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专利名称：磺胺类药物elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测磺胺类药物残留量的试 剂盒，特别是检测动物组织、蜂蜜、牛奶、尿液中磺胺类药物残留量的酶联免疫检测(ELISA)试剂盒，ELISA(Enzyme LinkedImmunosorbnent Assay)是酶联免疫吸附剂测定的简称,它是继免疫突光和放射免疫技术之后发展起来的一种酶免技术。
背景技术：
磺胺类药物(Sulfonamides, SAs)是一类具有对氨基苯磺酰胺结构、用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物。因具有广谱、稳定、经济、易用以及联合抗菌增效剂效果可提高数十倍的特点，常以亚治疗浓度的药物做为饲料添加剂来预防疾病的发生，提高饲料的转化率和促进动物生长，其中常用的SAs就有十几种。但该类药物存在严重副作用，人体中长期存在会导致许多细菌对磺胺类药物产生耐药性，且有潜在的致癌性，因此已引起了国内外的高度重视。我国以及美国、欧盟等国家规定了动物性食品中总磺胺以及单个磺胺的最高残留限量(MRLs)为O. lmg/kg，其中磺胺二甲基嘧啶(SM2)的MRLs为O. 025 μ g/ml ο目前，磺胺类药物残留的检测方法主要有微生物学法、理化分析方法和免疫法等。微生物学法简便、费用低，但操作费时且敏感性、特异性都较差，在定性定量上都存在困难，不能满足现代残留检测的需要，甚至有些检测结果还达不到最高残留限量的要求；理化法常作为确证方法用于测定动物组织中的药物残留，如气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、气-质联用(GC-MS)、液-质联用(HPLC-MS)等，这些方法灵敏、准确，特异性强、分离度好，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器、样品的前处理复杂、繁琐费时、检测的成本较高，不能现场操作，而且需专业人员操作，所以限制了其应用；与之相比，酶联免疫方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测等优点而且所需设备少，操作简单易学，成本低廉，能够更好地满足我国畜禽养殖户、屠宰场、食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的磺胺类药物残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中磺胺类药物残留量的测定，减少了检测样本所需要的时间。本实用新型可以检测7种磺胺类药物。本实用新型的技术方案是一种磺胺类药物ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被磺胺类药物偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装的酶标反应微孔条有8个反应孔，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，下凹瓶位由塑料泡沫制成，以塑料硬膜为盖板膜，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致，将14瓶试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶盛装并固定在下凹瓶位中，与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质控报告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。14瓶试剂分别为7瓶Iml梯度浓度的标准品溶液、7ml酶标二抗、7ml抗体工作液、7ml显色液A液、7ml显色液B液、7ml终止液、40ml浓缩洗涤液、50ml浓缩复溶液。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的残留物(磺胺嘧啶)将和酶标板微孔条上预包被的磺胺类药物偶联抗原竞争抗磺胺类药物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与所含残留物(磺胺嘧啶)的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中磺胺嘧啶的残留量，再根据磺胺嘧啶的残留量，利用交叉反应率计算样本中含有的其他磺胺类药物的残留量，其操作简便易行。
·[0007]经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度动物组织样本的最低检测限为O. 5 μ g/kg ;蜂蜜样本的最低检测限为O. 5 μ g/kg ;牛奶样本的最低检测限为5 μ g/L ;尿液样本的最低检测限为2 μ g/L。动物组织样本的回收率为75%土 10% ;蜂蜜样本的回收率为90%土 10% ；牛奶样本的回收率为85%±15% ;尿液样本的回收率为95%±15%。同磺胺嘧啶的交叉反应率为100%、同磺胺间甲氧嘧啶的交叉反应率为97. 6%、同磺胺甲基异噁唑的交叉反应率为169. 0%、同磺胺噻唑的交叉反应率为188. 0%、同酞酰磺噻唑的交叉反应率为62. 8%、同磺胺甲噻二唑的交叉反应率为103%、同磺胺吡啶的交叉反应率为51. 9%、同磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶的交叉反应率均小于1%。相对于其他磺胺类药物检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、均质器、氮气吹干装置、涡旋仪、离心机、振荡器和微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于动物组织、蜂蜜、牛奶、尿液中磺胺类药物残留量的检测。

图I为本实用新型酶标板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm)；图2为本实用新型酶标板的侧面横剖面图(长为12. 8cm)；图3为本实用新型酶标板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。参见附图酶标反应微孔条(2)预包被磺胺类药物偶联抗原(3)固定于酶标板的外框支撑架(I)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的半透明PE塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明PE塑料试剂瓶
(5)用于封装50ml浓缩复溶液；白色帽(6)的白色PE塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液A液，红色帽(6)的黑色PE塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液B液，黄色帽(6)的白色PE塑料试剂瓶(7)用于封装7ml终止液，红色帽的白色PE塑料试剂瓶(8)用于封装7ml酶标二抗，绿色帽的白色PE塑料试剂瓶(8)用于封装7ml抗体工作液，白色帽的白色PE塑料试剂瓶(9)用于封装Iml/瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个下凹瓶位，放置位置依次为40ml浓缩洗涤液瓶位(18)，50ml浓缩复溶液瓶位(11 )，7ml显色液A液瓶位(14)，7ml显色液B液瓶位(13)，7ml终止液瓶位(12)，7ml抗体工作液瓶位(16)，7ml酶标二抗瓶位(15)，7个Iml/瓶各种浓度的标准品溶液瓶位(17)，盒体为(19)是硬纸盒。
具体实施方式一、样本的前处理I、配液配液I : Imo I/L盐酸溶液量取41. 5ml浓盐酸加入去离子水中定容至500ml。配液2 lmol/L氢氧化钠溶液称取20. Og氢氧化钠加500ml去离子水溶解混匀。配液3 pH=6的磷酸盐缓冲液称取I. 75g十二水合磷酸氢二钠、10. 52g 二水合磷酸二氢钠加500ml去离子水溶
