专利名称：前胃泌素和肝病理的制作方法
前胃泌素和肝病理I.对相关申请的交叉参考本申请要求在2010年I月8日提交的美国临时申请号61/293，557的优先权，将所述临时申请的内容完整并入本文作为参考。2.对序列表的参考序列表随同本文同时提交。3.背景本公开提供用于诊断和筛选肝病理，包括肝增生或者退化疾病的方法和材料；并·且更特别地，提供用于定量或测定前胃泌素水平的方法和材料来诊断肝病理。3. I.胃泌素和前胃泌素的背景胃泌素是肠肽激素，其作为胃酸分泌的刺激剂行使功能。在成体哺乳动物中，它主要由胃窦的G细胞产生，并且在小肠上部和胰脏内产生的程度不同，在结肠内几乎没有可检测的量。最近，对在结肠直肠致癌作用中肽的胃泌素家族作用有越来越多的兴趣。特别地，有证据表明以前被认为是无活性的胃泌素的前体形式(前胃泌素和甘氨酸延伸的胃泌素)，在结直肠癌的发展中起作用。胃泌素基因被翻译成101个氨基酸的多肽，称作前胃泌素原，其包含信号序列(下划线)，信号序列被切割，产生一个80个氨基酸的多肽前胃泌素。依次地，前胃泌素被加工以便提供裂解产物G34，其是相应于前胃泌素残基38至71的一个34个氨基酸的肽。然后G34在它的羧基末端用甘氨酸残基延伸，产生甘氨酸延伸的胃泌素(G34-Gly)15前胃泌素切割的副产物是6个氨基酸的肽，称作C末端侧翼肽或者CTFP，其在序列中对应于前胃泌素的残基55到72并且称作G17-Gly。G34-Gly和G17-Gly的C-末端甘氨酸的去除，接着C 一末端酰胺化，分别产生G34和G17,其都被C-末端酰胺化。大部分前胃泌素的测定法不能区分前胃泌素和其他的胃泌素基因产物，导致全长的前胃泌素水平的不准确测量。因为前胃泌素水平在一种或者多种疾病中起作用，希望有用于测量前胃泌素的准确方法。3.2.肝病理背景许多肝病理是很难诊断的。例如，通过常规的血液测试不能诊断肝癌。通常需要医生用肿瘤标记甲胎蛋白(AFP)筛查。然而，升高的AFP不是对肝癌特异的。在成人中，在三种情况下肝癌、生殖细胞肿瘤(睾丸和卵巢的癌症)、肝的转移癌(起源于其他器官的癌症)可见高血液水平(超过500ng/mL)的AFP。此外，AFP对于肝癌的敏感性是约60%。换句话说，只有在约60%的肝癌患者中可见升高的AFP血液水平；40%的肝癌患者中具有正常的AFP水平。另一种难于诊断的肝病理是肝硬化，其是特征为肝斑痕形成和肝功能不全的慢性肝疾病的结果。诊断的金标准是通过肝的活组织检查，其是侵入性的技术。丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒(HCV)引起的影响肝的传染病。这种感染通常是无症状的，但是一旦建立感染，慢性感染可以进展到肝的斑痕形成(纤维化)并且晚期斑痕形成(硬化)。通常通过血清学的筛选诊断丙型肝炎。将期望检测和/或证实丙型肝炎的其他手段。
因为肝癌、肝硬化和丙型肝炎的早期和准确检测具有增加患者存活率的可能，现在并且长期需要诊断或者检测这些病理的方法，所述病理包括患者患有超过一种或者全部上述疾病的的情况。4.概述已经发现尽管具有一种或者两种肝病理的患者可以显示出升高的人前胃泌素(hPG)水平，但是具有肝癌、丙型肝炎和肝硬化的患者显示极其升高的hPG水平，其超过具有这些病症的一种或者两种的患者显示出的hPG水平的仅仅相加的结果。基于本公开，患者的hPG血浆或血清水平可以用于为肝病理分配危险度系数。此外，hPG的过量的血清或者血浆水平可用于诊断患有肝癌、丙型肝炎和肝硬化的患者。通过本公开的方法可以诊断的肝癌包括原发性肝癌(例如肝细胞癌，起源于肝的癌)和继发性肝癌。本申请也提供了诊断方法，其中，如果检测到了高于阈值(例如，至少约 400，450，500，550，600，650，700或者750pM)的人前胃泌素(hPG)水平，那么鉴定患者患有肝疾病。在具有比肝疾病平均发生率更高的群体中，例如，在吸毒者或者嗜酒者群体中或者居住在比肝疾病平均发生率更高的地理区域的人中，这种方法也可用作标准诊断。因此，也提供了在这些群体中检测升高的hPG水平的方法。基于患者的hPG水平，本公开也提供将患者分配至一种或者多种肝病理如肝癌(肝细胞癌)、丙型肝炎和肝硬化的风险群体中的方法。例如，hPG的第一个阈值水平可以表明患者对于肝病理处于“低风险”;hPG的第二个阈值水平可以表明患者对于肝病理处于“升高的风险” ;hPG的第三个阈值水平可以表明患者对于肝病理处于“高风险”，hPG的第四个阈值水平可以表明患者对于肝病理处于“严重风险”。定量的hPG水平也可以与额外的生物标记如甲胎蛋白(“AFP”)一起使用来帮助鉴定、诊断、区分肝病理或者对其进行风险分配。本文公开的方法可以用于确定合适的疗程。