丨...:lccsys_. 分析仪上使用Elecsys 测定法测量的。
图13:正在为不能手术的局部晚期/转移性胃/胃-食道腺癌接受治疗的患者中，对贝伐单抗加卡培他滨/顺钼疗法较之对照安慰剂加卡培他滨/顺钼疗法，标志物VEGFA高(>lllpg/ml)和低(彡lllpg/ml)表达水平的总体存活(图13A)无进展存活(图13B)的Kaplan Meier 曲线。图14:正在为不能手术的局部晚期/转移性胃/胃-食道腺癌接受治疗的来自亚太地区的患者中，对贝伐单抗加卡培他滨/顺钼疗法较之对照安慰剂加卡培他滨/顺钼疗法，标志物pVEGFA高(>lllpg/ml)和低(< lllpg/ml)表达水平与总体存活(图14A)和无进展存活(图14B)方面治疗效果的关联的Kaplan Meier曲线。图15:正在为不能手术的局部晚期/转移性胃/胃-食道腺癌接受治疗的来自非亚太地区的患者中，对贝伐单抗加卡培他滨/顺钼疗法较之对照安慰剂加卡培他滨/顺钼疗法，标志物VEGFA高(>11 lpg/ml)和低(彡lllpg/ml)表达水平与总体存活(图15A)无进展存活(图15B)方面治疗效果的关联的Kaplan Meier曲线。图16:正在为转移性胰腺癌接受治疗的患者中，贝伐单抗加吉西他滨/厄洛替尼疗法较之对照安慰剂加吉西他滨/厄洛替尼疗法的总体存活(图16A)无进展存活(图16B)的Kaplan Meier曲线。在图中，实线代表贝伐单抗/吉西他滨-厄洛替尼治疗，而虚线代表安慰剂/吉西他滨-厄洛替尼治疗。图17:对正在为转移性胰腺癌接受治疗的患者，关于贝伐单抗加吉西他滨-厄洛替尼疗法对对照安慰剂加吉西他滨-厄洛替尼疗法，对于标志物VEGFA高表达水平(彡152.9pg/ml)和低表达水平(〈152.9pg/ml)，标志物VEGFA (图17A)与总体存活方面治疗效果的关联及标志物VEGFA(图17B)与无进展存活方面治疗效果的关联的Kaplan Meier曲线。在图中，实线代表贝伐单抗/吉西他滨-厄洛替尼治疗，而虚线代表安慰剂/吉西他滨-厄洛替尼治疗。图18:对正在为转移性胰腺癌接受治疗的患者，关于贝伐单抗加吉西他滨-厄洛替尼疗法对对照安慰剂加吉西他滨-厄洛替尼疗法，标志物VEGFA和VEGFR2的组合表达水平高(公式I彡-0.1)和低(公式1〈-0.I)表达水平(图18A)及VEGFA和PLGF的组合表达水平高(公式2 ^ -0.042)和低(公式2〈-0.042)表达水平(图18B)与总体存活方面治疗效果的关联的Kaplan Meier曲线。在图中，实线代表贝伐单抗/吉西他滨-厄洛替尼治疗，而虚线代表安慰剂/吉西他滨-厄洛替尼治疗。图19:对正在为转移性胰腺癌接受治疗的患者，关于贝伐单抗加吉西他滨-厄洛替尼疗法对对照安慰剂加吉西他滨-厄洛替尼疗法，标志物VEGFA和VEGFR2的组合表达水平高(公式I彡-0.1)和低(公式1〈-0.1)表达水平(图19A)及VEGFA和PLGF的组合表达水平高(公式2 ^ -0.042)和低(公式2〈-0.042)表达水平(图19B)与无进展存活方面治疗效果的关联的Kaplan Meier曲线。在图中，实线代表贝伐单抗/吉西他滨-厄洛替尼治疗，而虚线代表安慰剂/吉西他滨-厄洛替尼治疗。
图20:对正在为转移性胰腺癌接受治疗的患者，关于贝伐单抗加吉西他滨-厄洛替尼疗法对对照安慰剂加吉西他滨-厄洛替尼疗法，标志物VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平高(公式3 3 0.837)和低(公式3〈0.837)表达水平与总体存活(图20A)方面治疗效果的关联及标志物VEGFA、VEGFR2和PLGF的组合表达水平高(公式3彡0.837)和低(公式3〈0.837)表达水平与无进展存活(图20B)方面治疗效果的关联的Kaplan Meier曲线。在图中，实线代表贝伐单抗/吉西他滨-厄洛替尼治疗，而虚线代表安慰剂/吉西他滨-厄洛替尼治疗。图21:来自相同患者的EDTA和柠檬酸盐样品、用MPACT测定法测量两次的数据。EDTA血浆的VEGFA浓度比柠檬酸盐要高约40%，其中EDTA-柠檬酸盐方法比较的Spearman相关性为约0.8。发明详述1.导言本发明提供用于 鉴定响应包含VEGF拮抗剂的抗癌疗法的可能性升高或经历转移的可能性升高的患者的方法。I1.定义在某些实施方案中，术语“升高”或“高于”指高于参照水平的水平或通过本文所述方法检测的、VEGF121水平与来自参照样品的VEGF121水平相比5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%或更大的总体升高。在某些实施方案中，术语“升高”指VEGF121水平的升高，其中所述“升高”是与例如自参照样品预先测定的VEGF121水平相比高至少约 1.5,1.75、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、75、80、90、或 100倍。在一个优选的实施方案中，术语“升高的水平”指处于或高于参照水平的值。在某些实施方案中，术语“降低”或“低于”在本文中指低于参照水平的水平或通过本文所述方法检测的、VEGF121和/或VEGFlltl水平与来自参照样品的VEGF121水平相比5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的总体降低。在某些实施方案中，术语“降低”指通过本文所述方法检测的，VEGF121水平的降低，其中“降低”的水平是来自参照样品的VEGF121水平的至多约0.9,0.8,0.7,0.6,0.5,0.4,0.3、
0.2,0.1,0.05、或 0.01 倍或更低。在某些实施方案中，术语“处于参照水平”指与参照样品中通过本文所述方法检测的VEGF121水平相同的水平。在某些实施方案中，术语“参照水平”在本文中指预定值。如技术人员会领会的，参照水平预定和设置为在例如特异性和/或灵敏度方面达到要求。这些要求可以变化，例如在不同管理机构之间。它可以是例如测定法灵敏度或特异性分别要设置成某些限制，例如80%、90%或95%。这些要求也可以在阳性或阴性预测值方面限定。无论如何，基于本发明中给出的教导，总是会有可能到达达到那些要求的参照水平。在一个实施方案中，参照水平是在健康个体中确定的。在一个实施方案中，参照水平是在患者所属疾病实体中预定的。在某些实施方案中，参照值可以例如设置为自调查的疾病实体中的值的总体分布的25%和75%之间的任何百分位。在其它实施方案中，参照水平可以例如设置为自调查的疾病实体中的值的总体分布确定的中值、三分位或四分位。在一个实施方案中，参照水平设置为自调查的疾病实体中的值的总体分布确定的中值。
