专利名称：一种快速分析细胞和组织内多个蛋白表达及其相互关系的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速分析细胞和组织内多个蛋白的表达及其相互关系的方法，以及所述方法用于检测细胞和组织内多个蛋白的表达及其相互关系的用途。
背景技术：
在人类基因组测序工作完成以后，人类进入了后基因组时代。生命科学的研究重点也由基因的序列鉴定转向了基因功能的研究。蛋白质作为基因功能的载体直接而且具体的调控着细胞、组织、乃至整个生命体的各种复杂的生化反应、生理功能、病理过程。在各种生命活动中，不同蛋白质不仅各自具有独特的功能，相关的蛋白质还通过相互作用形成复杂的网络，这种现象尤其突出地表现在各种信号传导通路中。
目前人类面临的主要疾�。缧哪匝芗膊�、肿瘤、糖尿病等的发生、发展及转归均涉及一系列基因的改变。因此，检测相关蛋白质的细胞、组织定位、特别是多个相关蛋白在细胞、组织中的共定位以及它们表达丰度的关系，是评价基因及其蛋白产物在相关疾病的病理过程中所发挥作用的重要信息。
免疫组织化学和免疫细胞化学是临床、科研中检测蛋白质组织或细胞定位最常用的方法。然而，目前这种现有方法在一张制片上通常一次仅检测一种目标蛋白质，极少数检测两种目标蛋白质。如需要检测三种或三种以上目标蛋白时，只能使用多张制片分别进行。采用所述方法无法在同一细胞或组织中真实地再现出多个相关目标蛋白质所处的相对位置，以及表达丰度之间的相对关系，已不能满足生命科学研究日新月异的需要。然而遗憾的是，至今还没有一种方法能很好地解决这一问题。本发明人通过一种快速分析细胞和组织内多个蛋白的表达及其相互关系的方法，成功地解决了上述问题。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种新的免疫细胞、组织化学技术，称之为三维多靶免疫荧光细胞及组织化学方法，用于快速分析细胞和组织内多个蛋白表达及其相互关系。所述方法将免疫组化、多色荧光与三维重建技术有机地整合在一起，从而实现快速分析细胞和组织内多个蛋白的表达及其相互关系的。具体地，在本发明所述方法包括1)在同一细胞或组织制片上同时使用多种荧光标记的不同抗体；2)在显微镜下用多色荧光滤片系统进行分色拍照，通过软件合成后得到具有多色信号的图片，每种蛋白信号的荧光颜色各不相同；3)驱动显微镜Z轴马达，在不同的平面连续变焦拍照，将得到的不同层面的图片由软件进行三维重建，即得到一个立体的多蛋白信号影视图像。
通过本发明所述方法，能够成功地1)原位检测和观察多种蛋白质在同一细胞中的表达丰度、相对空间定位、关系；2)原位检测和观察多种蛋白质在同一组织中的表达丰度、相对空间定位、关系；以及3)原位检测和观察信号传导通路中各个蛋白质的表达状况及彼此关系。同时，由于多个蛋白使用同一张组织或细胞制片，完成多个蛋白的分析可同时进行，既省时间，又省材料。并且，在分析多个蛋白的表达时，不同蛋白可以互相作为参照，排除了多张制片分别进行单个蛋白检测时的条件不一致，而且获得的信息更为客观、可靠。
在本发明的一个具体实施方案中，可以将培养的细胞固定于载玻片上，按常规方法加入各种待测蛋白的一抗，每种抗体均为不同动物来源；洗片后加入各种荧光标记的二抗；洗片、脱水封片后即可在显微镜下观察荧光信号。荧光显微镜在软件的驱动下摄取和合成图像，进一步进行三维重建，得到立体的多种蛋白质表达丰度、再现空间定位情况。
本发明又一方面，涉及本发明所述方法用于检测细胞和组织内多个蛋白的表达及其相互关系的用途。采用本发明所述方法能够检测待测的目标细胞和/或组织中的不同蛋白的表达或其相互关系。