在某些情况下，筛选已经诊断为具有肝病理的患者以确定是否要保证进一步的治疗选项是有用的。因此，在某些方面，在患者生物学样品的hPG水平的基础上，将以前诊断为具有肝病理的患者诊断为患有另外的肝疾病。以前的肝病理可以是丙型肝炎、肝硬化或者肝癌如肝细胞癌。有利地，非常高的hPG水平(例如，在高于400、450、500、550、600、650、700pM的hPG浓度)表明患者具有全部这些疾病。可以对患者进行进一步的测试来鉴定具体的肝疾�。龌颊叩膆PG水平表明该患者患有肝病理，或者所述患者以前被诊断具有肝病理并且其hPG水平比一种肝疾病指示的更高。可以对所述患者测试肝癌、丙型肝炎或者肝硬化。使用本公开的方法已经鉴定具有一种或者多种肝病理的患者，可以按照它们的病症被治疗。经历肝病理治疗的患者也可以对他们的hPG水平进行监测来评估疾病的进展和/或治疗效果。hPG水平保持在阈值之上的患者可以继续接受治疗。在实施本文公开的方法中，如果测量的hPG水平是准确的，那么测量hPG水平的具体测定法不是关键的。在一些实施方案中，将抗_hPG抗体方便地用于测量hPG水平。如提到的，hPG被机体切割成更小的肽。优选地，在本公开的方法中，使用不检测出前胃泌素加工的副产物的测定法来检测和测量hPG以避免不准确的hPG测量。通过使用与全长hPG结合但不与更小的hPG肽结合的抗体可以实现此目的。通过使用两种不同的抗体也可以实现此目的，所述抗体都与全长hPG结合，但是在所述两种抗体与较小的hPG肽结合的程度上，不与相同的较小的hPG肽结合。在这种测定法中，两种抗体都结合的唯一产物是全长hPG。例如，与hPG的C末端和N末端表位结合的抗体允许检测和测量全长hPG，而不检测和测量较小的hPG肽。因此，在某些方面，本公开提供诊断患者的方法，其中生物学样品与第一抗体接触，所述第一抗体结合hPG的第一表位，优选地C末端或者N末端表位，并且与第二抗体接触，所述第二抗体结合hPG的不同的表位，优选地在另一末端的表位。在使用抗hPG的抗体来检测和测量hPG的示例性方法中，通过将来自患者的样品接触至少一种抗hPG抗体，并且基于与抗体结合的hPG的量，确定样品是否具有高于阈值的hPG浓度，例如，至少约400、450、500、550、或者600pM，通常400、450或者500pM，鉴定患者患有肝疾病。本公开的方法通常包括测定生物学样品的hPG水平。所述生物学样品可以是血浆或者血清。也可以使用组织水平；然而，当患者患有肝病理时，预期组织中的测量的hPG水平与血清或者血浆中发现的hPG水平不同，而是其相对于患者正常的hPG水平将升高。从·而，hPG的组织水平也可以用于监测患者的肝病理的风险或者状态。当使用组织样品时，使用在细胞或者组织提取物上进行的免疫测定，或者可以利用免疫组织化学技术，使用标记有可检测标记的多克隆或者单克隆抗体可以检测前胃泌素。免疫组织化学技术提供前胃泌素水平的定性测量。合适的可检测标记包括放射性标记(如放射性的碘)、荧光标记或者化学发光标记。本文也提供诊断试剂盒。诊断试剂盒可以包含，例如任选地标记有可检测标记的针对前胃泌素的一种或者多种抗体，所述抗体可以用于筛选、诊断或者区分肝病理。诊断试剂盒可以包含具有对hPG的N末端肽区域亲和力的第一抗体，以及具有对不同的表位如hPG的C末端肽区域的亲和力的第二抗体。本公开也提供用于进行诊断肝病理的方法的试剂盒，其包含N末端抗hPG单克隆抗体和单克隆或者多克隆的C末端抗hPG抗体，以及合适的试剂，所述每种抗体在单独的容器中。在一些实施方案中，提供的抗体中的一种或者两种都被标记。也提供诊断患者是否患有多种肝疾病的方法，其中，例如通过使用生化测定法测试来自患者的血清或者血浆的hPG水平，将具有至少约400pM的血液hPG浓度的患者鉴定为具有下面疾病中的两种或者以上丙型肝炎、肝癌或者肝硬化。在鉴定了这种患者后，使用用于丙型肝炎、肝癌或者肝硬化的测定法可以进一步诊断患者的肝病理。使用基于核酸的测定法可以诊断丙型肝炎。使用射线照相术或者成像技术(用或者不用对照)可以诊断肝癌。通过测试来自所述患者的样品的纤维化的一种或者多种血清标记可以诊断肝硬化，所述标记包括α-2巨球蛋白、触珠蛋白、脱脂载脂蛋白Al、Y-谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆红素和丙氨酸转氨酶(ALT)。患者可以具有其他的诊断上的重要标记，如升高的甲胎蛋白和/或脱Y羧基凝血酶原，并且诊断或者治疗的方法可以进一步地包括测量这些水平的步骤。在诊断后，可以使用常规试剂对患者的肝疾病治疗，例如可以用聚乙二醇化的干扰素a _2a、聚乙二醇化的干扰素a _2b和/或病毒药物利巴韦林治疗具有丙型肝炎的患者；可以使用肝移植手术和用于肝硬化的并发症的症状治疗来治疗肝硬化患者；可以用放射疗法和/或化学疗法治疗诊断为肝癌的患者。
