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专利名称：同型半胱氨酸诊断试剂盒及同型半胱氨酸浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种同型半胱氨酸诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定同型半胱 氨酸浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
测定血浆中同型半胱氨酸浓度的方法有很多种，包括高效液相色谱法
(HPLC)、氨基酸分析仪测定法、离子色谱法、酶联免疫分析法(EIA)、毛细管 气相色谱-质谱，荧光偏振免疫分析(FPIA)、电化学法及酶法等。
高效液相色谱法(HPLC):是经典的参考方法，但其操作比较复杂，试验耗 时比较长，试验数据变异比较大，在临床应用方面逐渐被酶联免疫分析法、荧光 偏振分析法和酶法所取代。高效液相色谱法先使用还原剂使血样中所有形式的 同型半胱氨酸转变成还原形式，然后与荧光剂进行衍生生成同型半胱氨酸-荧光 物质复合物，将衍生后的样品进行色谱分析。因色谱固定相对不同物质的吸附力 不同，因此流动相将其洗脱下来的次序也不同，根据这一原理将样品中的不同物 质分开，以荧光检测器检测洗脱下同型半胱氨酸-荧光物质复合物的荧光强度， 将其与标准品/内标的比值进行比较和计算，就可以测定血总同型半胱氨酸的水 平。
酶联免疫分析法(EIA):是临床上测定同型半胱氨酸水平的常用方法，操作
比较方便、快捷，重复性好，方法稳定可靠。其缺点是大部分操作还是手工操作，
比较耗时。酶联免疫分析法基本分析原理先使用酶将血样中所有形式的同型半 胱氨酸转变成S-腺苷-L-同型半胱氨酸，然后加入酶标的抗S-腺苷-L-同型半胱氨 酸的单克隆或多克隆抗体，采用竞争结合的原理，将不同水平的标准品与酶标抗 体竞争结合，然后以显色试剂和终止试剂分别进行显色和终止，制作出同型半胱 氨酸浓度与发色强度的标准曲线。样品也按相同步骤处理，在标准曲线上就可以 查出其同型半胱氨酸的浓度。离子色谱法主要用于实验研究，临床上较少使用，其基本分析原理是色谱 分析的一种，主要是其固定相采用离子交换物质，根据其对不同离子的吸附力不 同可将同型半胱氨酸与其它物质分开进行测定。
毛细电泳法主要用于实验研究，有在临床使用的报道。其特点与高效液相 色谱方法相似，其操作比较复杂、试验耗时较长和试验数据变异比较大的缺点。 基本分析原理先使用还原剂使血样中所有形式的同型半胱氨酸转变成还原形 式，然后与荧光试剂进行衍生生成同型半胱氨酸-荧光物质复合物，将衍生后的 样品进行毛细电泳分析。将样品放置于IO千伏左右的高压电场中，因为各种物 质所带电荷不同，其等电点也不相同，因此其在电场中的迁移速度也就不同，根 据这一原理可将同型半胱氨酸与样品中的其它物质分开，再以荧光检测器检测同 型半胱氨酸-荧光物质复合物的荧光强度，将其与标准品/内标的比值进行比较和 计算，就可以测定总同型半胱氨酸的水平。
荧光偏振法是临床上测定同型半胱氨酸水平的比较好的方法，该方法完全 自动化仪器分析，具有快速、准确、方便的优点。其基本分析原理样品中游离 同型半胱氨酸和抗单克隆抗体相结合的同型半胱氨酸的荧光偏振强度不同，将样 品、标准品与标抗体竞争结合，采用竞争结合的原理制作出同型半胱氨酸浓度与 荧光偏振强度的标准曲线，在标准曲线上就可以查出其同型半胱氨酸的浓度。
酶法因应市场需求而新开发出来的测试方法，目前国内有多项专利申请， CN98807531.8利用同型半胱氨酸酶来测量样品中同型半胱氨酸含量； CN200410016789.6利用同型半胱氨酸转甲基酶(E.C.2丄1.10)及腺苷同型半胱 氨酸酶(E.C.3.3丄1)的循环扩增作用，再加上腺苷脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黄 嘌呤氧化酶、过氧化物酶等，或腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶等显色反应测定同型 半胱氨酸含量；CN200510053210.8利用L-蛋氨酸Y-裂解酶作用于同型半胱氨酸 使之产生硫化氢后再与莹光化合物DMPD2HC1作用产生荧光，该方法使用全自 动荧光分析仪测试，具有快速、准确、方便的优点。其基本分析原理用基因重 组酶将同型半胱氨酸分解，所形成之硫化氢产物再与荧光显色剂发生化学反应形 成可测量的荧光化合物。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用间接鹏循环扩增法(Indirect Enzymatic Recycling Method)、酶比色 去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶 联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye) 或醌亚胺色原(Quioneiminedye)所导致在400—700nm波长处吸光度的上升， 得以测定同型半胱氨酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的同 型半胱氨酸诊断试剂盒，采用该试剂不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化 分析仪上进行同型半胱氨酸浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高， 因而可以得到切实的推广应用。
本发明同型半胱氨酸浓度测定方法原理如下
同型半胱氨酸+水同型半胱氨酸-oc,Y-裂解酶硫化氢+氨+
a-氧代丁酸
氨+ 2-酮戊二酸+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水 谷氨酸+氧+水谷氨酸氧化酶氨+ 2-酮戊二酸+过氧化氢 过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或
醌亚胺色原+水
这个方法应用同型半胱氨酸-a,Y -裂解酶(homocysteine desulfhydrase; EC 4.4.1.2)(偶)联谷氨酸脱氢酶(GlutamateDehydrogenase; EC 1.4.1.2; EC 1.4.1.3; EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Gkitamate oxidase; EC 1.4.3.7; EC 1.4.3.11)及过 氧化物酶(peroxidase ; EC 1.11丄7)酶促反应速率比色法。同型半胱氨酸-a，Y-裂解酶作为作用酶，功能为将同型半胱氨酸酶解产生氨。谷氨酸脱氢酶也作为作 用酶，谷氨酸脱氢酶的酶促作用使氨产生谷氨酸；谷氨酸氧化酶作为循环酶谷 氨酸氧化酶再将谷氨酸再次变回氨，使由同型半胱氨酸产生的氨不断地被重复循 环利用，因此连续不断地产生过氧化氢。过氧化物酶(peroxidase ; EC 1.11丄7) 作为显色酶，通过和过氧化氢的作用，使无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400—700nm (根据还原型色原体组合 的不同而定)波长处测定染料一吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原 (Quioneiminedye)—含量高低的光吸收大小速度，得出同型半胱氨酸浓度大小 测定结果。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下 成分关系的本发明同型半胱氨酸诊断试剂盒较为理想
缓冲液 稳定剂 过氧化物酶
同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶
谷氨酸氧化酶 2-酮戊二酸 还原型辅酶 还原型色原体组合
0.1
10Ommol/L 500 mmol/L 30000 U/L 10000U/L 12000 U/L 12000U/L 5 mmol/L 1 mmol/L ~~20 mmol/L