实施例一利用本发明所述方法检测和观察食管癌细胞系EC9706细胞内p53、Rb、p16、p21以及E2F的表达量及其相互位置关系利用本发明所述方法检测和观察食管癌细胞系EC9706细胞内p53、Rb、p16、p21以及E2F的表达量及其相互位置关系，具体步骤如下1.将食管癌细胞系EC9706在放有盖玻片的培养皿中常规培养；2.待细胞密度达到将盖玻片覆盖近满时，取出盖片；3.PBS洗，3分钟X3次；4.4％多聚甲醛固定15分钟；5.PBS洗，3分钟X3次；6.1％Triton X-100，15分钟；7.PBS洗，3分钟X3次；8.在盖片上滴加10％正常兔血清(PBS稀释，以封闭可能的内源性二抗结合位点)，37℃，30分钟；9. PBS洗，3分钟X3次；10.加一抗混合液100μl，含下列成分各10μg/ml小鼠抗p53大鼠抗Rb山羊抗p16马抗p21猴抗E2F11.4℃过夜；12.PBS洗，3分钟X 3次；13.加二抗混合液，含下列成份各10μg/ml
兔抗小鼠-FITC兔抗兔-Texas R兔抗山羊-Cy3兔抗马-Cy5兔抗猴-Coumarin14.37℃，30分钟；15.PBS洗，3分钟X3次；16.梯度酒精脱水；17.用含有1μg/ml DAPI的甘油封片；18.在Opton Axiphot荧光显微镜下，选择适合观察FITC荧光的滤光片镜检，通过Z轴马达驱动变焦、由Metamorph软件控制的CCD连续拍照，获得细胞不同平面p53蛋白的信号图像。
19.以类似方式选择适合观察Texas R、Cy3、Cy5、Coumarin的滤光片镜检，分别获得细胞不同平面Rb，p16，p21，E2F蛋白的信号图像。
20.a)利用Metamorph软件，将p53蛋白在细胞不同平面的信号图像进行合成，即得到该蛋白在细胞全景下的立体影视图像。以类似方式分别得到Rb，p16，p21，E2F蛋白在细胞全景下的立体影视图像。
b)选择相同平面的五种蛋白的图像(CCD连续拍照时，每幅图像均已在软件控制下自动记录了编号。根据编号可以非常方便地提取指定平面的图像)，利用Metamorph软件进行合成，即得到该平面五种蛋白的复合图像，明确各自的位置及其相互关系。以类似方式获得其它平面五种蛋白的复合图像、各自的位置及其相互关系。
实施例二利用本发明所述方法检测和观察组织切片蛋白质的表达水平及其之间的相互关系利用本发明所述方法检测和观察组织切片蛋白质的表达水平及其之间的相互关系，包括如下步骤
1.石蜡包埋的组织切片常规脱蜡至水；2.PBS浸泡5分钟；3.0.01M枸橼酸盐缓冲液，95℃微波，15分钟；4.室温30分钟自然冷凉，将切片由缓冲液中取出；5.PBS洗，3分钟X3次；6.其余步骤同实施例1中所述步骤8-20。
应用此法可观察不同蛋白在组织内同一细胞中、同一组织不同部位的核蛋白、胞浆蛋白、膜蛋白以及细胞间质蛋白的表达状况及相互关系。
本工作受国家高技术研究发展计划基金(2001AA221151)、国家科技攻关计划基金(2002BA711A06)、国家重点基础研究发展规划基金(G1998051205，2001CB510208，2002CB513101)和教育部高等学校博士学科点基金(20020023018)资助。
权利要求
1.一种快速分析细胞和/或组织内多个蛋白表达及其相互关系的方法，包括1)在同一细胞或组织制片上同时使用多种荧光标记的不同抗体；2)在显微镜下用多色荧光滤片系统进行分色拍照，通过软件合成后得到具有多色信号的图片，其中每种蛋白信号的荧光颜色各不相同；3)驱动显微镜Z轴马达，在不同的平面连续变焦拍照，将得到的不同层面的图片由软件进行三维重建，即得到一个立体的多蛋白信号影视图像。
2.权利要求1所述的方法用于检测细胞和组织内多个蛋白的表达及其相互关系的用途。
全文摘要
本发明涉及一种快速分析细胞和组织内多个蛋白的表达及其相互关系的方法，以及所述方法用于检测细胞和组织内多个蛋白的表达及其相互关系的用途。
文档编号G01N33/68GK1619308SQ20031011536
公开日2005年5月25日 申请日期2003年11月21日 优先权日2003年11月21日
发明者王明荣, 徐昕, 韩亚玲, 蔡岩, 吴旻 申请人:中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所
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