使用本公开的技术也可以监测患者。在一种方法中，通过对患有肝疾病并且具有在阈值量之上的血液hPG浓度的患者，进行用于所述肝疾病的治疗方案监测患有肝疾病的患者的疾病状态。在治疗后，确定所述患者是否仍然具有阈值量之上的血液hPG浓度，并且如果是，那么继续进行治疗方案。如果患者不再具有阈值量之上的血液hPG浓度，那么可以定期监测患者的hPG水平以确定其是否上升到所述阈值量之上，允许重新开始治疗。也提供了诊断患者的肝健康状况的系统。本公开的系统包含一种或者多种以下的组分接收患者血液hPG浓度值的输入装置，处理器，其配置成比较患者血液hPG浓度与参照血液hPG浓度，处理器，其配置成完全或者部分基于患者血液hPG浓度输出患者的肝病理的风险水平和显示器，其配置成显示肝病理的风险水平。可以修改系统以便处理器输出对肝病理的低的、升高的、高的或者严重的风险水平测定。系统也可以包含接收患者甲胎蛋白(AFP)水平的输入装置，其中处理器被配置成比较AFP水平与参照AFP水平并且基于hPG和AFP水平输出肝病理的风险水平。本文公开了不同的风险组的阈值(i)hPG以及(ii)hPG和AFP水平。 也提供计算机可读存贮介质，其中储存了代表通过经编程的处理器可执行的指令的数据，所述数据用于诊断患者的肝健康状况，存储介质包含用于比较患者的血液hPG浓度与参照血液hPG浓度的指令；以及完全或者部分基于患者血液hPG浓度输出患者肝病理的风险水平。介质可以输出肝病理的风险水平，例如，低、升高的、高或者严重的风险水平测定。介质也可以包含用于比较患者的血液AFP水平与参照水平的数据用于输出风险水平测定。本文公开了不同风险组的阈值(i)hPG以及(ii)hPG和AFP水平。附图
简述图I提供前胃泌素原(其中在信号肽处有下划线)、前胃泌素和前胃泌素加工的产物的氨基酸序列，所述前胃泌素加工的产物包括G34、G34-Gly, G17, G17-Gly和C-末端侧翼肽CTFP。图2提供指示某些肝病理的hPG值的条形图。附图3A-3L提供示例性的小鼠抗_hPG单克隆抗体的VH和VL链的多肽和相应的多核苷酸序列。图3A显示抗-hPG MAb3的多核苷酸(SEQ ID NO: 16)和多肽(SEQ ID NO: 12)小鼠VH链，并且图3B显示抗-hPG的MAb3的多核苷酸(SEQ ID NO: 17)和多肽(SEQ ID NO: 13)小鼠VL链。图3C 显示抗-hPG 的 MAb4 的多核苷酸(SEQ ID NO: 18)和多肽(SEQ ID NO: 14)小鼠VH链，并且图3D显示抗-hPG的MAb4的多核苷酸(SEQ ID NO: 19)和多肽(SEQ IDNO: 15)小鼠VL链。图3E显示抗-hPG的MAb8的多核苷酸(SEQ ID NO:67)和多肽(SEQ ID NO: 59)小鼠VH链，并且图3F显示抗-hPG的MAb8多核苷酸(SEQ ID NO: 71)和多肽(SEQ ID NO: 63)的小鼠VL链。图3G 显示抗-hPG 的 MAbl3 的多核苷酸(SEQ ID NO:68)和多肽(SEQ ID NO:60)小鼠VH链，并且图3H显示抗-hPG的MAbl3的多核苷酸(SEQ ID NO: 72)和多肽(SEQ IDNO: 74)小鼠VL链。图31 显示抗-hPG 的 MAbl6 的多核苷酸(SEQ ID NO:69)和多肽(SEQ ID N0:61)小鼠VH链，并且图3J显示抗-hPG的MAbl6的多核苷酸(SEQ ID NO: 73)和多肽(SEQ IDNO:65)小鼠VL链。图3K 显示抗-hPG 的 MAbl9 的多核苷酸(SEQ ID NO: 70)和多肽(SEQ ID NO:62)小鼠VH链，并且图3L显示抗-hPG的MAbl9的多核苷酸(SEQ ID NO: 74)和多肽(SEQ IDNO:66)小鼠VL链。图4A-4Z提供示例性的人抗-hPG的单克隆抗体的VH和VL链的多肽序列。图4A显示抗hPG的MAb3的多肽(SEQ ID NO: 21)人VH链并且图4B显示抗hPG的 MAb3 的多肽(SEQ ID NO: 22)人 VL 链。图4C显示抗hPG的MAb4的多肽(SEQ ID NO: 23)人VH链并且图4D显示抗hPG的 MAb4 的多肽(SEQ ID NO: 24)人 VL 链。