所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配对 组合
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
>^-乙基^>^ (3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-双氯石碳酸
;_甲基-2-苯噻唑酮腙2,4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3- 甲基-乙基-羥基苯胺
4- 氨基抗砒 石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒
N，N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2.4- 双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2,4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3.5- 双氯石碳酸磺酸
-m-甲苯胺钠盐
-m-甲苯胺4-氨基抗砒
3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒
2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
本发明的同型半胱氨酸诊断试剂盒可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸-Ot，Y -裂解酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、 2-酮戊二酸、还原型辅酶、过氧化物酶、还原型色原体组合。试剂盒可以是干粉 状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、2-酮戊二酸、还原型辅酶。 试剂2
缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合、同型半胱氨酸-a,Y -裂解酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶。 过氧化物酶、还原型色原体组合、同型半胱氨酸-a，y-裂解酶、谷氨酸脱氢酶、 谷氨酸氧化酶、2-酮戊二酸、还原型辅酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直
接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、2-酮戊二酸、还原型辅酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、过 氧化物酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶。 过氧化物酶、还原型色原体组合、同型半胱氨酸-aj-裂解酶、谷氨酸脱氢酶、 谷氨酸氧化酶、2-酮戊二酸、还原型辅酶在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可 以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的同型半胱氨酸诊断试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
同型半胱氨酸-a，Y -裂解酶 10000 U/L
谷氨酸脱氢酶 12000 U/L
谷氨酸氧化酶 12000 U/L
2-酮戊二酸 5 mmol/L还原型辅酶 过氧化物酶 4-氨基抗砒 石碳酸
1 mmol/L 30000 U/L
2 mmol/L 10 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，测试主波长 505nm，测试副波长600nm，被测同型半胱氨酸样品与试剂的体积比例为1/25， 反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右， 检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长505rnn吸光度上升的速度，从而测算出同型半胱氨酸的浓度大小。 实施例二
本实施例的同型半胱氨酸诊断试剂为双试剂，包括 试剂l
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 2-酮戊二酸 还原型辅酶
2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂
同型半胱氨酸-a,Y-裂解酶
腦mmol/L 50 mmol/L 5 mmol/L 1 mmol/L 0.2 mmol/L
兩mmol/L 500 mmol/L 10000 U/L
13谷氨酸氧化酶
过氧化物酶
4-氨基抗砒
12000 U/L 12000 U/L 30000 U/L 0.6 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37°C,反应时间10分钟，测试主波长
546nm，测试副波长600nm，被测同型半胱氨酸样品与试剂的体积比例为1/20，
反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，
检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，
检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出同型半胱氨酸的浓度大小。
实施例三
本实施例的同型半胱氨酸诊断试剂为三试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
2- 酮戊二酸 还原型辅酶
3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
谷氨酸脱氢酶 谷氨酸氧化酶
100 mmol/L 50 mmol/L 5 mmol/L 1 mmol/L 0.6 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L
12000U/L
12000U/L过氧化物酶 30000 U/L
双甲基苯胺 2mmol/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
同型半胱氨酸-ot，Y -裂解酶 10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，测试主波长 578nm，测试副波长660nm，被测同型半胱氨酸样品与试剂的体积比例为1/30， 反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约l分钟左右， 检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出同型半胱氨酸的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组 合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例 举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得 出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0007;吸光度时间 反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达0.7 mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5%;试剂测试的精密度(重 复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.6 ± 0.3 AA/mmol/L; 试剂在2—8'C下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好， 线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。
