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专利名称：一种适于Bt水稻种植及其秸秆还田土壤微生物呼吸强度的分析方法
技术领域：
本发明属于生态环境保护领域，尤其涉及一种适于Bt水稻种植及其秸秆还田土壤微生物呼吸强度的分析方法。
背景技术：
为克服农药大量使用产生的弊端、保障农作物高产稳产，转基因作物的研发得以快速发展，2009年全球转基因种植面积从1996年0. 0174亿公顷发展到1. 34亿公顷，其中 Bt水稻是一类转入了含有苏云金芽孢杆菌(Bacillus thueingiensis)杀虫毒性基因片段的转基因作物，具有抗鳞翅目(L印idoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Hymenoptera)、 同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophage)等多种昆虫及其幼虫特性，也是我国重要转基因作物之一。然而，转基因作物的利用在降低农药用量、保障作物产量的同时是否对农田生态安全构成潜在的威胁是目前关注的重要问题。土壤呼吸强度往往看作是衡量土壤微生物总的活性指标，或者作为评价土壤肥力的指标之一。Bt作物在生长过程中产生各种毒性蛋白，这些蛋白通过根际分泌物，秸秆腐烂等方式进入土壤，它可能对土壤呼吸强度产生负面影响，是转基因作物安全性评价的重要内容，因此测量Bt作物种植和秸秆还田土壤微生物呼吸强度具有十分重要的意义。

发明内容
本发明提供了一种适于Bt水稻种植及其秸秆还田土壤微生物呼吸强度的分析方法，为BT水稻对土壤生态系统安全评估提供技术手段。一种适于Bt水稻种植及其秸秆还田土壤微生物呼吸强度的分析方法，包括将采集的土壤样品和和葡萄糖溶液在密封容器混合均勻，分别培养7和24小时后，利用气相色谱测定每克土壤样品产生的CO2的量；以分别表征Bt水稻种植及其秸秆还田土壤微生物呼吸强度和土壤微生物利用葡萄糖的能力。所述的葡萄糖溶液的浓度为0. 05 0. 2mol/L,更优选为0. lmol/L。所述土壤样品与葡萄糖溶液的重量体积比为Ig 0.2 0.6!1^，更优选为 Ig 0.4mL。本发明优点在于方法本身简单、快捷，更重要的是可以利用7小时和24小时产生的CO2的量区分Bt水稻种植及其秸秆还田对土壤微生物的影响和恢复力。


图1为CO2标准气体和土壤呼吸释放的CO2气相色谱图(a =CO2标准气体；b 土壤呼吸)。图2为华池B6、嘉早935、中九B种植期间不同生长期根际土壤培养7h和24h的
厌氧呼吸作用。
图3为华池B6、嘉早935和中九B秸秆还田后不同取样时间土壤培养7h和24h的厌氧呼吸作用。
具体实施例方式水稻材料Bt水稻华池B6、亲本嘉早935和远缘亲本中九B。田间试验设计与取样田间实验在浙江省建德市苗木基地进行，试验田划分为9个小区，分别种植这三个水稻品种，每个品种均设3个重复小区，每个小区26-28行X 12株/行> 300株，不同品种的小区间隔设置。在水稻的分蘖期、抽穗期、灌浆期和成熟期分别取样。将水稻连同其根部的泥土用小铲一起拔出并带回实验室，每个小区取三株水稻样品。取回的样品在室温下适度风干后， 抖落并收集根际周围的土壤，在除去植物残根和石砾等杂物后，过2mm筛后进行土壤呼吸活性的测定。水稻成熟后将水稻秸秆切成长约2cm的片段并在室温条件下风干。翻耕后，在原种植小区上进行同品种的水稻秸秆还田实验，将秸秆均勻的铺撒在小区内并在其上覆盖厚约5cm的土层，每个小区的还田秸秆量为7kg。在秸秆还田后的97、128、158和189天分别取样，取回的样品在室温下适度风干后，去除残根和石砾等杂物后，过2mm筛后待用。土壤呼吸活性的测定准确称取相当于5g干土重的新鲜土样于50ml磨口细口瓶中，加入2ml浓度为 0. lmol/1的灭菌葡萄糖溶液，充满高纯氮气并用橡皮塞塞好，再用封口胶将瓶口密封以确保其密封性。将细口瓶放在30°C恒温培养箱中黑暗培养7h、24h后用安捷伦气密性进样针从细口瓶抽取500 μ 1气体，之后再进气相色谱分析。CO2用福立GC-9790气相色谱测定，CO2经转化炉转化为CH4后通过FID检测器检测，CO2标准气体以及土壤呼吸产生的CO2气相色谱图如图1所示，检测条件为载气高纯氮气色谱柱(TDX-01，1.5mX 2mm i. d)；检测器温度180°C;柱温100°C;进样口温度120°C;转化炉温度320°C ；进样量7h为 500μ l，24h 为 200μ 1。土壤呼吸CO2的计算公式
V -M V每克干土呼吸产生的= ^