在本发明的语境中，“VEGF”、“VEGFA”、或“VEGF-A”指血管内皮生长因子蛋白A，以 SEQ ID NO:1 例示，在图 8 中显示(Swiss Prot 登录号 P15692，Gene ID (NCBI):7422)。术语“VEGFA”涵盖具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的蛋白质及其同源物和同等型。术语“VEGF-A”还涵盖VEGF-A的已知的同等型，例如剪接同等型，例如VEGF121、VEGF145, VEGF165,VEGF189和VEGF2tl6，及其天然发生等位和加工形式，包括纤溶酶切割VEGF165生成的110个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如记载于Ferrara, Mol.Biol.Cel 121:687 (2010) ; Leunget al.，Science246:1306 (1989);及 Houck et al.，Mol.Endocrin.5:1806 (1991)。在本发明的语境中，术语“VEGF-A”还涵盖其变体和/或同源物，以及VEGF-A的片段，前提是变体蛋白质(包括同等型)、同源物蛋白质和/或片段受到一种或多种VEGF-A特异性抗体识别,诸如抗体克隆3C5和26503 (它们分别可得自Bender Relia Tech和R&D Systems)和A4.6.1 (如记载于 Kim et al., Growth Factors7 (I): 53-64 (1992))。在本发明的语境中，VEGF、VEGFA、或VEGF-A的术语“同等型”(isoform)指剪接同等型和通过酶促切割(例如通过纤溶酶)生成的形式二者。在本发明的语境中，“VEGFR2”指血管内皮生长因子受体2，以SEQ ID NO:2例示，在图 9 中显示(Swiss Prot 登录号 P35968，Gene ID (NCBI):3791)。术语“VEGFR2”涵盖具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的蛋白质及其同源物和同等型。在本发明的语境中，术语“VEGFR2”还涵盖与氨基酸序列SEQ ID NO:2，或与其变体和/或同源物的氨基酸序列，以及该序列的片段具有至少85%、至少90%或至少95%同源性的蛋白质，前提是变体蛋白质(包括同等型)、同源物蛋白质和/或片段受到一种或多种VEGFR2特异性抗体识别，诸如抗体克隆89115 和 89109，它们可得自 R&D Systems。在本发明的语境中，“PLGF”指胎盘生长因子，以SEQ ID NO:3例示，在图10中显示(Swiss Prot登录号P49763，Gene ID (NCBI):5228)。术语“PLGF”涵盖具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的蛋白质及其同源物和同等型。在本发明的语境中，术语“PLGF”还涵盖与氨基酸序列SEQ ID NO:3，或与其变体和/或同源物的氨基酸序列，以及该序列的片段具有至少85%、至少90%或至少95%同源性的蛋白质，前提是变体蛋白质(包括同等型)、同源物蛋白质和/或片段受到一种或多种PLGF特异性抗体识别，诸如抗体克隆2D6D5和6A11D2，它们可得自 Roche Diagnostics GmbH。术语“VEGF”还指来自非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示小鼠VEGF，等等。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸8至109或I至109的截短形式多肽。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109) ”、“VEGF(1-109) ”或“VEGF165”来鉴别任何此类形式VEGF的提及。截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。依照一个优选的实施方案，VEGF是人VEGF。“ VEGF生物学活性”包括对任何VEGF受体的结合或任何VEGF信号传导活性，调节诸如对正常的和异常的血管发生(angiogenesis)和脉管发生(vasculogenesis)(Ferrara and Davis-Smyth(1997)Endocrine Rev.18:4-25;Ferrara(1999)J.Mol.Med.77:527-543);促进胚胎脉管发生和血管发生(Carmeliet et al.(1996)Nature380:435-439; Ferrara et al.(1996) Nature 380:439-442);及调控雌性生殖道中的和为了骨生长和软骨形成的周期性血管增殖(Ferrara et al.(1998)NatureMed.4:336-340; Gerber et al.(1999) Nature Med.5:623-628)。在作为血管发生和脉管发生中的血管发生因子之外，VEGF，作为多效生长因子，在生理过程诸如内皮细胞存活、血管通透性和血管舒张、单核细胞趋化性和钙内流中展现出多种生物学效应(Ferrara and Davis-Smyth(1997), supra,及 Cebe-Suarez et al., Cell.Mol.LifeSc1.63:601-615(2006)) o此外，最近的研究报道了 VEGF对少数非内皮细胞类型诸如视网膜色素上皮细胞、胰导管细胞、和许旺(Schwann)细胞的促有丝分裂效应(Guerrinet al.(1995)J.Cell Physiol.164:385-394;Oberg-Welsh et al.(1997)Mol.Cel1.Endocrinol.126:125-132;Sondell et al.(1999)J.Neurosc1.19:5731-5740)。“VEGF拮抗剂”或“VEGF特异性拮抗剂”指能够结合VEGF，降低VEGF表达水平，或者中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF生物学活性(包括但不限于VEGF与一种或多种VEGF受体的结合及由VEGF介导的血管发生和内皮细胞存活或增殖)的分子。