图4E显示抗hPG的MAb8(a)的多肽(SEQ ID NO: 75)人VH链并且图4F显示抗hPG 的 MAb8(a)的多肽(SEQ ID NO: 76)人 VL 链。图4G显示抗hPG的MAb8(b)的多肽(SEQ ID NO: 77)人VH链并且图4H显示抗hPG 的 MAb8(b)的多肽(SEQ ID NO: 78)人 VL 链。图41显示抗hPG的MAb8(c)的多肽(SEQ ID NO: 79)人VH链并且图4J显示抗hPG 的 MAb8(c)的多肽(SEQ ID NO: 76)人 VL 链。图4K显示抗hPG的MAb13 (a)的多肽(SEQ ID NO: 80)人VH链并且图4L显示抗hPG 的 MAbl3(a)的多肽(SEQ ID NO:81)人 VL 链。图4M显示抗hPG的MAb13 (b)的多肽(SEQ ID NO: 82)人VH链并且图4N显示抗hPG 的 MAbl3(b)的多肽(SEQ ID NO:83)人 VL 链。图40显示抗hPG的MAb 16 (a)的多肽(SEQ ID NO: 84)人VH链并且图4P显示抗hPG 的 MAbl6(a)的多肽(SEQ ID NO:85)人 VL 链。图4Q显示抗hPG的MAbl6 (b)的多肽(SEQ ID NO: 86)人VH链并且图4R显示抗hPG 的 MAbl6(b)的多肽(SEQ ID NO:87)人 VL 链。图4S显示抗hPG的MAbl6(c)的多肽(SEQ ID NO: 88)人VH链并且图4T显示抗hPG 的 MAbl6(c)的多肽(SEQ ID NO:89)人 VL 链。图4U显示抗hPG的MAbl9 (a)的多肽(SEQ ID NO:90)人VH链并且图4V显示抗hPG 的 MAbl9(a)的多肽(SEQ ID NO:91)人 VL 链。图4W显示抗hPG的MAbl9 (b)的多肽(SEQ ID NO: 92)人VH链并且图4X显示抗hPG 的 MAbl9(b)的多肽(SEQ ID NO:93)人 VL 链。图4Y显示抗hPG的MAbl9(c)的多肽(SEQ ID NO: 94)人VH链并且图4Z显示抗hPG 的 MAbl9(c)的多肽(SEQ ID NO:95)人 VL 链。5.发明详述5. I.定义除非另外指出，以下的术语意在具有它们的普通含义，在本公开的上下文中在下面讨论所述含义“人前胃泌素”或者“hPG”是鉴定为SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的多肽。如本文使用的，hPG被定义为包含胃泌素基因的主要蛋白质产物；即，没有信号肽或者前肽的前胃泌素原。见 Rehfeld 等人·(2004) Regulatory Peptides 120 (1-3) : 177-183。hPG 由两个d-精氨酸切割位点分开的三种界限清楚的区域组成。因此，除非另外指出，hPG由前胃泌素原加工的产物组成，所述hPG保留两个d-精氨酸位点。hPG不包括“胃泌素类”，即G34和G17，但是可以包含，例如保留位于氨基酸36/37和73/74上或者附近的两个d_精氨酸位点的hPG的短的截短物(多达1，2，3，4或者5个氨基酸)或者变体。见图I。“生物学标记”或者“生物标记”指的是一种特征，其被客观地测量和评估，作为正常生物过程，致病过程或者对治疗干预的药理学反应的指标。“夹层测定法”指的是特定类型的免疫测定法，其可被用于对与样品相互作用的化合物的量定量。夹层测定法被如此称谓是因为在捕获抗体和检测或者参考抗体之间结合样品的抗原。在本公开的夹层测定法中，在抗_hPG抗体之间结合人前胃泌素。该测定提供了hPG而不是它的前体或者产物的定量，因此提供了 hPG浓度的更准确的测量。有利地，本公开的针对前胃泌素的N-末端或者C-末端区域的抗体也分别对前胃泌素特异。因此，胃泌素原的较小的加工片段不太可能作为一种或者其他抗体的竞争者从而可能使测定的结果有偏差。
“受试者”或者“患者”在本文可互换使用，其指的是脊椎动物，优选的是哺乳动物，更优选的是人。“抗体”或“Ab”是指特异地结合特定抗原，或与特定抗原起免疫学反应的免疫球蛋白分子，其包括多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体和其他修饰形式的抗体，所述修饰形式的抗体包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体和抗体的抗原结合片段，包括例如，Fab’、F(ab，)2、Fab、Fv、rlgG和scFv片段。在多种实施方案中，抗_hPG单克隆抗体包含抗体恒定区的全部或者部分。在一些实施方案中，恒定区是选自IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD,IgE, IgG(例如，IgGp IgG2, IgG3或IgG4)和IgM的同种型。可以从一些物种的任一种产生抗体(包括单克隆抗体)，所述物种包括但不限于小鼠、兔、大鼠、猪、豚鼠、鸡、驴、马、骆驼和骆马。