专利名称：氯磺隆分子印迹spr传感器芯片的制备方法
技术领域：
本发明涉及SPR传感器芯片的制备方法。
背景技术：
氯磺隆是一类高效、广谱、高选择性的除草剂，目前，广泛用于大豆、玉米等油料作物。这种除草剂一般其使用剂量�。捎谄涫粲诔げ行С菁粒谕寥乐械奈⒘坎辛艋岫孕矶嗝舾泻蟛缱魑镌斐梢┖Γ┟裨斐删薮笏鹗В鞴群蠖贾贫瞬辛粝蘖浚嗍夜娑ㄍ嘁┪锏腗RL :0. 05-2ppm之间。由于其性质不稳定,残留量较低,监控较为困难。当前，分析磺酰脲类除草剂残留的主要方法是液相色谱及其联用技术。但由于其残留浓度低，前处理繁琐和基体干扰大，严重限制了常规快速检测方法和仪器分析方法对样品中氣横隆残留的有效检测，因此，探索一种闻灵敏度的快速检测的新方法，对于提闻农产品中农药残留检测灵敏度和准确性十分必要。表面等离子体波共振(SPR)技术是利用了金属薄膜光学耦合产生的物理光学现象，是一种非常灵敏的光学分析手段。自1902年被wood在光学实验室首次发现了 SPR现象后，1990年瑞典的BIAcore公司开发了世界上第一台商业化的SPR生物传感器，因其能实时监测生物分子间相互作用，且无需标记、分析快捷、灵敏度高、前处理简单、样品用量少等优点，SPR传感器研究得到了迅猛发展，现已被广泛应用于蛋白质组学、药物研发、临床诊断、食品安全和环境监测等领域并且显示出广阔的应用前景。SPR生物传感器其原理是利用抗原抗体免疫反应技术引起敏感膜的光学属性(主要是折射率)的变化，来检测待测分子的成分、浓度以及参与化学反应的特性。其芯片往往接枝生物活性分子(抗体及其衍生物)，反复或长期使用可导致偶联的分子容易失去生物活性或脱落，使用寿命短，不易保存等缺点，同时合成这种芯片成本很高。分子印迹聚合物(MIP)是一种模拟抗原抗体反应合成的具有较强分子识别能力的新型高分子仿生材料，具有预定性、识别专一性、实用性等特点，且制作简单、成本低廉、 坚固耐用、适用范围广。由于具有优良的操作稳定性，非常适于用作传感器的识别元件，分子印迹聚合物膜与传感器芯片基地膜牢固结合是分子印迹SPR传感器研究的技术瓶颈，而目前报道的SPR成膜方法主要是压膜法和化学合成法，均采用在芯片上直接合成分子印迹敏感膜，此方法制备的芯片存在敏感膜容易脱落、均匀性差、重复性和稳定性差等缺点，从而极大地影响了 SPR传感器的灵敏度等技术性能，难以用于实际样品的测定。
发明内容
本发明是要解决现有的分子印迹聚合物膜制备的芯片的灵敏度差的技术问题，而提供氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片的制备方法。本发明的氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片的制备方法按以下步骤进行一、镀膜采用真空蒸发镀膜的方法，在玻璃片上先沉积厚度为I. 5nm 2. 5nm的铬，然后再沉积厚度为45nm 55nm的纯度为99. 9999%的金，得到镀膜玻璃片；
二、清洗将质量百分浓度为30%的H2O2与质量百比浓度为98%的H2SO4的按体积比为I : 3的比例混合均匀，得到洗液；然后用该洗液清洗步骤一得到的镀膜玻璃片，再用去离子水清洗，最后用无水乙醇清洗，晾干后得到芯片基底；三、氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球制备称取氯磺隆、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯 (DEMAA)、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRM)和偶氮二异丁腈(AIBN)，加入到乙腈中， 升温至60°C 65°C并保持20 24h，将得到的产物用模板去除剂去除氯磺�。缓蟾稍铮� 得到氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球；其中氯磺隆与甲基丙烯酸二乙氨基乙酯的质量比为 I 4，氯磺隆与三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯的质量比为I : 4，偶氮二异丁腈的质量为甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEMAA)与三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯质量之和的2% 2.5%， 氯磺隆的物质的量与乙腈的体积的比为Immol 200mL ；四、称取步骤三制备的氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球和聚氯乙烯、邻苯二甲酸二丁酯加入到四氢呋喃中，用超声波混匀，得到镀膜液；其中聚氯乙烯与步骤三制备的氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球的质量比为I : 2. 5，邻苯二甲酸二丁酯的体积占四氢呋喃体积的8%，氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球与聚氯乙烯的质量之和与四氢呋喃体积的比为 (3. Omg 3. 5mg) : ImL ；五、将步骤四制备的镀膜液滴在步骤二制备的芯片基底中央，然后将芯片基底放在旋涂器上旋涂成膜，得到氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片。