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专利名称：一种胶体金标记方法
技术领域：
本发明属于免疫金标技术，涉及一种胶体金标记方法，具体涉及一种胶体金标记链亲和素或抗体的方法。
背景技术：
免疫金标法是九十年代后发展起来的，因其快速，操作简便，试剂稳定，可室温储运，不易污染的特点得到广泛的应用。它是免疫亲和技术，印记技术，免疫标记和层析技术的组合。然而由于胶体金具有强烈的电荷性，通过静电吸附抗体或蛋白，在PH的变化下，很容易造成抗体或蛋白的脱离并且吸附抗体或蛋白后的胶体金不稳定。

发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种胶体金标记方法。一种胶体金标记方法，依次包括如下步骤⑴制备胶体金颗粒溶液；⑵将制备好的胶体金颗粒溶液调节PH至7. 5，加入待标记蛋白或者待标记抗体，用HCl调节pH至酸性反应环境，反应10 30分钟；C3)冷却；(4)用的碱性溶液调节金标抗体或金标蛋白溶液的PH至碱性环境中稳定；其中步骤(4)所述的调节金标抗体或金标蛋白溶液的pH至碱性环境是用1 %的碱性溶液每5 15秒加入一滴，使10滴pH变化量为0. 5 1. 0个pH， 将金标抗体溶液的PH从酸性调节到7. 5 8. 0。所述的冷却温度优选0 4°C，冷却时间优选10 20分钟。所述的冷却温度进一步优选4°C，冷却时间进一步优选15分钟。所述的酸性反应环境为pH = 4-6. 5。所述待标记抗体为单克隆或多克隆抗体，待标记蛋白为链亲和素。所述的碱性溶液为碳酸钾、碳酸钠或氢氧化钾。有益效果现有的胶体金标记方法中，胶体金连接了待标记抗体或待标记蛋白之后，很不稳定，很容易因电荷的变化使得抗体脱离，造成每个胶体金的标记抗体量大大减少，从而造成灵敏度的降低。本发明通过缓慢复碱的方法提高标记抗体或链亲和素的灵敏度。在胶体金结合抗体或链亲和素的过程中，先调节胶体金、待标记抗体或蛋白的混合液至反应的酸性 PH，使胶体金通过静电吸附将抗体或链亲和素最大量的吸附在胶体金颗粒上，然后通过冷却，使标记了抗体或链亲和素的胶体金电荷趋于不活跃的状态，在这样的情况下，缓慢调节反应体系的PH至碱性(即缓慢复碱)使标记了的抗体或蛋白的电荷在pH缓慢改变的情况下达到稳定的状态，从而不易使待标记抗体或待标记蛋白在剧烈的PH变化下脱离胶体金颗粒，一方面提高了稳定性，另一方面相对又提高了灵敏度。
具体实施例方式实施例1
氯金酸水溶液的配制将IOg氯金酸IOOOml的三蒸水溶解，配成1 %的水溶液，置于4°C备用，有效期3个月。柠檬酸三钠的配制用三蒸水溶解柠檬酸三钠，配成的水溶液，用0. 22U膜滤过，置于4°C备用，有效期7天。碳酸钾水溶液的配制将Ig碳酸钾用IOOml用三蒸水溶解，用0. 22U膜滤过，
置于4°C备用，有效期为7天。0. 5M的HCl溶液的配制将5M的HCl溶液用三蒸水稀释10倍，置于4°C备用，有效期为7天。胶体金的颗粒的制备用三蒸水将氯金酸稀释成0. 01%，置于95°C反应10分钟，加入Iml柠檬酸三钠，继续反应15分钟，待胶体金溶液颜色由蓝经紫变红后，冷却后加入aiill1^碳酸钾溶液备用。外观应纯净，透亮，无沉淀和漂浮物。标记过程用1 %碳酸钾水溶液调胶体金颗粒溶液pH值至7. 5，按照15ug链亲和素或抗体溶液/ml胶体金的量加入链亲和素或心肌肌钙蛋白I单克隆抗体M155充分混勻， 用0. 5M的HCl溶液缓慢滴加调节至最合适反应pH = 5，反应10分钟，放置4°C，冷却15分钟后，取出，边搅拌边用1 %碳酸钾水溶液缓慢滴加(每隔10秒一滴，使10滴PH变化量为 0. 5个pH)调节溶液pH至7. 5，稳定搅拌10分钟。实施例2为了进一步说明运用在金标系统中的缓慢复碱法的优越性，我们采用了将同样的金标系统，将缓慢复碱改成快速复碱和不复碱两种不同的方法，运用到心肌肌钙蛋白I检测试剂卡的实际应用中，胶体金试纸条的具体制备方法如下1)包被膜的制备所使用的抗体均购自Fitzgerald公司。a)包被缓冲液的制备将0. 025M, ρΗ7· 4的PBS，用0. 22u膜过滤，置于4°C备用， 有效期7天。b)封闭液的制备将含1% BSA，蔗糖，0. 025M，pH7. 5的PBS，用0. 22U膜过滤，