IlA. m K3V1 根据标准曲线计算得到的相当于标准气体的体积，LM =CO2的摩尔质量，g/mol (本实验取44)V2 细口瓶剩余体积，ml (本实验均为64ml)m 干土的重量，g(本实验为5g)
V3 进样量，ml (本实验为0. 5和0. 2ml)Bt水稻种植土壤微生物呼吸呼吸强度培养7h后，转基因华池B6、亲本嘉早935、远缘亲本中九B在分蘖期、抽穗期、灌浆期和成熟期土壤厌氧呼吸强度如图2所示。在水稻分蘖期，华池B6、嘉早935、中九B 土壤厌氧呼吸强度分别为0. 35,0. 33,0. 38mgC02/g干土，转基因比亲本高6 %而比远缘亲本低 7.9%，经ANOVA分析发现三个品种间差异不显著；在水稻抽穗期，其相应的土壤呼吸强度分别为0. 38,0. 49,0. 52mg C02/g干土，经ANOVA分析转基因与亲本、远缘亲本间均存在显著差异，转基因比亲本、远缘亲本分别低22. 4%,26. 9% ；在水稻灌浆期，其相应的土壤呼吸强度分别为0. 26,0. 36,0. 35mg C02/g干土，经ANOVA分析表明转基因与亲本、远缘亲本间差异显著，转基因水稻比亲本、远缘亲本低27. 8%,25. 7% ；成熟期，转基因、亲本、远缘亲本土壤呼吸强度均为0. 33mg C02/g干土。在培养24h，Bt水稻种植对土壤厌氧呼吸强度如图2所示。在水稻分蘖期，转基因、 亲本和远缘亲本土壤呼吸强度分别为3. 41,2. 75,3. 07mgC02/g干土，转基因比亲本、远缘亲本高24%、11. 1%，经ANOVA分析显示三个品种间差异不显著；在水稻抽穗期其相应的土壤呼吸强度分别为2. 71,3. 31,3. 43mg C02/g干土，转基因与亲本、远缘亲本间差异显著，转基因分别比亲本、远缘亲本低18. 1%,21% ；在水稻灌浆期，其相应的土壤呼吸强度分别为 1. 98、1. 91、1. 9Img C02/g干土，在水稻成熟期，其相应的土壤呼吸强度分别为1. 43、1. 50、 1. 40mg C02/g干土，经ANOVA分析表明这两个生长期各个品种间不存在显著性差异。Bt水稻秸秆还田土壤微生物呼吸强度图3为华池B6、嘉早935和中九B秸秆还田后不同取样时间土壤培养7h和24h 的厌氧呼吸作用。培养7h后，Bt水稻华池B6秸秆还田后97、128、158和189天土壤厌氧呼吸产生的CO2量与其亲本嘉早935和远缘亲本中九B间均不存在显著差异。嘉早935在秸秆还田后128和158天呼吸作用分别高于华池B622. 3%、24.6%，高于中九B 30.4%, 30.6%，但不存在显著差异。在培养24h后，土壤呼吸作用的结果与培养7h类似，不存在长期的显著差异。华池B6在秸秆还田后97和189天土壤厌氧呼吸作用与远缘亲本中九B处理存在差异显著， 分别高31. 4%,28. 5%，而华池B6与嘉早935间不存在显著差异。
权利要求
1.一种适于Bt水稻种植及其秸秆还田土壤微生物呼吸强度的分析方法，包括 将采集的土壤样品和和葡萄糖溶液在密封容器混合均勻，分别培养7和24小时后，利用气相色谱测定每克土壤样品产生的CO2的量，分别表征Bt水稻种植及其秸秆还田土壤微生物呼吸强度和土壤微生物利用葡萄糖的能力。
2 根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的葡萄糖溶液的浓度为0.05 0.2mol/L。
3.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述的葡萄糖溶液的浓度为0.Imol/L0
4.根据权利要求2或3所述的分析方法，其特征在于，所述土壤样品与葡萄糖溶液的重量体积比为Ig 0. 2 0. 6mL。
5.根据权利要求4所述的分析方法，其特征在于，所述土壤样品与葡萄糖溶液的重量体积比为Ig 0. 4mL。
全文摘要
本发明公开了一种适于Bt水稻种植及其秸秆还田土壤微生物呼吸强度的分析方法，包括将采集的土壤样品和和葡萄糖溶液在密封容器混合均匀，分别培养7和24小时后，利用气相色谱测定每克土壤样品产生的CO2的量，分别表征Bt水稻种植及其秸秆还田土壤微生物呼吸强度和土壤微生物利用葡萄糖的能力。本发明优点在于方法本身简单、快捷，更重要的是可以利用7小时和24小时产生的CO2的量区分Bt水稻种植及其秸秆还田对土壤微生物的影响和恢复力。
文档编号G01N30/02GK102435684SQ20111027953
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月20日 优先权日2011年9月20日
发明者董斌, 虞云龙 申请人:浙江大学