专利名称：一种嗜铬粒蛋白a化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫分析医学技术领域，具体地涉及一种人血清中嗜铬粒蛋白A(CgA) 化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法。
背景技术：
嗜铬粒蛋白A (Chromogranin A，CgA)是一种由439个氨基酸组成的酸性可溶性蛋白，为嗜铬蛋白家族的主要成员。广泛存在于神经内泌细胞中，血浆中CgA浓度的升高可提示神经内分泌来源的肿瘤。几乎所有类型的神经内泌肿瘤的诊断中都会出现CgA水平的升高。因此神经内泌肿瘤的诊断中，CgA是极具价值的诊断标志物。若以32.7U/L作为临界值，CgA对胰腺肿瘤的灵敏度和特异性分别为82. 和96. 2%，对嗜铬细胞瘤的灵敏度和特异性分别为88. 5%和96. 2%。因此，CgA的定量检测对于胰腺癌及嗜铬细胞癌的临床诊断具有十分重要的意义。
目前对CgA的测定报道的方法主要有酶联免疫分析法(ELISA)、免疫放射分析法 (IRMA)等。如上海研辉生物科技有限公司提供的进口试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人嗜铬蛋白A(CgA)水平。用纯化的人嗜铬蛋白A(CgA)抗体包被微孔板，制成固相抗体， 往包被单抗的微孔中依次加入嗜铬蛋白A(CgA)，再与HRP标记的羊抗人抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过洗涤后加底物TMB显色。用酶标仪测定吸光度(0D值)， 通过标准曲线计算样品中人嗜铬蛋白A(CgA)含量。再如中国协和医科大学采用酶联免疫吸附分析法(ELISA)对血清CgA水平进行检测。结果表明，血清CgA浓度与CgA在嗜铬细胞瘤组织中的表达强度相关，与肿瘤重量呈正相关，高水平的血清CgA浓度提示肿瘤很可能为恶性。ELISA方法受影响因素较多，很容易造成结果失真，准确性较差。因此该技术在科研中应有较多，而在临床检测中应有并不多。
法国CIS公司研制了一种免疫放射分析法检测CgA的试剂盒，用一株CgA单克隆抗体包被试管，另一株CgA单抗用碘-125 (125I)标记，通过双抗体夹心法检测血清中CgA的浓度。该方法操作简单，测定结果比较准确可靠。但由于碘-125具有放射性污染，在我们对环保要求越来越高的今天，放射免疫分析技术显然不符生物医药技术的发展趋势。发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种灵敏度高、准确度高、又没有放射性污染的嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒。
本发明的第二个目的是提供一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒的制备方法。
本发明的技术方案概述如下
一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒，包括如下组分
1)嗜铬粒蛋白A标准品；
2)辣根过氧化物酶标记的嗜铬粒蛋白A单克隆抗体；
3)嗜铬粒蛋白A单克隆抗体包被的磁颗粒；
4)白色不透明微孔板；
幻洗涤液；
6)化学发光底物A及B工作液。
所述辣根过氧化物酶标记的嗜铬粒蛋白A单克隆抗体是用下述方法制成
①称取CgA单克隆抗体2. Omg，加入1 2ml浓度为0. 05mol/L,pH = 7. 5的碳酸盐缓冲液溶解，4°C储存备用；
②称取10. Omg的辣根过氧化物酶，加入1.0ml去离子水，振荡，溶解后，取出 0. 14 0. 2&iil，加入0. lmol/L的NaIO4溶液0. 2ml，室温下避光反应1 2小时；
③将步骤①获得的液体与步骤②的获得的液体混合，室温下避光反应4 8小时；
④加入200 μ 1浓度为5mg/ml的NaBH4水溶液，室温下避光反应1 2小时；
⑤用0. 02M PBS透析12-24小时，用HPLC 二次纯化，收集蛋白峰并于-20°C下冷冻保存。
所述嗜铬粒蛋白A单克隆抗体包被的磁颗粒是用下述方法制成
①取5mL磁颗粒质量含量为2. 5%的PBS溶液，用磁板分离弃上清，用去离子水洗磁颗粒；