如本文使用，如果抗体与全长的前胃泌素结合，但是它根本不结合CTFP、酰胺化胃泌素或者甘氨酸延伸的胃泌素，那么所述抗体对hPG是“高度特异的”，并且如果抗体显示与hPG结合比与CTFP以及胃泌素基因其他的产物结合至少强约5-倍(如在标准结合测定法中测量)，那么其是“对hPG特异”或者“特异地与hPG结合”。在实施例4中提供了可以用于评估特定的抗_hPG抗体的特异性的ELISA测定法。这种特异的抗-hPG抗体(本文指的是“抗hPG的抗体”)可以是多克隆的(“抗-hPGPAbs”)或者单克隆的(“抗-hPGMAbs”)，尽管对于治疗应用和某些情况下，诊断或者其他的体外应用，单克隆抗体是优选的。本文使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体是通过本领域可获得的或者已知的任何手段，来源于包括任一真核克�。丝寺。蚴删蹇寺〉牡ヒ豢寺〉目固�。使用本领域已知的多种技术，包括使用杂交瘤、重组技术、噬菌体展示技术，或它们的组合可以制备本公开中有用的单克隆抗体。在本公开的许多应用中，包括抗_hPG的单克隆抗体在人中的体内应用和体外检测测定，可以适当使用嵌合的、灵源化的(primatized)、人源化的或人抗体。术语“ scFv"指的是单链Fv抗体，其中已经将重链的可变区和来自常规抗体的轻链连接以形成一条链。
对“VH”的参考指的是抗体的免疫球蛋白重链的可变区，所述重链包括Fv、scFv或者Fab的重链。对“VL”的参考指的是免疫球蛋白轻链的可变区，所述轻链包括Fv、scFv、dsFv或者Fab的轻链。抗体(Abs)和免疫球蛋白(Igs)是具有相同结构特征的糖蛋白。然而抗体显示对特定的靶标的结合特异性，免疫球蛋白包括抗体和缺少靶特异性的其他抗体-样的分子。天然抗体和免疫球蛋白通常是约150，000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(L)链组成。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，紧接着是几个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，在它的另一端是恒定结构域。本公开的抗-hPG单克隆抗体包含“互补决定区(⑶Rs) ”。也已知⑶Rs是轻链和重链可变结构域中的高变区。将可变结构域的更高度保守的部分称作构架(FR)。本领域已知，取决于背景和本领域已知的多种定义，划定抗体高变区的氨基酸位置/边界可以不同。可以将在可变结构域中的一些位置看作杂合高变位置，原因在于，在一套标准下，可以认为这些位置在高变区内，然而在一套不同的标准下，认为这些位置在高变区之外。在延伸的高变区中也可以发现这些位置中的一种或者多种。本公开提供了包含在这些杂合高变位·置中修饰的抗体。每种天然重链和轻链的可变结构域包含四种主要采用β_折叠构型的通过三个⑶R连接的FR区，所述⑶R形成环连接，并且在一些情况下形成β -折叠结构的部分。每条链中的⑶Rs通过FR区很接近地结合在一起，并且其与来自其他链的⑶Rs —起有助于形成抗体的祀结合位点(见Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987)。术语“表位”指的是蛋白质的任一部分(决定簇)，其能引起免疫反应并且被抗体特异地结合。表位决定簇通常由分子的活性表面定组如氨基酸或者GAG侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。如果蛋白质中的氨基酸突变降低或者消除了其与一种抗体的结合，也降低或者消除了其与另一种抗体的结合，和/或者如果抗体竞争结合蛋白质，即一种抗体与蛋白质的结合降低或者消除了另一种抗体与该蛋白质的结合，那么所述的两种抗体结合基本相同的蛋白质表位(或者蛋白质的重叠表位)。通过本领域已知的方法，如竞争测定法实现确定两种抗体是否基本上与相同的表位结合。在对照抗体(例如，本文描述的一种抗-前胃泌素抗体)和任一测试抗体之间进行抗体竞争研究，可以首先用可检测的标记如生物素、酶、放射性标记或荧光标记来标记对照抗体以便能进行随后的鉴定。与对照(标记的)抗体结合基本相同的表位的测试(未标记的)抗体应该能封闭对照抗体的结合并且因此应该降低对照抗体的结合。“特异针对hPG的测定”或者“特异针对人前胃泌素的测定”指的是区分全长的hPG和胃泌素基因的其他产物的测定。在基于抗体的诊断测定的背景下，特异针对hPG的测定可以利用特异结合hPG的抗体。