本发明的氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片以分子印迹聚合物膜做为介质膜，其厚度为200 500nm，具有传质距离短，吸附过程快的优点。即利用分子印迹技术和PCV镶嵌法结合，将粒径为100 200nm的氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球借助于PVC包埋固定在镀金的芯片基底表面上，聚氯乙烯是一种高分子聚合物，具有很好的包埋性质，同时PVC是惰性高聚物材料不会增加非特异性吸附，利用PVC作为支撑膜共聚事先合成的具有高通量和高选择性的分子印迹聚合物纳米微球，通过两步合成法，得到SPR芯片，既提高了分子印迹膜与裸金片的结合度又实现了分子印迹膜的高通量和高灵敏度。芯片上膜层颗粒分布比较均匀，增大了与模板结合面积，提供了更多结合位点，能更有效地特异性识别模板分子； 同时其膜厚度约为200 500nm，符合SPR芯片的厚度要求，而且芯片上聚合物层不易脱落， 芯片容易保存，对目标分析物氯磺隆敏感性高(其检测限可达20ng/mL)、选择性高、响应速度快(对氯磺隆的检测可在15分钟之内完成)的特点，而且抗干扰能力强，制备方法简便， 成本低廉，重现性好，易于加工成器件，可以直接检测农产品中中的痕量氯磺隆。用于传感与分离技术领域。
图I是试验一制备的氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片的原子力电镜显微照片；图2是试验一制备的氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片检测氯磺隆响应值图；图3是试验一制备的氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片的稳定性试验中检测氯磺隆响应值图。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式的氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片的制备方法按以
4下步骤进行一、镀膜采用真空蒸发镀膜的方法，在玻璃片上先沉积厚度为I. 5nm 2. 5nm的铬，然后再沉积厚度为45nm 55nm的纯度为99. 9999%的金，得到镀膜玻璃片；二、清洗将质量百分浓度为30%的H2O2与质量百比浓度为98%的H2SO4的按体积比为I : 3的比例混合均匀，得到洗液；然后用该洗液清洗步骤一得到的镀膜玻璃片，再用去离子水清洗，最后用无水乙醇清洗，晾干后得到芯片基底；三、氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球制备称取氯磺隆、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯 (DEMAA)、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRM)和偶氮二异丁腈(AIBN)，加入到乙腈中， 升温至60°C 65°C并保持20 24h，将得到的产物用模板去除剂去除氯磺�。缓蟾稍铮� 得到氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球；其中氯磺隆与甲基丙烯酸二乙氨基乙酯的质量比为 I 4，氯磺隆与三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯的质量比为I : 4，偶氮二异丁腈的质量为甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEMAA)与三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯质量之和的2% 2.5%， 氯磺隆的物质的量与乙腈的体积的比为Immol 200mL ；四、称取步骤三制备的氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球和聚氯乙烯、邻苯二甲酸二丁酯加入到四氢呋喃中，用超声波混匀，得到镀膜液；其中聚氯乙烯与步骤三制备的氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球的质量比为I : 2. 5，邻苯二甲酸二丁酯的体积占四氢呋喃体积的8%，氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球与聚氯乙烯的质量之和与四氢呋喃体积的比为 (3. Omg 3. 5mg) : ImL ；五、将步骤四制备的镀膜液滴在步骤二制备的芯片基底中央，然后将芯片基底放在旋涂器上旋涂成膜，得到氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中所述的模板去除剂是质量百分浓度为10%的乙酸甲醇溶液。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤三中所述的用模板去除剂去除氯磺隆的方法为索氏提取器法。其它与具体实施方式
一相同。索氏提取器法是常规的操作方法。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤五所述的旋涂的转速3000 5000转/分，旋涂时间为2 3分钟。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤五所述的旋涂的转速4000转/分，旋涂时间为2. 5分钟。其它与具体实施方式