②用0. 02mol/L pH = 6. 2 的 PBS 洗磁颗粒；
③用0. 02mol/L pH = 6. 2的PBS调整总体积为5 IOml ；
④加CgA单抗5mg放在摇床上进行勻化10 20分钟；
⑤加入碳二亚胺5 IOmg ；室温，放在摇床上进行勻化5 10小时；
⑥用0. lmol/L pH = 7. 4的磷酸盐缓冲液洗涤2次；
⑦加入iTris 和 EDTA，使 iTris 的含量为 0. 05mol/L,使 EDTA 的含量为 0. 004mol/L, 调pH = 7. 5，使抗体浓度为1. 0mg/ml，2-4°C保存。
所述洗涤液的配制
取三羟甲基氨基甲烷6. 05g ；NaC18. 55g ；Tween-20 0. 5ml ；加水至 IL ；用 HCl 调 pH 至 7.5 士 0. 1。
化学发光底物A工作液是用下述方法制成
(1)配制 0. 05mol/L pH = 8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液；
(2)向IOOOml所述步骤(1)配制的Tris-HCl缓冲液中加入3 5mmol鲁米诺，混勻；让化学发光底物B工作液是用下述方法制成
(1)配制 0. 05mol/L pH = 8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液；
(2)向IOOOml所述步骤(1)配制的Tris-HCl缓冲液中加入0. 5 1. Ommol四苯硼钠；1. 42mmol铁氰化钾；0. 38mmol肉桂酸；7. 56mmol过氧化氢，混勻。
一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，包括如下步骤
1)准备嗜铬粒蛋白A标准品；
2)制备辣根过氧化物酶标记的嗜铬粒蛋白A单克隆抗体；
3)制备嗜铬粒蛋白A单克隆抗体包被的磁颗粒；
4)准备白色不透明微孔板；
5)制备洗涤液；
6)制备化学发光底物A及B工作液。
制备辣根过氧化物酶标记的嗜铬粒蛋白A单克隆抗体的步骤是
①称取CgA单克隆抗体2. Omg,加入1 2ml浓度为0. 05mol/L, pH = 7. 5的碳酸盐缓冲液溶解，4°C储存备用；
②称取10. Omg的辣根过氧化物酶，加入1.0ml去离子水，振荡，溶解后，取出 0. 14 0. 2&iil，加入0. lmol/L的NaIO4溶液0. 2ml，室温下避光反应1 2小时；
③将步骤①获得的液体与步骤②的获得的液体混合，室温下避光反应4 8小时；
④加入200 μ 1浓度为5mg/ml的NaBH4水溶液，室温下避光反应1 2小时；
⑤用0. 02M PBS透析12- 小时，用HPLC 二次纯化，收集蛋白峰并于_20°C下冷冻保存。
制备嗜铬粒蛋白A单克隆抗体包被的磁颗粒的步骤是
①取5mL磁颗粒质量含量为2. 5%的PBS溶液，用磁板分离弃上清，用去离子水洗磁颗粒；
②用0. 02mol/L pH = 6. 2 的 PBS 洗磁颗粒；
③用0. 02mol/L pH = 6. 2的PBS调整总体积为5 IOml ；
④加CgA单抗5mg放在摇床上进行勻化10 20分钟；
⑤加入碳二亚胺5 IOmg ；室温，放在摇床上进行勻化5 10小时；
⑥用0. lmol/L pH = 7. 4的磷酸盐缓冲液洗涤2次；
⑦加入iTris 和 EDTA，使 iTris 的含量为 0. 05mol/L,使 EDTA 的含量为 0. 004mol/L, 调pH = 7. 5，使抗体浓度为1. 0mg/ml，2-4°C保存。
制备所述洗涤液的步骤是
取三羟甲基氨基甲烷6. 05g ；NaC18. 55g ；Tween-200. 5ml ；加水至 IL ；用 HCl 调 pH 至 7. 5 士 0. 1。
制备化学发光底物A工作液的步骤是
(1)配制 0. 05mol/L pH = 8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液；
(2)向IOOOml所述步骤(1)配制的Tris-HCl缓冲液中加入3 5mmol鲁米诺，混勻；所述制备化学发光底物B工作液的步骤是
(1)配制 0. 05mol/L pH = 8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液；