备选地，特异针对hPG的测定可以利用都与全长的hPG结合但是都不与相同的胃泌素基因产物结合的两种抗体，以致hPG是由胃泌素基因产生且被两种抗体识别的唯一分子。例如，可将结合hPGC-末端和N-末端表位的几种抗体用在区分hPG和其他的胃泌素基因肽的测定中。在使用术语癌方面，需注意的是在患者中，来自原发性(原始)肿瘤的细胞已经逃脱，并且通常通过淋巴或者血液，经由称作“转移”的过程转移到机体内的另一个位置，以形成另一个转移(或者继发性)肿瘤，不考虑它的新的位置，继发性或者转移肿瘤通常是和原始肿瘤相同的类型，从而该疾病被称作转移癌，而不是新的居住组织的癌。例如，已经扩散到肝的胰腺癌是转移的胰腺癌，不是肝癌。因此，转移的肝细胞癌指的是起源于肝中并且转移到别处的癌。基于hPG的过量水平也可以诊断继发性肝癌(即已经转移至肝中的非肝来源的转移癌)。例如，已经转移到肝中的结直肠癌(即转移的结直肠癌)是继发性肝癌的形式。换句话说，在原发性和继发性肝癌中，使用血清、血浆或者组织中的hPG水平，可以检测肝中的癌。
5. 2.前胃泌素水平和肝病理一般认为正常的前胃泌素水平低于20至50pM，通常在O和5pM之间。本公开证明具有一种或者两种肝病理的患者可以显示升高的人前胃泌素(hPG)水平，并且具有肝癌、丙型肝炎和肝硬化的患者显示出极度升高的hPG水平。图2图示性地说明具有一种或者以上肝病理的患者中的hPG水平，其通过ELISA-夹层测定法使用抗-hPG抗体测定。方框区域的外部边界指示第25至第75百分位。须指示第5至第95百分位。单条线代表中位数。点指示异常值。下表总结第5至第95百分位的数据表I
具有肝病理的患者中的前y泌素水平(p!V1)(5—艿百分位)
___肝硬化_
_O 至 l_C20>f__10 至 7_(_)_
肝癌和丙型肝炎肝癌，丙型肝炎和肝硬化10 至 500(50) 150 至 20_(1300-14_)_f括号中的值指示平均hPG水平_基于前述，50pM或者IOOpM之上的hPG水平可以指示一种或者多种肝病理。至少约400pM、500pM或者600pM的hPG水平有特别的诊断重要性，因为它们强烈地指示多种肝病理，特别是肝癌和肝硬化、肝癌和丙型肝炎，以及肝癌、肝硬化和丙型肝炎的存在。在测量总前胃泌素水平(即全长的前胃泌素和裂解产物的水平)的研究中，已经发现只具有丙型肝炎的患者的血衆水平与健康人相似。Konturek等人，2003，Scand JGastroenterol 6:643-647。预期只患有丙型肝炎的患者的全长前胃泌素水平非常低。前胃泌素水平可以用于分配风险点得分和相应的疾病风险概率。对于用于分配患有终末期肝疾病的患者的死亡风险的模型的实例，参见Kamath等人.(2001)Hepatology33(2):464-70。使用将测定的前胃泌素水平与肝疾病状态相关的经验数据，从生物标记，如前胃泌素，以及任选的其他的生物学标记水平可以取得点得分和相关的疾病风险概率。使用四个风险组低风险、升高的风险、高风险和严重风险可以定性地描述疾病风险概率。在本公开中提到的风险水平具有下面的含义
O “低风险”意味着患者的生物学标记水平指示不存在给定的肝病理。“升高的风险”意味着患者的生物学标记水平指示给定的肝病理的风险增加。该风险是有必要进一步测试的量值。O “高风险”意味着患者的生物标记水平指示给定的肝病理的风险大大增加。该风险是需要进一步测试的量值。基于生物学标记特异性的试验性诊断可能是有理由的。〇“严重风险”意味着患者的生物学标记水平明显地不正常并且指示潜在的病理。可以进行生物标记特异性的诊断。具有低于OpM至IOOpM的血清或者血衆前胃泌素水平的患者具有被诊断为肝癌如肝细胞癌和肝硬化的低风险，并且具有被诊断为肝癌、肝硬化和丙型肝炎的全部三种的极低风险。具有正常血清或者血浆前胃泌素水平(例如，O至5pM)或者轻微升高的水平(多达IOOpM)的患者仍然可能具有肝癌。因此，建议进一步测试具有IOOpM或者更低的血清或者血浆hPG水平的患者以评估其是否具有肝癌。·具有IOOpM至400pM之间的血清或者血浆前胃泌素水平的患者不太可能只患有肝癌而没有其他的肝病理。这种患者具有患有肝硬化(有或者没有肝癌)的高风险，并且另外具有丙型肝炎的升高的风险。具有400pM之上的血清或者血浆前胃泌素水平的患者处于具有肝癌、丙型肝炎和肝硬化的严重风险。在多种诊断方法中可以使用患者的hPG水平和肝病理状态之间的关系。诊断方法一般需要将患者样品中的hPG水平与正常的hPG值，例如与来自健康个体或者健康个体池的hPG水平比较。如果hPG水平升高了，例如在上文提供的风险分配的基础上，升高的水平与可能的肝病理相关联。这种方法任选地包括这样的步骤，其中患者提供体液样品。然后，优选地通过生物化学测定可以分析体液的hPG水平。