一至三之一相同。用以下试验验证本发明的有益效果试验一本试验一的氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片的制备方法按以下步骤进一、镀膜采用真空蒸发镀膜的方法，在玻璃片上先沉积厚度为2nm的铬，然后再沉积厚度为50nm的纯度为99. 9999%的金，得到镀膜玻璃片；二、清洗将质量百分浓度为30%的H2O2与质量百比浓度为98%的H2SO4的按体积比为I : 3的比例混合均匀，得到洗液；然后用该洗液清洗步骤一得到的镀膜玻璃片，再用去离子水清洗3次，最后用无水乙醇清洗3次，晾干后得到芯片基底；三、氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球制备称取氯磺隆、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEMAA)、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRM)和偶氮二异丁腈(AIBN)，加入到乙腈中，升温至60°C并保持24h，将得到的产物用模板去除剂去除氯磺隆，然后干燥，得到氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球；其中氯磺隆与甲基丙烯酸二乙氨基乙酯的质量比为I : 4，氯磺隆与三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯的质量比为I : 4，偶氮二异丁腈的质量为甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEMAA)与三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯质量之和的2%，氯磺隆的物质的量与乙腈的体积的比为lmmol : 200mL ；四、称取步骤三制备的氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球和聚氯乙烯、邻苯二甲酸二丁酯加入到四氢呋喃中，用超声波混匀，得到镀膜液；其中聚氯乙烯与步骤三制备的氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球的质量比为I : 2.5，聚氯乙烯的质量占四氢呋喃质量的8%，氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球与聚氯乙烯的质量之和与四氢呋喃体积的比为 (3. Omg : ImL ；五、将步骤四制备的镀膜液滴在步骤二制备的芯片基底中央，然后将芯片基底放在旋涂器上旋涂成膜，得到氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片。其中步骤三中的模板去除剂是质量百分比浓度为10%的乙酸甲醇溶液，用模板去除剂去除氯磺隆的方法为索氏提取器法；其中步骤五所述的旋涂的转速4000转/分，旋涂时间为3分钟；本试验制备的氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片的原子力电镜显微照片如图I所示，从图I可以看出，芯片表面的PCV分子印迹共聚膜层厚度在184 684nm之间。利用本试验制备的氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片的检测氯磺�。浼觳夥椒ㄈ缦屡渲艬R缓冲液(I)、按氯磺隆浓度为20ng/mL将氯磺隆加入到BR缓冲液中，得到试样
(2)、按氯磺隆浓度为30ng/mL将氯磺隆加入到BR缓冲液中，得到试样(3)、按氯磺隆浓度为50ng/mL将氯磺隆加入到BR缓冲液中，得到试样(4)，模板去除剂(5)是质量百分比浓度为。依次将BR缓冲液(I)、试样(2)、试样(3)、试样(4)、(5)通入SPR传感器的流通系统， 评估芯片对氯磺隆的最低检测能力。其检测过程的响应值如图2所示，其中曲线I段为通入BR缓冲液(I)的响应值，曲线2段为通入试样(2)后响应值的变化，可见当通入氯磺隆浓度为20ng/mL的试样(2)后，信号没有出现迅速上升的现象，而是缓慢逐渐的升高，经过 15min后响应值趋于稳定不再升高(差值为2500RU)，随后通入缓冲液时响应值没有改变， 说明之前的折射率变化全部来自于芯片特异性结合的模板分子所致；曲线3段代表通入试样(3)后响应值的变化，可见响应值缓慢升高，经过15min后响应值趋于稳定不再升高(差值高达2750RU)，说明SPR芯片的响应值改变随着浓度的增加而增加；当继续通入氯磺隆浓度为50ng/mL的试样(4)时响应值亦升高，但再通入BR缓冲液⑴时，响应值出现下降，基线逐渐降低，这个结果提示此时芯片结合模板分子并非特异性结合从而发生了解离，致使基线下降；曲线5段为通入模板去除剂(5)进行芯片的再生，结果提示基线可恢复到原来水平。上述实验表明，该发明的芯片对目标分析物氯磺隆敏感性高(其检测限可达 20ng/mL)、选择性高、响应速度快(其检测可在15分钟之内完成)。利用本试验制备的氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片的重复检测氯磺隆浓度为 Ippm的乙醇溶液，评估芯片对氯磺隆检测的稳定性，其检测方法如下将Ippm的氯磺隆乙醇溶液和BR缓冲液置入SPR传感器的流通系统，交替通入，得到的响应值的变化曲线如图3所示，其中I段表示通入BR缓冲液时的响应值，2段表示通入Ippm的氯磺隆乙醇溶液时的响应值，从图3可以看出，交替通入BR缓冲液和氯磺隆乙醇溶液，其响应值变换迅速，而且氯磺隆乙醇溶液的响应值没有变化，说明本芯片的稳定性好。