解混匀。配液4:复溶工作液用去离子水将2X浓缩复溶液按1:1体积比进行稀释(I份2X浓缩复溶液+1份去离子水)用于样本的复溶，复溶工作液在4°C环境下可保存一个月。配液5 :洗涤工作液用去离子水将20 X浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释(I份20X浓缩洗涤液+19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。2、样本处理步骤 (I)动物组织(鸡肉、猪肉、鱼、奸)样本用均质器均质组织样本；称取2. 0g±0. 05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，力口入4ml pH=6的磷酸盐缓冲液润动成糊状,再加入6ml乙酸乙酯,振荡lmin, 4000rpm室温(20^250C /68 77 °F)离心5min ;取3ml上清液至IOml干净玻璃试管中，于5(T60°C水浴氮气流下吹干；加入Iml正己烷，用涡旋仪涡动30s，再加入Iml复溶工作液，涡动10s，4000rpm室温(20 25°C /68 77 °F)离心5min ;除去上层正己烷相，取下层水相50 μ I用于分析。(2)蜂蜜样本称取I. 0g±0. 05g蜂蜜样本至50ml聚苯乙烯离心管中；加入Iml lmol/L盐酸溶液，用振荡器振荡至蜂蜜全部溶解 ’放入37°C培养箱中孵育30min，取出，加入Iml lmol/L氢氧化钠溶液和Iml pH=6的磷酸盐缓冲液，再分别加入2ml乙腈和6ml乙酸乙酯，用振荡器振荡lmin，4000rpm室温(20 25°C /68 77° F)离心IOmin ;取4ml上层有机相至IOml干净玻璃试管中，于5(T60°C水浴氮气流下吹干；加O. 5ml复溶工作液溶解；取50 μ I用于分析。(3)牛奶样本取50 μ I鲜牛奶样本，加入450 μ I复溶工作液，混匀，取50 μ I用于分析。(4)尿液样本取50 μ I尿液样本，加入150 μ I复溶工作液，混匀，取50 μ I用于分析。二、使用试剂盒的操作步骤I、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(2(T25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于疒8°C。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品/样本、酶标二抗和抗体工作液加入标准品/样本50 μ I到对应的微孔中，随即加入酶标二抗50 μ I/孔，再加入抗体工作液50 μ I/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应30min。6、洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μ I/孔，充分洗涤4飞次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。7、显色加入底物液A液50μ I/孔，再加底物液B液50μ I/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15min。8、测定加入终止液50 μ I/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。三、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第I种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含磺胺类药物的含量成负相关。I、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(μ g/L)。假设样本I的吸光度值为O. 911，样本2的吸光度值为O. 285，标准液吸光度值分别是0 μ g/L为
2.054 ；0. 5 μ g/L 为 I. 714 ; I. 5 μ g/L 为 I. 285 ；4. 5 μ g/L 为 O. 553 ; 13. 5 μ g/L 为 0. 230 ；40. 5 μ g/L为O. 077。贝U样本I的浓度范围是I. 5^4. 5 μ g/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中磺胺嘧啶残留的浓度范围；样本2的浓度范围是4. 5 13. 5μ g/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中磺胺嘧啶残留的浓度范围。再利用交叉反应率计算样本中其他磺胺类药物残留的浓度范围。2、定量分析(I)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(O标准)的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率(％) = ~- xIOO
1%[0054]B——标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0——O μ g/L标准溶液的平均吸光度值(2)标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以磺胺嘧啶标准品浓度(μ g/L)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中磺胺嘧啶的实际浓度，再利用交叉反应率计算样本中其他磺胺类药物的残留量。四、测定前的注意事项I、室温低于20°C或试剂及样本没有回到室温(2(T25°C )会导致所有标准的OD值 偏低。2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性、重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、每加一种试剂前需要将其摇勻。4、反应终止液为2mol/L硫酸,避免接触皮肤。5、不要使用过了有效期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试齐U，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。6、储存条件保存试剂盒于2 8°C，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。7、试剂变质的迹象发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。O标准的吸光度(450/630nm)值小于O. 5 (A450nm<0. 5)时，表示试剂可能变质。8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20min (或更长),但不得超过25min。反之,则减短反应时间。9、该试剂盒最佳反应温度为25°C，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
权利要求1.一种磺胺类药物ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被磺胺类药物偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液用白色帽的白色PE塑料瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，Iml/瓶；酶标二抗I瓶，7ml ;抗体工作液I瓶，7ml ;显色液A液I瓶，7ml ;显色液B液I瓶，7ml ;终止液I瓶，7ml ;浓缩洗涤液I瓶，40ml ；浓缩复溶液I瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种磺胺类药物ELISA检测试剂盒。该试剂盒包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被磺胺类药物偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。试剂盒具有操作简便、费用低廉、灵敏度高等特点，适用于动物组织、蜂蜜、牛奶、尿液中磺胺类药物的残留检测。
文档编号G01N33/543GK202631536SQ20122007578
公开日2012年12月26日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者冯才伟, 陶光灿, 冯静, 赵正苗, 汪善良, 汤庆彩, 邢维维, 蒲小容 申请人:北京勤邦生物技术有限公司