在某些应用中，测试患者的癌标记水平连同患者的hPG水平可以用于增加患者中的肝癌标记的特异性，或者用于分配风险点得分和相应的疾病风险概率。优选的第二标记是甲胎蛋白(AFP)。血清AFP，一种胎儿特异的糖蛋白抗原，是用于测定患者具有肝癌例如肝细胞癌的最广泛使用的肿瘤标记。AFP用于检测肝细胞癌的已报告的灵敏度在乙型肝炎病毒(HBV)阳性和HBV阴性群体中有很大不同，这归因于在筛选和诊断研究设计之间的重叠。当使用AFP筛选高风险群体时，已经报告了 39%至97%的灵敏度，76%至95%的特异性和9%至32%的阳性预测值(PPV)。AFP不是对肝癌特异的。在急性或者慢性肝炎中，妊娠中和生殖组织肿瘤的存在下，AFP的滴度也升高了。基于hPG水平连同AFP水平，下表指示了对给定肝病理的相对风险。在hPG和AFP水平的基础上比仅在AFP的基础上相对风险的分配提供了对肝病理的更灵敏和更准确的测试。表权利要求
1.诊断患者是否患有肝疾病的方法，其包括通过生物化学测定法测定在来自患者的样品中至少约400pM的人前胃泌素(hPG)浓度的步骤。
2.权利要求I的方法，其中所述患者具有选自由肝癌、丙型肝炎和肝硬化组成的组的一种或者两种疾病。
3.权利要求I或者权利要求2的方法，其中所述肝癌是肝细胞癌。
4.权利要求I至3中任一项的方法，其中所述浓度是至少约500pM。
5.权利要求I至4中任一项的方法，其中所述测定包括来自所述患者样品中的hPG与至少一种抗体的结合。
6.权利要求5的方法，其中所述测定包括来自所述患者的样品中的hPG与多种抗体的彡口口
7.权利要求I至6中任一项的方法，其中所述患者属于具有比丙型肝炎的平均发生率更高发生率的群体。
8.权利要求I至7中任一项的方法，其中所述患者居住在具有比丙型肝炎的平均发生率更高发生率的地理区域。
9.权利要求I至8中任一项的方法，其中所述患者具有药物或者酒精依赖性状况。
10.诊断患者是否患有肝疾病的方法，其包括步骤 Ca)将来自患者的样品接触至少一种抗-hPG抗体；和 (b)基于与所述至少一种抗体结合的hPG的量测定样品是否具有至少约400pM的hPG浓度。
11.权利要求10的方法，其中所述样品与特异针对hPG的第一表位的第一抗体以及特异针对hPG的不同表位的第二抗体接触。
12.权利要求10或权利要求11的方法，其中所述抗体的一种带有可检测的标记并且通过对所述可检测标记的水平定量测定结合的hPG的水平。
13.权利要求10至12任一项的方法，其中所述患者属于具有比丙型肝炎的平均发生率更高发生率的群体。
14.权利要求10至13任一项的方法，其中所述患者居住在具有比丙型肝炎的平均发生率更高发生率的地理区域。
15.权利要求10至14任一项的方法，其中所述患者具有药物或者酒精依赖性状况。
16.诊断患者是否患有肝疾病的方法，其中患者已经被诊断具有除了丙型肝炎以外的肝病理，所述方法包括测定来自所述患者的样品中的人前胃泌素(hPG)水平的步骤，其中如果前胃泌素水平高于阈值，那么表明患者患有丙型肝炎。
17.权利要求16的方法，其中所述阈值是至少400pM。
18.权利要求16的方法，其中所述患者属于具有比丙型肝炎的平均发生率更高发生率的群体。
19.权利要求16的方法，其中所述患者居住在具有比丙型肝炎的平均发生率更高发生率的地理区域。
20.权利要求16的方法，其中所述患者具有药物或者酒精依赖性状况。
21.诊断患者是否患有肝疾病的方法，其中所述患者已经被诊断具有第一肝病理，所述方法包括测定来自所述患者样品中的人前胃泌素(hPG)水平的步骤，其中如果前胃泌素水平高于阈值，那么表明所述患者患有至少一种额外的肝病理。
22.权利要求21的方法，其中所述阈值是至少400pM。
23.权利要求21或权利要求22的方法，其中所述患者属于具有比丙型肝炎的平均发生率更高发生率的群体。
24.权利要求21至23中任一项的方法，其中所述患者居住在具有比丙型肝炎的平均发生率更高发生率的地理区域。
25.权利要求21至24中任一项的方法，其中所述患者具有药物或者酒精依赖性状况。
26.诊断患者是否患有肝疾病的方法，其包括使用生物化学测定检测来自被诊断具有第一种肝病理的患者的样品中人前胃泌素(hPG)水平的步骤，所述人前胃泌素水平指示多种肝病理。
27.权利要求26的方法，其中所述第一种肝病理选自由肝硬化、丙型肝炎和肝细胞癌组成的组。
28.权利要求26或27中的任一项的方法，其中所述水平是至少400pM。
29.权利要求26至28中任一项的方法，其中所述患者属于具有比丙型肝炎的平均发生率更高发生率的群体。
30.权利要求26至29中任一项的方法，其中所述患者居住在具有比丙型肝炎的平均发生率更高发生率的地理区域。