(2)向IOOOml所述步骤(1)配制的Tris-HCl缓冲液中加入0. 5 1. Ommol四苯硼钠；1. 42mmol铁氰化钾；0. 38mmol肉桂酸；7. 56mmol过氧化氢，混勻。
本发明将化学发光免疫分析与纳米磁颗粒技术相结合，提供一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒。本方法既克服了传统ELISA方法灵敏度低、准确度较差的缺点，又没有RIA技术的放射性污染，具有安全环保、特异性强、灵敏度及准确度高等优点。
图ICgA化学发光免疫分析原理示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明
实施例1
一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒的制备方法及实验操作程序
1.辣根过氧化物酶标记的嗜铬粒蛋白A单克隆抗体(简称酶标抗体)制备
①称取CgA单克隆抗体2. Omg放入5ml玻璃瓶内，加入1.0ml 0. 05mol/L, pH = 7. 5的碳酸钠缓冲液溶解，4°C储存备用；
②称取10. Omg的辣根过氧化物酶放入一只16 X IOOmm玻璃试管内，加入1.0ml 去离子水，振荡，待其完全溶解后，取出0. Hml放入另一只16X100mm玻璃试管内，加入0.lmol/L的NaIO4溶液0. 2ml (NaIO4溶液必须新鲜配制)，用胶塞将玻璃试管口塞紧，室温下避光反应1小时；
③将步骤①获得的液体与步骤②的获得的液体混合，室温下避光反应4小时；
④加入200 μ 1浓度为5mg/ml的NaBH4水溶液，室温下避光反应1小时；
⑤用0. 02M PBS透析18小时，用HPLC 二次纯化，收集蛋白峰并于_20°C下冷冻保存；
2、嗜铬粒蛋白A单克隆抗体包被的磁颗粒的制备；
①取5mL磁颗粒质量含量为2. 5%的PBS溶液中，用磁板分离弃上清，用去离子水洗磁颗粒1次；
②用0. 02mol/L pH = 6. 2 的 PBS 洗 1 次；
③用0. 02mol/L pH = 6. 2的PBS调整总体积约为5ml ；
④加CgA单抗5mg放在摇床上进行勻化10分钟；
⑤加入碳二亚胺(EDAC) 5mg ；室温，放在摇床上进行勻化5小时；
⑥用0. lmol/L pH = 7. 4磷酸盐缓冲液洗涤2次；
⑦加入iTris 和 EDTA，使 iTris 的含量为 0. 05mol/L,使 EDTA 的含量为 0. 004mol/L, 调pH = 7. 5，使抗体浓度为1. 0mg/ml，4°C保存。
3、洗涤液的配制
取三羟甲基氨基甲烷(TrisBase)6. 05g ；NaC18. 55g ；Tween-200. 5ml ；加水至 IL ； 用HCl调pH至7.5 士 0. 1，混勻；
4、化学发光底物A工作液的配制
(1)配制 0. 05mol/L pH = 8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液；
(2)向IOOOml所述步骤(1)配制的Tris-HCl缓冲液中加入3mmol鲁米诺，混勻。
5.化学发光底物B工作液的配制
(1)配制 0. 05mol/L pH = 8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液；
(2)向IOOOml所述步骤(1)配制的Tris-HCl缓冲液中加入:0. 5mmol四苯硼钠；1.42mmol铁氰化钾；0. 38mmol肉桂酸；7. 56mmol过氧化氢，混勻。
6、标准品的配制
0. OlM PBS 配制
①Nei2HPO4 1. 104g/L ；
②NaH2PO4 0. 25g/L ；
③NaCl8. 55/L ；
④ProClin300 1. 0ml/L，用 HCl 调 PH 至 7. 4士0. 1。
将上述0. OlM PBS与牛血清按体积比4 1的比例混合配制成基础缓冲液，再用 CgA抗原配制成不同浓度的标准品。
7、人血清中嗜铬粒蛋白A(CgA)的化学发光免疫分析(CLIA)方法实验操作程序如下
(1)将实验所需试剂及样本放置室温，平衡至少30分钟以上才可进行操作；
(2)取一块96孔微孔板进行编号，所有实验均做双孔重复；