权利要求
1.一种间接酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的同型半胱氨酸浓度测定方法，其方法原理如下同型半胱氨酸+水 同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶 硫化氢+氨+ α-氧代丁酸氨+2-酮戊二酸+还原型辅酶 谷氨酸脱氢酶 谷氨酸+辅酶+水谷氨酸+氧+水 谷氨酸氧化酶 氨+2-酮戊二酸+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合 过氧化物酶 吲嗒胺色原或 醌亚胺色原+水将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度，得出同型半胱氨酸浓度大小测定结果。
2. —种同型半胱氨酸诊断试剂盒，主要成分包括缓冲液 稳定剂 过氧化物酶同型半胱氨酸-ot，Y-裂解酶20--500 mmol/L 1--4000 mmol/L谷氨酸氧化酶 2-酮戊二酸 还原型辅酶 还原型色原体组合500——80000 U/L 1000——80000 U/L 1000——80000 U/L 1000——80000 U/L1- 5Ommol/L1- 5Ommol/L0.1-20mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围 外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述同型半胱氨酸诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸-aj-裂解酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化 酶、2-酮戊二酸、还原型辅酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述同型半胱氨酸诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸-oc,Y-裂解酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化 酶、2-酮戊二酸、还原型辅酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成双剂试剂； 试剂l，由缓冲液、稳定剂、2-酮戊二酸、还原型辅酶、还原型色原体组合组 成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸-a，Y-裂解酶、谷氨酸脱氢酶、 谷氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成。过氧化物酶、还原型 色原体组合、同型半胱氨酸-a，Y-裂解酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、2-酮戊二酸、还原型辅酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述同型半胱氨酸诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸-a，Y-裂解酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化 酶、2-酮戊二酸、还原型辅酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成多剂试 剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、2-酮戊二酸、还原型辅酶、还原型色原体组 合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、过氧 化物酶、还原型色原体组合组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、同型半胱氨 酸-aj-裂解酶组成。过氧化物酶、还原型色原体组合同型半胱氨酸-a，Y-裂 解酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、2-酮戊二酸、还原型辅酶在试剂l、试 剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述同型半胱氨酸诊断试剂盒，其特征在于还包括稳定剂 14000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
7.根据权利要求2所述同型半胱氨酸诊断试剂盒，其特征在于所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个配对组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基一-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙(2.4- 双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5- 双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-齊基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-徑基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N,N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒(2.4- 双氯石碳酸4-氨基抗砒(2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒 3，5-双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒(3.5- 双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-齊基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒(2,2'-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 4-氨基抗砒3-甲基-乙基-羥基苯胺 。
全文摘要
本发明涉及一种利用间接酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的同型半胱氨酸诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定同型半胱氨酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、2-酮戊二酸、还原型辅酶、同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出同型半胱氨酸浓度的大小。
文档编号G01N21/31GK101609018SQ20081012283
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月19日 优先权日2008年6月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司