置于4°C备用，有效期为3天。c)心肌肌钙蛋白I单克隆抗体检测线的制备将心肌肌钙蛋白I单克隆抗体4C2 按4. 5mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0. 4ml/min,划线速度50m/20min，在硝酸纤维膜中部上划线，该线与检测线6平行，两线相隔4mm，细致均勻在干燥箱内20°C鼓风干燥12小时。d)控制线的制备将兔抗鼠IgG抗体按8mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0. 4ml/min, 划线速度50m/20min，在硝酸纤维膜上部划线，该线与检测线7平行，两线相隔4mm，细致均勻，放入干燥箱内20°C鼓风干燥12小时。e)用上述封闭液将含有检测线和控制线的硝酸纤维素膜于37°C封闭60分钟，取出后置37°C下烘干处理两个小时，封袋备用。2)涂覆金标抗体的聚酯膜的制备a)氯金酸水溶液的配制将IOg氯金酸IOOOml的三蒸水溶解，配成1 %的水溶液，
置于4°C备用，有效期3个月。b)柠檬酸三钠的配制用三蒸水溶解柠檬酸三钠，配成的水溶液，用0. 22U膜滤过，置于4°C备用，有效期7天。
c) 碳酸钾水溶液的配制将Ig碳酸钾用IOOml用三蒸水溶解，用0. 22U膜滤过，置于4°C备用，有效期为7天。d)金标抗体保存液的配制将15g的蔗糖，20ul的叠氮钠，在IOOml的pH = 7. 4 的BSA溶解，用0. 22U膜滤过，置于4°C备用，有效期为7天。e)胶体金的颗粒的制备用三蒸水将氯金酸稀释成0. 01%，置于95°C反应10 分钟，加入Iml柠檬酸三钠，继续反应15分钟，待胶体金溶液颜色由蓝经紫变红后，冷却后加入aiill1^碳酸钾溶液备用。外观应纯净，透亮，无沉淀和漂浮物。f)金标抗体的制备用1 %碳酸钾溶液调节胶体金PH值至7. 5，加入适合的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体M155溶液充分混勻，调节pH至5. 0，反应10 30分钟后，冷却后， 分成两份，一份快速复碱，另一份按照实施例1方法缓慢复碱，然后将两份置于25°C水浴反应30分钟后再加入5% BSA，封闭20分钟后，离心取沉淀，用BSA恢复其终浓度为1%，4°C 保存备用。g)将标记好抗体胶体金均勻的铺在聚酯膜上，喷量为1.0ul/Cm*3道，干燥，封袋，3)样品垫的处理将样品垫用IOOmM PBS缓冲液浸泡数小时，取出干燥后。4)胶体金试纸条的组装底衬1，样品垫2和吸水纸5是本领域通用的部件。将上述样品垫2、涂覆有金标抗体的聚酯膜3、包被膜4及吸水纸5顺次相互搭接粘贴得到试纸板，最后将试纸板切割成不同宽度的试纸条即可。将两种不同复碱情况制备好的试纸条进行灵敏度和稳定性的对比。对比数据如下灵敏度的比较
权利要求
1.一种胶体金标记方法，依次包括如下步骤(1)制备胶体金颗粒溶液；( 将制备好的胶体金颗粒溶液调节PH至7. 5，加入待标记蛋白或者待标记抗体，用HCl调节PH至酸性反应环境，反应10 30分钟；C3)冷却；(4)用的碱性溶液调节金标抗体或金标蛋白溶液的PH至碱性环境中稳定；其特征在于步骤(4)所述的调节金标抗体或金标蛋白溶液的 PH至碱性环境是用1 %的碱性溶液每5 15秒加入一滴，使10滴pH变化量为0. 5 1. 0 个PH，将金标抗体溶液的pH从酸性调节到7. 5 8. 0。
2.根据权利要求1所述的胶体金标记方法，其特征在于所述的冷却温度为0 4°C，冷却时间为10 20分钟。
3.根据权利要求2所述的胶体金标记方法，其特征在于所述的冷却温度为4°C，冷却时间为15分钟。
4.根据权利要求1所述的胶体金标记方法，其特征在于所述的酸性反应环境为PH= 4-6. 5。
5.根据权利要求1所述的胶体金标记方法，其特征在于所述待标记抗体为单克隆或多克隆抗体，待标记蛋白为链亲和素。
6.根据权利要求1所述的胶体金标记方法，其特征在于所述的碱性溶液为碳酸钾、碳酸钠或氢氧化钾。
全文摘要
本发明属于免疫金标技术，公开了一种胶体金标记方法，该方法依次包括如下步骤(1)制备胶体金颗粒溶液；(2)将制备好的胶体金颗粒溶液调节pH至7.5，加入待标记蛋白或者待标记抗体，用HCl调节pH至酸性反应环境，反应10～30分钟；(3)冷却；(4)用1％的碱性溶液调节金标抗体或金标蛋白溶液的pH至碱性环境中稳定；其中步骤(4)所述的调节金标抗体或金标蛋白溶液的pH至碱性环境是用1％的碱性溶液每5～15秒加入一滴，使10滴pH变化量为0.5～1.0个pH，将金标抗体溶液的pH从酸性调节到7.5～8.0。本发明缓慢复碱的胶体金标记方法一方面提高了稳定性，另一方面相对又提高了灵敏度。
文档编号G01N33/532GK102183633SQ20111004474
公开日2011年9月14日 申请日期2011年2月24日 优先权日2011年2月24日
发明者王勇, 王路海, 苏恩本, 颜彬 申请人:南京基蛋生物科技有限公司