(3)取各个浓度的标准品和样品50 μ 1加入相应编号的孔中；
(4)每孔均各加入50 μ 1酶标记抗体；
(5)充分混勻嗜铬粒蛋白A单克隆抗体包被的磁颗粒，每孔均各加入50 μ 1磁颗粒；
(6)充分混勻，室温振荡0. 5小时；
(7)将其放在磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液；
(8)去除磁板，每孔均各加入250 μ 1洗涤液；
(9)振荡5秒后，将其放在磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液；
(10)重复一遍步骤(8)、(9)；
(11)每孔各加入化学发光底物A工作液50 μ 1 ；
(12)每孔加各入化学发光底物B工作液50 μ 1 ；
(13)用化学发光仪测定每孔的发光强度；
(14)从标准曲线上读取样品的浓度。
实施例2
一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒的制备方法及实验操作程序
1.辣根过氧化物酶标记的嗜铬粒蛋白A单克隆抗体(简称酶标抗体)制备
①称取CgA单克隆抗体2. Omg放入5ml玻璃瓶内，加入1.5ml 0. 05mol/L, pH = 7. 5的碳酸钠缓冲液溶解，4°C储存备用；
②称取10. Omg的辣根过氧化物酶放入一只16 X IOOmm玻璃试管内，加入1.0ml 去离子水，振荡，待其完全溶解后，取出0.21ml放入另一只16X IOOmm玻璃试管内，加入 0. lmol/L的NaIO4溶液0. 2ml (NaIO4溶液必须新鲜配制)，用胶塞将玻璃试管口塞紧，室温下避光反应1. 5小时；
③将步骤①获得的液体与步骤②的获得的液体混合，室温下避光反应6小时；
④加入200 μ 1浓度为5mg/ml的NaBH4水溶液，室温下避光反应1. 5小时；
⑤用0. 02M PBS透析M小时，用HPLC 二次纯化，收集蛋白峰并于_20°C下冷冻保存；
2、嗜铬粒蛋白A单克隆抗体包被的磁颗粒的制备；
①取5mL磁颗粒质量含量为2. 5%的PBS溶液中，用磁板分离弃上清，用去离子水洗磁颗粒1次；
②用0. 02mol/L pH = 6. 2 的 PBS 洗 1 次；
③用0. 02mol/L pH = 6. 2 的 PBS 调整总体积为 8ml ；9
④加CgA单抗5mg放在摇床上进行勻化15分钟；
⑤加入碳二亚胺(EDAC) 8mg ；室温，放在摇床上进行勻化8小时；
⑥用0. lmol/L pH = 7. 4磷酸盐缓冲液洗涤2次；
⑦加入iTris 和 EDTA，使 iTris 的含量为 0. 05mol/L,使 EDTA 的含量为 0. 004mol/L, 调pH =7. 5，使抗体浓度为1. Omg/ml，2°C保存。
3、洗涤液的配制(同实施例1)
4、化学发光底物A工作液的配制
(1)配制 0. 05mol/L pH = 8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液；
(2)向IOOOml所述步骤(1)配制的Tris-HCl缓冲液中加入3mmol鲁米诺，混勻。
5.化学发光底物B工作液的配制
(1)配制 0. 05mol/L pH = 8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液；
(2)向IOOOml所述步骤(1)配制的Tris-HCl缓冲液中加入0. 5mmol四苯硼钠； 1. 42mmol铁氰化钾；0. 38mmol肉桂酸；7. 56mmol过氧化氢，混勻。
6、标准品的配制(同实施例1)
7、人血清中嗜铬粒蛋白A(CgA)的化学发光免疫分析(CLIA)方法的实验操作步骤
(1)将实验所需试剂及样本放置室温，平衡至少30分钟以上才可进行操作；
(2)取一块48孔微孔板进行编号，所有实验均做双孔重复；
(3)取各个浓度的标准品和样品50 μ 1加入相应编号的孔中；
(4)每孔均各加入50 μ 1酶标记抗体；
(5)充分混勻嗜铬粒蛋白A单克隆抗体包被的磁颗粒，每孔均各加入50 μ 1磁颗粒；
(6)充分混勻，室温振荡45分钟；
(7)将其放在磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液；