在本发明的方法中有用的VEGF特异性拮抗剂包括特异性结合VEGF的多肽、特异性结合VEGF受体的多肽、抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子和衍生物、融合蛋白(例如VEGF-Trap(Regeneron))、和VEGF121-白树毒素(Peregrine)。VEGF特异性拮抗剂还包括VEGF多肽的拮抗性变体、针对VEGF的反义核碱基寡聚物、针对VEGF的小RNA分子、RNA适体、肽体、和针对VEGF的核酶、在严格条件下与编码VEGF或VEGF受体的核酸序列杂交的核酸(例如RNAi )、免疫粘附素、抗VEGF受体抗体和VEGF受体拮抗剂诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂结合VEGF并抑制VEGF诱导的体外内皮细胞增殖。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂以大于非VEGF或非VEGF受体的亲和力结合VEGF或VEGF受体。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂以介于IuM和IpM之间的Kd结合VEGF或VEGF受体。依照另一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂以介于500nM和IpM之间的Kd结合VEGF或VEGF受体。VEGF特异性拮抗剂还包括结合VEGF且能够阻断、抑制、消除、降低、或干扰VEGF生物学活性的非肽小分子。如此，术语“VEGF活性”明确包括VEGF介导的VEGF生物学活性。在某些实施方案中，VEGF拮抗剂将VEGF的表达水平或生物学活性降低或抑制了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或更多。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂选自:多肽诸如抗体、肽体、免疫粘附素、小分子或适体。在一个优选的实施方案中，所述抗体是抗VEGF抗体诸如贝伐单抗(AVAST1N )或抗VEGF受体抗体诸如抗VEGFR2或抗VEGFR3抗体。VEGF拮抗剂的其它例子包括:VEGF-Trap、Mucagen, PTK787、SUl 1248、AG-013736, Bay439006 (sorafenib)、ZD-6474、CP632、CP-547632、AZD-2171、CDP-171、SU-14813、CHIR-258、AEE-788、SB786034、BAY579352、CDP-791、EG-3306、GW-786034、RWJ-417975/CT6758 和 KRN-633。“抗VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。在某些实施方案中，所选择的抗体通常会具有足够的对VEGF的结合亲和力，例如，该抗体可以以介于IOOnM-1pM之间的Kd值结合hVEGF。抗体亲和力可通过例如基于表面等离振子共振的测定法(诸如PCT申请公开文本N0.W02005/012359中所记载的BIAcore测定法)；酶联免疫吸附测定法(ELISA);和竞争测定法(例如RIA)来测定。优选地，本发明的抗VEGF抗体可用作治疗剂，用于靶向和干扰其中牵涉VEGF活性的疾病或疾患。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如P1GF、PDGF或bFGF。一种优选的抗VEGF抗体是与杂交瘤ATCCHB10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体。更优选地,抗VEGF抗体是依照Presta et al.(1997)Cancer Res.57:4593-4599生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于称作贝伐单抗(Bevacizumab, BV; Avastin )的抗体。依照另一个实施方案，可以使用的抗VEGF抗体包括但不限于W02005/012359中披露的抗体。依照一个实施方案，所述抗VEGF抗体包含 W02005/012359 的图 24、25、26、27 和 29 中披露的任一抗体(例如 G6、G6-23、G6-31、G6-23.1、G6-23.2、B20、B20-4和B20.4.1)的重链可变区和轻链可变区。在另一个优选的实施方案中，称为ranibizumab的抗VEGF抗体是为了眼病诸如糖尿病神经病变和AMD而施用的VEGF拮抗剂。在某些实施方案中，抗VEGF抗体可用作治疗剂，用于靶向和干扰其中牵涉VEGF活性的疾病或疾患。还有，该抗体可进行其它生物学活性测定法，例如为了评估其作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且取决于抗体的靶抗原和预定用途。例子包括HUVEC抑制测定法；肿瘤细胞生长抑制测定法(如例如W089/06692中所记载的)；抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利5，500，362)；及激动活性或造血测定法(参见W095/27062)。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如P1GF、PDGF或bFGF。在一个实施方案中，抗VEGF抗体是与杂交瘤ATCC HB10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体。在另一个实施方案中，抗VEGF抗体是依照Presta et al.(1997)Cancer Res.57:4593-4599生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于称作贝伐单抗(Bevacizumab, BV; AVASTIN )的抗体。抗VEGF 抗体“贝伐单抗(BV)”，也称作 “rhuMAb VEGF” 或 “AVASTIN ”，是一种依照Presta et al.