专利名称：异柠檬酸测定试剂盒及异柠檬酸的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种异柠檬酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定异拧檬 酸浓度的方法，属于食品检验测定技术领域。
背景技术：
异柠檬酸isocitricadd是柠檬酸的异构体，虽然量少，但广泛存在于生 物界。在落地生根属(Bryophyllum)等多汁植物的叶、或悬钩子类中特别 多，生物能够利用的是D型。是三羧酸循环中的一个成分。柠檬酸在鸟头 酸酶的作用下可逆地生成异柠檬酸和顺鸟头酸。在异柠檬酸脱氢酶(EC 1丄1.41; EC 1丄1.42)的作用下变成a-酮戊二酸，在异柠檬酸裂合酶 (isocitrate lyase, EC4. 1. 3. 1)的作用下变成琥珀酸与乙醛酸。
中华人民共和国国家标准，GBT16771-1997，规定了橙、柑、桔汁及其 饮料中D-异柠檬酸的测定方法一紫外分光光度法。该方法适用于判定橙、 柑、桔浓縮汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5%的橙、柑、桔汁饮料的总 D-异柠檬酸的测定。其测定原理异柠檬酸脱氢酶isocitrate dehydrogenase 有两种类型以NAD为辅酶的酶(EC1. 1. 1. 41)和要NADP为辅酶 的酶(EC1. 1. 1. 42)，两者催化同一反应。
异柠檬酸+NAD(P)+# a-酮戊二酸+C02 + NAP(P)H + H+ 在异柠檬酸脱氢酶催化下，样品中的D-异拧檬酸盐与NAD或NADP作用， 生成NADH或NADPH的含量，相当于D-异柠檬酸盐的量。在波长340nm 处测定吸光度，确定样品中总D-异柠檬酸的含量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色 去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶) 联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型 辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定异柠檬酸浓度的方法，同 时，本发明还将给出用以实现该方法的异柠檬酸测定试剂盒，采用该试剂 不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行异柠檬酸浓 度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明异柠檬酸浓度测定方法原理如下
D-异拧檬酸+辅酶异柠檬酸脱氢酶二氧化碳+
酮戊二酸+还原型辅酶 二氧化碳+亚铁细胞色素 甲酸脱氢酶 甲酸+
高铁细胞色素
甲酸+辅酶 甲酸脱氢酶 二氧化碳+还原型辅酶 这种方法应用异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase; EC 1.1.1.41; EC 1.1.1.42)酶(偶)联甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase; EC 1.2.2.1; EC 1.2.2.3)、辅酶依赖型甲酸脱氢酶(NADP-dependent formate dehydrogenase; EC 1.2丄2; EC 1.2丄43)酶促反应速率比色法。异柠檬酸脱氢酶，作为作 用酶，酶解异柠檬酸反应产生二氧化碳，同时也是显色酶，将辅酶还原成 为还原型辅酶；再通过(偶)联合甲酸脱氢酶、辅酶依赖型甲酸脱氢酶的 作用，甲酸脱氢酶也作为作用酶，利用二氧化碳产生甲酸；辅酶依赖型甲 酸脱氢酶又作为循环酶又是显色酶， 一面将甲酸变回二氧化碳，使之不断 循环利用； 一面又将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nrn处吸光度上 升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算异柠檬酸的浓 度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明异柠檬酸测定试剂盒
较为理想:
缓冲液 稳定剂 辅酶
异柠檬酸脱氢酶 甲酸脱氢酶
辅酶依赖型甲酸脱氢酶 亚铁细胞色素
100 mmol/L 500 mmol/L 3 mmol/L 10000 U/L 12000 U/L 12000 U/L 10 mmol/L
本发明的异柠檬酸测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、辅酶依赖
型甲酸脱氢酶、亚铁细胞色素。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体
试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、亚铁细胞色素。
试剂2
缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、辅酶依赖型甲酸脱氢酶。
辅酶、异柠檬酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、辅酶依赖型甲酸脱氢酶、亚铁细
胞色素在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在 使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、亚铁细胞色素。
试剂2
缓冲液、稳定剂、甲酸脱氢酶、辅酶依赖型甲酸脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、异拧檬酸脱氢酶。
辅酶、异柠檬酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、辅酶依赖型甲酸脱氢酶、亚铁细 胞色素在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉 状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定异柠檬酸浓度的方法，其辅酶 可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的异柠檬酸测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L异柠檬酸脱氢酶 甲酸脱氢酶
辅酶依赖型甲酸脱氢酶 亚铁细胞色素
10000 U/L 12000U/L 12000U/L 10 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光
度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与 试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2 分钟左右，检测时间3分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出异柠檬酸的浓度 大小。 实施例二
本实施例的异柠檬酸测定试剂为双试剂，包括
试剂l
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂
辅酶
亚铁细胞色素
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 10 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
500 mmol/L异柠檬酸脱氢酶
甲酸脱氢酶
辅酶依赖型甲酸脱氢
10000U/L 12000 U/L 12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光
度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm,被测异柠檬酸样品与
试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延
迟时间大约2分钟左右，检测时间3分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析
仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。
实施例三
本实施例的异柠檬酸测定试剂为三试剂，包括-试剂l
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定剂
辅酶
亚铁细胞色素 试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
甲酸脱氢酶
辅酶依赖型甲酸脱氢酶
10Ommol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 10 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 12000U/L 12000U/L试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
异柠檬酸脱氢酶 10000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定异柠檬酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C,反应 时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测异柠檬酸样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应 方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间3分钟左 右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出异柠檬酸的浓度 大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的测定方法均能达到 本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析 仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0010; 吸光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(RX).99)线 形范围可达12.56 mmol /L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±6%; 试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《3.5%;试剂的灵敏度 可达0.0568 ± 0.0029 AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形 范围宽广，足以便于推广应用。
权利要求
1. 一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法的异柠檬酸的浓度测定方法，其方法原理如下D-异柠檬酸+辅酶 <u>异柠檬酸脱氢酶</u> 二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶二氧化碳+亚铁细胞色素 <u>甲酸脱氢酶</u> 甲酸+高铁细胞色素甲酸+辅酶 <u>甲酸脱氢酶</u> 二氧化碳+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出异柠檬酸的浓度大小测定结果。
2. —种异柠檬酸测定试剂盒，主要成分包括:缓冲液稳定剂异柠檬酸脱氢酶甲酸脱氢酶辅酶依赖型甲酸脱氢酶<formula>formula see original document page 0</formula>亚铁细胞色素试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、辅酶依赖型甲酸脱氢酶、亚铁细胞色素组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、辅酶依赖型甲酸脱氢酶、亚铁细胞色素组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、亚铁细胞色素组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、辅酶依赖型甲酸脱氢酶组成。辅酶、异柠檬酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、辅酶依赖型甲酸脱氢酶、亚铁细胞色素在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、辅酶依赖型甲酸脱氢酶、亚铁细胞色素组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、亚铁细胞色素组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、甲酸脱氢酶、辅酶依赖型甲酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶组成。辅酶、异柠檬酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、辅酶依赖型甲酸脱氢酶、亚铁细胞色素在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂14000 mmol/L或0.1%-100°/。体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的异柠檬酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定异柠檬酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、亚铁细胞色素、异柠檬酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、辅酶依赖型甲酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464281SQ20071019143
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