(8)去除磁板，每孔均各加入250 μ 1洗涤液；
(9)振荡8秒后，将其放在磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液；
(10)重复一遍步骤(8)、(9)；
(11)每孔各加入化学发光底物A工作液50 μ 1 ；
(12)每孔加各入化学发光底物B工作液50 μ 1 ；
(13)用化学发光仪测定每孔的发光强度；
(14)从标准曲线上读取样品的浓度。
实施例3
一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒的制备方法及实验操作程序
1.辣根过氧化物酶标记的嗜铬粒蛋白A单克隆抗体(简称酶标抗体)制备
①称取CgA单克隆抗体2. Omg放入5ml玻璃瓶内，加入2. Oml 0. 05mol/L, pH = 7. 5的碳酸钠缓冲液溶解，4°C储存备用；
②称取10. Omg的辣根过氧化物酶放入一只16 X IOOmm玻璃试管内，加入1.0ml 去离子水，振荡，待其完全溶解后，取出0. ^ml放入另一只16X IOOmm玻璃试管内，加入 0. lmol/L的NaIO4溶液0. 2ml (NaIO4溶液必须新鲜配制)，用胶塞将玻璃试管口塞紧，室温下避光反应2小时；
③将步骤①获得的液体与步骤②的获得的液体混合，室温下避光反应8小时；
④加入200 μ 1浓度为5mg/ml的NaBH4水溶液，室温下避光反应2小时；
⑤用0. 02M PBS透析12小时，用HPLC 二次纯化，收集蛋白峰并于_20°C下冷冻保存；
2、嗜铬粒蛋白A单克隆抗体包被的磁颗粒的制备；
①取5mL磁颗粒质量含量为2. 5%的PBS溶液中，用磁板分离弃上清，用去离子水洗磁颗粒1次；
②用0. 02mol/L pH = 6. 2 的 PBS 洗 1 次；
③用0. 02mol/L pH = 6. 2 的 PBS 调整总体积为 IOml ；
④加CgA单抗5mg放在摇床上进行勻化20分钟；
⑤加入碳二亚胺(EDAC) IOmg ；室温，放在摇床上进行勻化10小时；
⑥用0. lmol/L pH = 7. 4磷酸盐缓冲液洗涤2次；
⑦加入iTris 和 EDTA，使 iTris 的含量为 0. 05mol/L,使 EDTA 的含量为 0. 004mol/L, 调pH =7. 5，使抗体浓度为1. Omg/ml，3°C保存。
3、洗涤液的配制(同实施例1)
4.化学发光底物A工作液的配制
(1)配制 0. 05mol/L pH = 8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液；
(2)向IOOOml所述步骤(1)配制的Tris-HCl缓冲液中加入5mmol鲁米诺，混勻。
5.化学发光底物B工作液的配制
(1)配制 0. 05mol/L pH = 8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液；
(2)向IOOOml所述步骤(1)配制的Tris-HCl缓冲液中加入1. Ommol四苯硼钠； 1. 42mmol铁氰化钾；0. 38mmol肉桂酸；7. 56mmol过氧化氢，混勻。
6、标准品的配制(同实施例1)
7、人血清中嗜铬粒蛋白A(CgA)的化学发光免疫分析试剂盒的实验操作步骤
(1)将实验所需试剂及样本放置室温，平衡至少30分钟以上才可进行操作；
(2)取一块384孔微孔板进行编号，所有实验均做双孔重复；
(3)取各个浓度的标准品和样品100 μ 1加入相应编号的孔中；
(4)每孔均各加入50 μ 1酶标记抗体；
(5)充分混勻嗜铬粒蛋白A单克隆抗体包被的磁颗粒，每孔均各加入50 μ 1磁颗粒；
(6)充分混勻，室温振荡1小时；
(7)将其放在磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液；
(8)去除磁板，每孔均各加入250 μ 1洗涤液；
(9)振荡10秒后，将其放在磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液；
(10)重复一遍步骤(8)、(9)；
(11)每孔各加入化学发光底物A工作液50 μ 1 ；
(12)每孔加各入化学发光底物B工作液50 μ 1 ；
(13)用化学发光仪测定每孔的发光强度；