权利要求
1.氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片的制备方法，其特征在于氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片的制备方法按以下步骤进行一、镀膜采用真空蒸发镀膜的方法，在玻璃片上先沉积厚度为I.5nm 2. 5nm的铬，然后再沉积厚度为45nm 55nm的纯度为99. 9999%的金，得到镀膜玻璃片；二、清洗将质量百分浓度为30%的H2O2与质量百比浓度为98%的H2SO4的按体积比为I : 3的比例混合均匀，得到洗液；然后用该洗液清洗步骤一得到的镀膜玻璃片，再用去离子水清洗，最后用无水乙醇清洗，晾干后得到芯片基底；三、氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球制备称取氯磺隆、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈，加入到乙腈中，升温至60°C 65°C并保持 20 24h，将得到的产物用模板去除剂去除氯磺�。缓蟾稍铮玫铰然锹》肿佑〖＞酆衔锬擅孜⑶颍黄渲新然锹∮爰谆┧岫野被阴サ闹柿勘任狪 : 4，氯磺隆与三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯的质量比为I : 4，偶氮二异丁腈的质量为甲基丙烯酸二乙氨基乙酯与三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯质量之和的2% 2. 5%，氯磺隆的物质的量与乙腈的体积的比为 Immol : 2OOmL ；四、称取步骤三制备的氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球和聚氯乙烯、邻苯二甲酸二丁酯加入到四氢呋喃中，用超声波混匀，得到镀膜液；其中聚氯乙烯与步骤三制备的氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球的质量比为I : 2.5，邻苯二甲酸二丁酯的体积占四氢呋喃体积的8%，氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球与聚氯乙烯的质量之和与四氢呋喃体积比为 (3. Omg 3. 5mg) : ImL ；五、将步骤四制备的镀膜液滴在步骤二制备的芯片基底中央，然后将芯片基底放在旋涂器上旋涂成膜，得到氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片。
2.根据权利要求I所述的氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片的制备方法，其特征在于步骤三中所述的模板去除剂是质量百分浓度为10%的乙酸甲醇溶液。
3.根据权利要求I或2所述的氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片的制备方法，其特征在于步骤三中所述的用模板去除剂去除氯磺隆的方法为索氏提取器法。
4.根据权利要求I或2所述的氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片的制备方法，其特征在于步骤五所述的旋涂的转速3000 5000转/分，旋涂时间为2 3分钟。
5.根据权利要求I或2所述的氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片的制备方法，其特征在于步骤五所述的旋涂的转速4000转/分，旋涂时间为2. 5分钟。
全文摘要
氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片的制备方法，本发明涉及SPR传感器芯片的制备方法。本发明是要解决现有的分子印迹聚合物膜制备的芯片的灵敏度差的技术问题。方法在玻璃片上沉积铬、金后，再经洗涤，得到芯片基底；将氯磺隆、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈加入到乙腈中反应，将反应产物去除氯磺隆模板，干燥后得到氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球；将氯磺隆分子印迹聚合物纳米微球与聚氯乙烯、邻苯二甲酸二丁酯加入到四氢呋喃中混匀得到镀膜液；再将镀膜液涂于芯片基底上，得到氯磺隆分子印迹SPR传感器芯片。该芯片对氯磺隆检测限可达20ng/mL，可检测痕量氯磺�。糜诖杏敕掷爰际趿煊�。
文档编号G01N21/41GK102608069SQ201210080990
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月23日 优先权日2012年3月23日
发明者佘永新, 史晓梅, 王淼, 王静 申请人:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
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