(1997) Cancer Res.57:4593-4599生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体。它涵盖突变的人IgGl框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1 (其阻断人VEGF对其受体的结合)的抗原结合互补决定区。贝伐单抗大约93%的氨基酸序列，包括大部分框架区，衍生自人IgGl，而大约7%的序列衍生自小鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗具有约149，000道尔顿的分子量，而且是糖基化的。贝伐单抗和其它人源化抗VEGF抗体进一步记载于美国专利 N0.6，884，879 及 W02005/044853。抗VEGF抗体Ranibizumab或LUCENUS⑩抗体或rhuFab V2是人源化的、亲和力成熟的抗人VEGF Fab片段。Ranibizumab是通过标准重组技术在大肠杆菌表达载体和细菌发酵中生成的。Ranibizumab是未糖基化的且分子量为约48，000道尔顿。参见W098/45331和 US20030190317。两种表征最全面的VEGF受体是VEGFRl (也称作Flt-1)和VEGFR2 (鼠同系物也称作KDR和FLK-1 )。每一种受体对每一种VEGF家族成员的特异性有所不同，但是VEGF-A结合Flt-1和KDR 二者。全长Flt-1受体包括具有七个Ig结构域的胞外结构域、跨膜结构域、和具有酪氨酸激酶活性的胞内结构域。胞外结构域涉及VEGF结合，而胞内结构域涉及信号转导。特异性结合VEGF的VEGF受体分子或其片段可以在本发明的方法中用作结合和隔绝VEGF蛋白，由此阻止它发信号的VEGF抑制剂。在某些实施方案中，VEGF受体分子或其VEGF结合片段是可溶性形式，诸如sFlt-Ι。受体的可溶性形式发挥对VEGF蛋白生物学活性的抑制效应，其通过结合VEGF，由此阻止它结合其在靶细胞表面上存在的天然受体来实现。还包括VEGF受体融合蛋白，下文描述了它们的例子。嵌合VEGF受体蛋白指具有自至少两种不同蛋白质(其中至少一种是VEGF受体蛋白，例如fit-ι或KDR受体)衍生的氨基酸序列且能够结合并抑制VEGF生物学活性的受体分子。在某些实施方案中，本发明的嵌合VEGF受体蛋白由自只有两种不同VEGF受体分子衍生的氨基酸序列组成；然而，可以将包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、或所有七个来自flt-Ι和/或KDR受体胞外配体结合区的Ig样结构域的氨基酸序列连接至来自其它无关蛋白质的氨基酸序列，例如免疫球蛋白序列。与Ig样结构域组合的其它氨基酸序列对于本领域普通技术人员会是显而易见的。嵌合VEGF受体蛋白的例子包括但不限于可溶性Flt-l/Fc、KDR/Fc、或Flt-1/KDR/Fc (也称作VEGF Trap)(参见例如PCT申请公开文本N0.W097/44453)。可溶性VEGF受体蛋白或嵌合VEGF受体蛋白包括没有经跨膜结构域而固定至细胞表面的VEGF受体蛋白。因此，VEGF受体(包括嵌合受体蛋白)的可溶性形式，虽然能够结合并灭活VEGF，但是不包含跨膜结构域，并如此一般不会变成与该分子在其中表达的细胞的细胞膜相结合。别的VEGF 抑制剂记载于例如 W099/24440, PCT 国际申请 PCT/IB99/00797, W095/21613, W099/61422,美国专利 N0.6，534，524，美国专利 N0.5，834，504，TO98/50356,美国专利 N0.5，883，113，美国专利 N0.5，886，020，美国专利 N0.5，792，783，美国专利 N0.6，653，308，W099/10349, W097/32856, W097/22596, W098/54093, W098/02438, W099/16755,及W098/02437，通过述及将它们都完整收入本文。如本文中使用的，术语“B20系列多肽”指包括结合VEGF的抗体的多肽。B20系列多肽包括但不限于自B20抗体的序列衍生的抗体或美国公开文本N0.20060280747,美国公开文本N0.20070141065和/或美国公开文本N0.20070020267中记载的B20衍生抗体，通过述及明确将这些专利申请的内容收入本文。在一个实施方案中，B20系列多肽是美国公开文本N0.20060280747,美国公开文本N0.20070141065和/或美国公开文本N0.20070020267中记载的B20-4.1。在另一个实施方案中，B20系列多肽是美国专利申请60/991，302中记载的B20-4.1.1，通过述及将其完整公开内容收入本文。如本文中使用的，术语“G6系列多肽”指包括结合VEGF的抗体的多肽。G6系列多肽包括但不限于自G6抗体的序列衍生的抗体或美国公开文本N0.20060280747，美国公开文本N0.20070141065和/或美国公开文本N0.20070020267中记载的G6衍生抗体。美国公开文本N0.20060280747，美国公开文本N0.20070141065和/或美国公开文本N0.20070020267中记载的G6系列多肽包括但不限于G6_8, G6-23和G6-31。对于别的抗体，参见美国专利N0.7，060，269，6，582，959，6，703，020; 6, 054，297;W098/45332; W096/30046; W094/10202; EP0666868B1;美国专利申请公开 N0.2006/009360,2005/0186208, 2003/0206899, 2003/0190317, 2003/0203409,和 2005/0112126;及 Popkovet al., Journal of Immunological Methods288:149-164 (2004)。在某些实施方案中，其它抗体包括那些结合人 VEGF 上包含残基 F17，M18, D19, Y21, Y25, Q89, 191，K101, E103,和 C104或者包含残基F17，Y21, Q22, Y25, D63, 183和Q89的功能性表位的。还知道其它抗VEGF抗体，而且记载于例如Liang et al.