(14)从标准曲线上读取样品的浓度。
本方法检测灵敏度可达0. 8U/mL,无明显交叉反应，准确度95-105 %，标准曲线满足临床标本所需的测量范围为0. 8 800U/mL。
本试剂盒各项技术指标分析
本试剂盒检测灵敏度可达0.8U/mL，与类似物无明显交叉反应，准确度可达 95-105%，标准曲线满足临床标本所需的测量范围为0. 8 800U/mL。
我们用本试剂盒分别对一批经医院确诊的胰腺癌、嗜铬细胞癌病人血清标本及正常人血清标本进行了测定试验，结果如下
权利要求
1.一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒，其特征是包括如下组分1)嗜铬粒蛋白A标准品；2)辣根过氧化物酶标记的嗜铬粒蛋白A单克隆抗体；3)嗜铬粒蛋白A单克隆抗体包被的磁颗粒；4)白色不透明微孔板；5)洗涤液；6)化学发光底物A及B工作液。
2.根据权利要求1所述的一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒，其特征是所述辣根过氧化物酶标记的嗜铬粒蛋白A单克隆抗体是用下述方法制成①称取CgA单克隆抗体2.Omg，加入1 2ml浓度为0. 05mol/L,pH = 7. 5的碳酸盐缓冲液溶解，4°C储存备用；②称取10.Omg的辣根过氧化物酶，加入1. Oml去离子水，振荡，溶解后，取出0. 14 0. 2&iil，加入0. lmol/L的NaIO4溶液0. 2ml，室温下避光反应1 2小时；③将步骤①获得的液体与步骤②的获得的液体混合，室温下避光反应4 8小时；④加入200μ 1浓度为5mg/ml的NaBH4水溶液，室温下避光反应1 2小时；⑤用0.02M PBS透析12-24小时，用HPLC 二次纯化，收集蛋白峰并于_20°C下冷冻保存。
3.根据权利要求1所述的一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒，其特征是所述嗜铬粒蛋白A单克隆抗体包被的磁颗粒是用下述方法制成①取5mL磁颗粒质量含量为2.5%的PBS溶液，用磁板分离弃上清，用去离子水洗磁颗粒；②用0.02mol/L pH = 6. 2的PBS洗磁颗粒；③用0.02mol/L pH = 6. 2的PBS调整总体积为5 IOml ；④加CgA单抗5mg放在摇床上进行勻化10 20分钟；⑤加入碳二亚胺5 IOmg；室温，放在摇床上进行勻化5 10小时；⑥用0.lmol/L pH = 7. 4的磷酸盐缓冲液洗涤2次；⑦加入iTris和EDTA，使iTris的含量为0.05mol/L,使EDTA的含量为0. 004mol/L,调 PH = 7. 5，使抗体浓度为1. 0mg/ml，2-4°C保存。
4.根据权利要求1所述的一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒，其特征是所述洗涤液的配制取三羟甲基氨基甲烷6. 05g ；NaC18. 55g ；Tween-20 0. 5ml ；加水至IL ；用HCl调pH至 7. 5 士 0. 1。
5.根据权利要求1所述的一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒，其特征是所述化学发光底物A工作液是用下述方法制成(1)配制0. 05mol/L pH = 8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液；(2)向IOOOml所述步骤(1)配制的Tris-HCl缓冲液中加入3 5mmol鲁米诺，混勻； 让所述化学发光底物B工作液是用下述方法制成(1)配制0. 05mol/L pH = 8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液；(2)向IOOOml所述步骤(1)配制的Tris-HCl缓冲液中加入0.5 1. Ommol四苯硼钠；1. 42mmol铁氰化钾；0. 38mmol肉桂酸；7. 56mmol过氧化氢，混勻。
6.权利要求1的一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征是包括如下步骤1)准备嗜铬粒蛋白A标准品；2)制备辣根过氧化物酶标记的嗜铬粒蛋白A单克隆抗体；3)制备嗜铬粒蛋白A单克隆抗体包被的磁颗粒；4)准备白色不透明微孔板；5)制备洗涤液；6)制备化学发光底物A及B工作液。