31.权利要求26至30中任一项的方法，其中所述患者具有药物或者酒精依赖性状况。
32.检测至少具有一种非肝病理的患者的肝病理的发展的方法，其包括使用生物化学测定检测来自患者的样品中的指示所述肝病理的发展的人前胃泌素(hPG)水平的步骤。
33.权利要求32的方法，其中所述患者以前已经被诊断具有一种或者多种肝病理。
34.权利要求32或权利要求33的方法，其中所述hPG的指示水平是至少约400pM。
35.检测被诊断患有癌的患者的肝病理发展的方法，其包括使用生物化学测定检测来自所述患者的样品中人前胃泌素(hPG)水平的步骤，所述人前胃泌素水平指示所述肝病理。
36.权利要求35的方法，其中所述患者以前已经被诊断具有一种或者多种肝病理。
37.权利要求35或权利要求36的方法，其中所述hPG的指示水平是至少约400pM。
38.诊断患者是否患有多种肝疾病的方法，其包括以下步骤 Ca)鉴定具有至少约400pM的血液hPG浓度的患者； (b)测试所述患者以下疾病的至少两种 i)肝癌，使用射线照相术或者成像技术； ii)丙型肝炎病毒，使用基于核酸的测定；和 iii)肝硬化，通过测试来自所述患者的血液样品中纤维化的一种或者多种血清标记， 从而诊断患者是否患有多种肝疾病。
39.确定患者的多种肝疾病风险的方法，其包括 (a)通过生物化学测定确定患者的血清或者血浆hPG水平；和， (b)在(a)的基础上，向患者分配一种或者多种肝病理的相对风险，其中 i)低于IOOpM的hPG水平表明患者对一种或者多种肝病理是处于“低风险”的； ii)IOOpM和400pM之间的hPG水平表明患者对有或者没有肝癌的肝硬化是处于“高风险”，并且患者对具有丙型肝炎处于“升高的风险”，和iii)高于400pM的hPG水平表明患者对具有肝癌、肝硬化和丙型肝炎是处于“严重的风险”; (c)其中如果所述患者具有低于IOOpM的hPG水平，那么使用其他的诊断手段任选地进一步测试所述患者以证实所述患者不具有肝癌；并且 (d)其中如果所述患者具有IOOpM到400pM之间的hPG水平，那么任选地使用用于肝癌和/或丙型肝炎的其他诊断方法进一步测试所述患者。
40.确定患者对肝病理的风险的方法，其包括 (a)通过生物化学测定确定患者的血液hPG水平； (b)通过生物化学测定确定患者的血液甲胎蛋白(“AFP”)水平；和 (c)在(a)和(b)的基础上，向患者分配肝病理的相对风险，其中 i)hPG和AFP的第一个阈值水平表明患者对肝病理是处于“低风险”的； ii)hPG和AFP的第二个阈值水平表明患者对肝病理是处于“升高的风险”的； iii)hPG和AFP的第三个阈值水平表明患者对肝病理是处于“高风险”的； iv)hPG和AFP的第四个阈值水平表明患者对肝病理是处于“严重风险”的； 其中所述第一、第二、第三和/或第四个阈值水平任选地是在表2中显示的用于相应风险水平的那些，例如其中所述第一阈值水平是O至IOOpM的hPG水平和251至500pM的AFP水平，或者是100至400pM的hPG水平和51至250pM的AFP水平。
41.监测具有肝疾病的患者的疾病状态的方法，所述方法包括 (a)对患有肝疾病或者具有高于阈值量的血液hPG浓度的患者进行用于所述肝疾病的治疗方案； (b)在步骤(a)之后，确定所述患者是否继续具有高于阈值量的血液hPG浓度；并且 (c)如果所述患者继续具有高于阈值量的hPG浓度，那么继续治疗方案并且如果所述患者不再具有高于所述阈值量的血液hPG浓度，那么定期监测所述患者的血液hPG水平以确定所述hPG水平是否上升到所述阈值量之上。
42.诊断患者的肝健康状况的系统，所述系统包括 (a)接收患者的血液hPG浓度值的输入装置； (b)处理器，其配置成比较患者血液hPG浓度与参照血液hPG浓度，所述处理器被配置成完全或者部分基于患者血液hPG浓度输出患者的肝病理的风险水平；和 (c)显示器，其配置成显示肝病理的风险水平。
43.计算机可读存储介质，其已经储存了代表通过经编程的处理器可执行的指令的数据，用于诊断患者的肝健康状态，所述存储介质包括用于以下的指令 (a)比较患者的血液hPG浓度与参照血液hPG浓度；和 (b)完全或者部分基于患者的血液hPG浓度输出患者肝病理的风险水平。
全文摘要
测定了前胃泌素水平以诊断一种或多种肝病理。
文档编号G01N33/74GK102947707SQ201180010319
公开日2013年2月27日 申请日期2011年1月7日 优先权日2010年1月8日
发明者J-F·弗洛克, L·胡胡 申请人:拜若提
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