，J BiolChem281, 951-961 (2006)ο患者对抗癌剂治疗的“有效响应"(effective response)或患者对VEGF拮抗剂治疗的“响应性”(responsiveness)或“敏感性”(sensitivity)指源自用抗癌剂(诸如例如抗VEGF-A抗体)进行的治疗或作为该治疗的结果,给予患者(有癌症风险或患有癌症)的临床或治疗受益。此类受益包括细胞或生物学应答、完全响应、部分响应、稳定的病情(没有进展或复发)、或源自用该拮抗剂进行的治疗或作为该治疗的结果的患者响应及稍后复发。例如，有效响应可以是缩小的肿瘤尺寸、延长的无进展存活、或总体存活。如本文中使用的，“拮抗剂”指抑制或降低它们所结合的分子的生物学活性的化合物或药剂。拮抗剂包括结合VEGF的抗体、合成或天然序列肽、免疫粘附素、和小分子拮抗齐U，任选偶联有或融合至另一分子。“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低它所结合的抗原的生物学活性的抗体。如本文中使用的，“激动性抗体”指部分或完全模拟感兴趣多肽的至少一种功能活性的抗体。术语“抗体”在本文中以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。在某些实施方案中，在本文提供的方法中作为VEGF拮抗剂使用的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对VEGF，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合VEGF的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达VEGF的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(Milstein, C.and Cuello, A.C., Nature305 (1983)537-540, W093/08829,及 Traunecker,A.et al., EMBO J.10(1991)3655-3659)和“结-入-穴” (knob-1n-hole)工程化(见例如美国专利N0.5，731，168)。也可以通过用于生成抗体Fe-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(W02009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利N0.4，676，980,及Brennan, M.etal.，Science229 (1985) 81-83);使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny，S.A.et al.，J.1mmunol.148(1992) 1547-1553);使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如 Holliger, P.et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90 (1993) 6444-6448);及使用单链 Fv(sFv) 二聚体(见例如 Gruber, M et al., J.1mmunol.152 (1994) 5368-5374);及如例如Tutt，A.et al.，J.1mmunol.147 (1991) 60-69中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如US2006/0025576)。本文中的抗体或片段还包括包含结合VEGF及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用 FAb” 或“DAF”(见例如 US2008/0069820)。
在本文提供的方法中作为VEGF拮抗剂使用的抗体或抗体片段还包括多特异性抗体，如记载于 W02009/080251, W02009/080252, W02009/080253, W02009/080254, W02010/112193, W02010/115589, W02010/136172, W02010/145792,及 W02010/145793。双特异性 VEGF抗体的例子记载于例如 W02010/040508 (VEGF-ANG2)，PCT/EP2011/054504 (VEGF-ANG2)，W02005/087812 (VEGF-PDGF)，W02009120922(VEGF-PDGFR β)，W02011/039370(VEGF-DII4)。“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在有些实施方案中，将抗体纯化至(I)根据例如Lowry法的测定，抗体重量超过95%，而在有些实施方案中，重量超过99%，(2)足以通过使用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重⑶链构成的约150，000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(Vh)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(')，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变域可以称为“VH”。轻链的可变域可以称为“VL”。这些结构域一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区(HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR —起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见 Kabat et al., Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第 5 版，National Institute of Health, Bethesda, MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞的细胞毒性中的参与。根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(K)和拉姆达(λ)。