7.根据权利要求6所述的一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征是所述制备辣根过氧化物酶标记的嗜铬粒蛋白A单克隆抗体的步骤是①称取CgA单克隆抗体2.Omg，加入1 2ml浓度为0. 05mol/L,pH = 7. 5的碳酸盐缓冲液溶解，4°C储存备用；②称取10.Omg的辣根过氧化物酶，加入1. Oml去离子水，振荡，溶解后，取出0. 14 0. 2&iil，加入0. lmol/L的NaIO4溶液0. 2ml，室温下避光反应1 2小时；③将步骤①获得的液体与步骤②的获得的液体混合，室温下避光反应4 8小时；④加入200μ 1浓度为5mg/ml的NaBH4水溶液，室温下避光反应1 2小时；⑤用0.02M PBS透析12-24小时，用HPLC 二次纯化，收集蛋白峰并于_20°C下冷冻保存。
8.根据权利要求6所述的一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征是所述制备嗜铬粒蛋白A单克隆抗体包被的磁颗粒的步骤是①取5mL磁颗粒质量含量为2.5%的PBS溶液，用磁板分离弃上清，用去离子水洗磁颗粒；②用0.02mol/L pH = 6. 2的PBS洗磁颗粒；③用0.02mol/L pH = 6. 2的PBS调整总体积为5 IOml ；④加CgA单抗5mg放在摇床上进行勻化10 20分钟；⑤加入碳二亚胺5 IOmg；室温，放在摇床上进行勻化5 10小时；⑥用0.lmol/L pH = 7. 4的磷酸盐缓冲液洗涤2次；⑦加入Tris和EDTA，使iTris的含量为0.05mol/L,使EDTA的含量为0. 004mol/L,调 PH = 7. 5，使抗体浓度为1. 0mg/ml，2-4°C保存。
9.根据权利要求6所述的一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征制备所述洗涤液的步骤是取三羟甲基氨基甲烷6. 05g ;NaC18. 55g ;Tween-20 0.5ml ；加水至IL ；用HCl调pH至 7. 5 士 0. 1。
10.根据权利要求6所述的一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征是所述制备化学发光底物A工作液的步骤是(1)配制0. 05mol/L pH = 8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液；(2)向IOOOml所述步骤(1)配制的Tris-HCl缓冲液中加入3 5mmol鲁米诺，混勻； 所述制备化学发光底物B工作液的步骤是(1)配制0. 05mol/L pH = 8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液；(2)向IOOOml所述步骤(1)配制的Tris-HCl缓冲液中加入0.5 1. Ommol四苯硼钠；1. 42mmol铁氰化钾；0. 38mmol肉桂酸；7. 56mmol过氧化氢，混勻。
全文摘要
本发明公开了一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括如下组分1)嗜铬粒蛋白A标准品；2)辣根过氧化物酶标记的嗜铬粒蛋白A单克隆抗体；3)嗜铬粒蛋白A单克隆抗体包被的磁颗粒；4)白色不透明微孔板；5)洗涤液；6)化学发光底物A及B工作液。本发明将化学发光免疫分析与纳米磁颗粒技术相结合，提供一种嗜铬粒蛋白A化学发光免疫分析试剂盒。本方法既克服了传统ELISA方法灵敏度低、准确度较差的缺点，又没有RIA技术的放射性污染，具有安全环保、特异性强、灵敏度及准确度高等优点。
文档编号G01N33/68GK102520195SQ201110455048
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者单存海, 潘学继, 王立凯 申请人:天津市协和医药科技集团有限公司
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