根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、Υ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般性描述于例如 Abbas et al.Cellular and Mol.1mmunology, 4th ed.(ff.B.Saunders, C0., 2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价关联而形成的更大融合分子的一部分。术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体而非如下文所定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fe区的抗体。“裸抗体(裸露的抗体)”为本发明目的指未偶联细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab，)2和Fv片段；双抗体(diabody);线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fe”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F (ab’)2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连接，使得轻链和重链可以在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，每个可变域的三个HVR相互作用而在Vh-' 二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个HVR —起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。Fab片段包含重链和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CHl)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于重链CHl结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个 或多个半胱氨酸。Fab’ -SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab’的称谓。？(&13’)2抗体片段最初是作为在Fab’片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab’片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的Vh和\结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在Vh与'结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见例如Pluckthun,于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 编，Springer-Verlag, New York, 1994,第 269-315 页。术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一条多肽链(Vh-Vl)中包含相连的重链可变域(Vh)和轻链可变域(')。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例如EP404, 097;W01993/01161;Hudson et al., Nat.Med.9:129-134(2003);及 Hollinger etal., PNAS USA90:6444-6448 (1993)。三抗体(Triabody)和四抗体(tetrabody)也记载于Hudson et al., Nat.Med.9:129-134 (2003) 术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变，例如天然存在的突变。如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是分立的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein, Nature,256:495-497 (1975) ;Hongo et al.，Hybridoma, 14 (3):253-260 (1995) ;Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress,second ed.(1988) ;Hammerling et al., In:Monoclonal Antibodies andT-Cell Hybridomas, 563-681(Elsevier, N.Y.，1981))、重组 DNA 法(参见例如美国专利N0.4, 816, 567)、卩遼菌体展不技术(参见例如Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991) ;Marks et al.，J.Mol.Biol.222: 581-597 (1992) ; Sidhu et al., J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004) ;Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5): 1073-1093(2004);Fellouse, PNAS USAlOl (34):12467-12472(2004);及 Lee et al.,J.1mmunol.Methods284 (1-2):119-132 (2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如W01998/24893;W01996/34096;W01996/33735;W01991/10741;Jakobovits et al.,PNAS USA90:2551-2555(1993);Jakobovits et al., Nature362:255-258(1993);Bruggemann et al., Year inImmunol.7:33 (1993);美国专利 N0.5，545，807; 5，545，806; 5，569，825; 5，625，126; 5，633，425;和5，661，016;Marks et al., Bio/TechnologylO:779-783 (1992);Lonberg et al., Nature368:856-859(1994);Morrison, Nature368:812-813(1994);Fishwild et al., NatureBiotechnol.14:845-851 (1996);Neuberger, Nature Biotechnol.14:826(1996);及Lonberg and Huszar, Intern.Rev.Tmmunol.13:65-93(1995))。单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(例如美国专利N0.4，816，567;Morrisonet al., PNAS USA81:6851-6855 (1984))。嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫猕猴而生成的抗体。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的HVR残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家兔、或非人灵长类动物的HVR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。可以进行这些修饰来进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如Jones et al.，Nature321:522-525 (1986) ; Riechmann et al., Nature332:323-329 (1988) ;&Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596 (1992)。还可参见例如 Vaswani and Hamilton, Ann.Allergy,AsthmafcTmmuno1.1:105-115 (1998) ; Harris, Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038 (1995) ;Hurle and Gross, Curr.0p.Biotech.5:428-433(1994);及美国专利 N0.6，982，321 和7，087，409。“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括曬菌体展不文库(Hoogenboom and Winter, J.Mol.Biol., 227:381 (1991) ;Markset al.，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991))。还可用于制备人单克隆抗体的是以下文献中记载的方法:Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, AlanR.Liss, p.77 (1985) ;Boerner et al., J.1mmunol.147(1):86-95(1991)。还可参见 van Dijkand van de Winkel, Curr.0pin.Pharmacol.，5:368-74(2001)。可通过给已经修饰以应答抗原性刺激而生成人抗体但其内源基因组已经失能的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠(xenomice)施用抗原来制备人抗体(参见例如6，075, 181和6，150, 584，关于XEN0M0USE 技术)。还可参见例如Li et al., PNAS USA，103:3557-3562 (2006)，关于经人B-细胞杂交瘤技术生成的人抗体。术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR:三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.,Immunityl3:37-45 (2000);Johnson and Wu, In:Methods in Molecular Biology,248:1-25(Lo, ed., HumanPress, Totowa, NJ, 2003)。事实上,仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如 Hamers-Casterman et al.，Nature363:446-448 (1993)，及Sheriff et al., Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。作为Kabat互补决定区(OTR)的HVR是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al., Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD (1991))。Chothia 改为指结构环的位置(Chothia and Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR 代表 Kabat CDR 与 Chothia 结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。
权利要求
1.一种鉴定会受益于包含VEGF拮抗剂的抗癌疗法治疗的患者的方法，该方法包括:测定自患者获得的样品中VEGF121的表达水平，其中自患者获得的样品中的VEGF121水平处于或高于参照水平指示该患者会受益于该抗癌疗法的治疗。
2.一种预测患有癌症的患者对包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法治疗的响应性的方法，该方法包括:测定自患者获得的样品中VEGF121的表达水平，其中自患者获得的样品中的VEGF121水平处于或高于参照水平指示该患者更有可能响应该抗癌疗法的治疗。
3.一种用于确定有癌症的患者会展现出受益于包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法的可能性的方法，该方法包括:测定自患者获得的样品中VEGF121的表达水平，其中自患者获得的样品中的VEGF121水平处于或高于参照水平指示该患者具有升高的受益于该抗癌疗法的可能性。
4.一种优化包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法的治疗功效的方法，该方法包括:测定自患者获得的样品中VEGF121的表达水平，其中自患者获得的样品中的VEGF121水平处于或高于参照水平指示该患者具有升高的受益于该抗癌疗法的可能性。
5.一种用于治疗患者中的癌症的方法，该方法包括:确定自患者获得的样品具有处于或高于参照样品中V EGF121水平的VEGF121水平，并对所述患者施用有效量的包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法，由此该癌症得到治疗。
6.权利要求1至5任一项的方法，其中所述癌症选自下组:结肠直肠癌，成胶质细胞瘤，肾癌，卵巢癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，和肺癌。
7.权利要求1至5任一项的方法，其中所述自患者获得的样品选自下组:全血，血浆，血清，及其组合。
8.权利要求1至5任一项的方法，其中所述VEGF121水平是蛋白质水平。
9.权利要求8的方法，其中所述蛋白质水平是通过测量血浆蛋白质水平而测定的。
10.权利要求9的方法，其中自患者获得的样品中VEGF121的血浆水平处于或高于参照样品中的VEGF121水平指示该患者会受益于该抗癌疗法、更有可能响应该抗癌疗法、或具有升高的受益于该抗癌疗法的可能性。
11.权利要求1至4任一项的方法，进一步包括对所述患者施用有效量的包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法。
12.权利要求11的方法，其中所述VEGF-A拮抗剂是抗体。
13.权利要求12的方法，其中所述抗体是贝伐单抗。
14.权利要求11的方法，进一步包括施用有效量的选自下组的第二抗癌疗法:细胞毒齐[J，化疗剂，生长抑制剂，和抗血管发生剂，及其组合。
15.权利要求14的方法，其中所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂并行施用。
16.权利要求14的方法，其中所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂序贯施用。
17.权利要求14的方法，进一步包括施用有效量的选自下组的第三抗癌疗法:细胞毒齐[J，化疗剂，生长抑制剂，和抗血管发生剂，及其组合。
18.权利要求17的方法，其中所述第三抗癌疗法、所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂并行施用。
19.权利要求17的方法，其中所述第三抗癌疗法、所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂序贯施用。
20.权利要求5的方法，其中所述VEGF-A拮抗剂是抗体。
21.权利要求20的方法，其中所述抗体是贝伐单抗。
22.权利要求5的方法，其中所述抗癌疗法进一步包括施用有效量的选自下组的第二抗癌疗法:细胞毒剂，化疗剂，生长抑制剂，和抗血管发生剂，及其组合。
23.权利要求19的方法，其中所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂并行施用。
24.权利要求19的方法，其中所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂序贯施用。
25.权利要求19的方法，其中所述抗癌疗法进一步包括施用有效量的选自下组的第三抗癌疗法:细胞毒剂，化疗剂，生长抑制剂，和抗血管发生剂，及其组合。
26.权利要求25的方法，其中所述第三抗癌疗法、所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂并行施用。
27.权利要求25的方法，其中所述第三抗癌疗法、所述第二抗癌疗法和所述VEGF-A拮抗剂序贯施用。
28.一种用于确定患者是否会受益于包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法的治疗的试剂盒，该试剂盒包括:能够特异性结合VEGF121的化合物套组，和使用所述化合物来测定至少一种生物标志物的水平以预测患者对包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法的治疗的响应性的说明，其中VEGF121水平处于或高于参照样品中的VEGF121水平指示该患者会受益于包含VEGF-A拮抗剂的抗癌疗法的治疗。
29.权利要求28的试剂盒，其中所述化合物是蛋白质。
30.权利要求29的试剂 盒，其中所述蛋白质是抗体。
31.一种用于检测VEGF121的水平的化合物套组，该套组包括能够特异性结合VEGF121的至少一种化合物。
32.权利要求31的化合物套组，其中所述化合物是蛋白质。
33.权利要求32的化合物套组，其中所述蛋白质是抗体。
全文摘要
本发明提供用于鉴定会受益于包含VEGF拮抗剂的抗癌疗法治疗的患者的方法。本发明还提供用于监测患者对抗癌疗法的响应的方法。本发明还提供用于所述方法的试剂盒和制品。
文档编号G01N33/574GK103180737SQ201180044980
公开日2013年6月26日 申请日期2011年7月18日 优先权日2010年7月19日
发明者H.安德烈斯, S.L.德哈斯, R.埃利奥特, J.卡尔, Y-J.G.孟, G.D.普洛曼, S.谢勒, N.怀尔德 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司
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