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专利名称：活化嗜中性粒细胞的检测方法及装置的制作方法
活化嗜中性粒细胞的检测方法及装置
技术领域：
本发明涉及检测活体样品中的活化嗜中性粒细胞的方法及装置。
背景技术：
正常的白细胞,通常被分类为:包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞的颗粒细胞、以及淋巴细胞及单核细胞。在它们之中，嗜中性粒细胞占白细胞的50 60%，在对细菌、真菌等的病原微生物的活体防御中发挥重要的作用。例如，由细菌感染等而在活体中侵入异物之时，嗜中性粒细胞由于由活体的炎症反应等所致的刺激而被活化，迁移到感染部位而吞食异物。被嗜中性粒细胞吞食的异物被作为在嗜中性粒细胞内产生的各种的分解酶及强力的毒性物质的活性氧种(ROS)而被杀菌。在另一方面，由刺激而活化的嗜中性粒细胞(以下，也称之为“活化嗜中性粒细胞”)有在活体内伤害正常组织的情况。例如，由活化嗜中性粒细胞产生的过量的ROS已知在缺血再灌流障碍、自身免疫疾病等的炎症反应中，伤害活体的自身组织。由活化嗜中性粒细胞产生的ROS已知与急性呼吸穹迫综合征、溃疡性大肠炎、急性胃粘液膜病变等的病变形成相关。输血关联急性肺障碍也已知与活化嗜中性粒细胞相关。如此，由于活化嗜中性粒细胞与各种的疾病及障碍相关，在血液检查中，不仅是白细胞的分类计数，也通过检测活化嗜中性粒细胞，可得对于疾病的诊断、病态的掌握、治疗监测等极其有用的信息。近年，在临床检查的领域中，待测样品中的白细胞的分类计数通过应用流式细胞术的原理的自动血细胞计数装置进行。另外，用于通过那样的装置的测定的血细胞分类用试剂也在市售。使用此试剂将待测样品用自动血细胞计数装置测定，则检测的各血细胞的信号在各散点图上的指定的区域出现。使用如上述一样的试剂对白细胞进行分类计数的方法在所述技术中有所耳闻。例如，在日本专利第4248017号公报中公开了使用包含将RNA特异性地染色的染色液，和含阳离子性表面活性剂及非离子性表面活性剂的溶血剂的组合的试剂盒对异常白细胞和正常白细胞二者进行分类计数的方法。另外，在美国专利申请第2009/0023129号及美国专利申请第2011/0027788号中公开了使用含有含指定的荧光染料的染色液和含阳离子性表面活性剂及/或非离子性表面活性剂的溶血剂的试剂而将白细胞分类为4种或5种的计数方法。但是,这些的专利文献之任何中均未公开对活化嗜中性粒细胞的检测。作为测定可含活化嗜中性粒细胞的待测样品的例，可举出J.Linssen等的文献(J.Linssen等，Cytometry Part B(ClinicalCytometry), 74B, 295-309(2008))。J.Linssen等报告，以由刺激物质活化处理的全血作为待测样品而在自动血细胞计数装置XE-2100(Sysmex株式会社制)进行测定,贝U在白细胞分类一计数通道(DIFF_channel)中，作为嗜中性粒细胞分类的集团的平均侧方散射光强度 (NEUT-X)及平均荧光强度(NEUT-Y)比未处理的待测样品降低。发明概述
本发明的范围仅由随附的权利要求定义，且不以任何方式受此发明概述部分的影响。本发明的目的是提供可分类计数正常白细胞，并且可检测活化嗜中性粒细胞的活化嗜中性粒细胞的检测方法及装置。本发明人，对被活化刺激，并且产生活性氧种的嗜中性粒细胞，在使用自动血细胞计数装置的测定中，检查了其信号如何变化。结果，令人惊讶地发现，与上述的J. Linssen等的报告不同，产生活性氧种的嗜中性粒细胞在含嗜中性粒细胞的集团和含嗜酸性粒细胞的集团之间存在，再者，其荧光强度在通常的嗜中性粒细胞以下、并且散射光强度相比通常的嗜中性粒细胞更高，即散射光强度在通常的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞之间，从而完成本发明。从而，本发明提供以下的活化嗜中性粒细胞的检测方法及检测装置。(I)活化嗜中性粒细胞的检测方法，其包括(a)制备活体样品中的红细胞被溶血，白细胞的核酸被核酸染色性的荧光染料染色的测定样品，(b)向制备的测定样品照射光，测定从该样品中的粒子发生的散射光强度及荧光强度，(C)基于取得的散射光强度及荧光强度，将活体样品中的白细胞分类为至少含嗜中性粒细胞的集团和含嗜酸性粒细胞的集团，(d)将在含嗜中性粒细胞的集团和含嗜酸性粒细胞的集团之间存在的粒子检测为活化嗜中性粒细胞。(2) (I)所述的方法，其中在(d)中，将荧光强度在含嗜中性粒细胞的集团以下、并且散射光强度在含嗜中性粒细胞的集团和含嗜酸性粒细胞的集团之间的粒子检测为活化嗜中性粒细胞。(3) (I)或(2)所述的方法，其中 含嗜中性粒细胞的集团再含嗜碱性粒细胞。(4) (I)或(2)所述的方法，其中活化嗜中性粒细胞在细胞质中发生空胞变性。(5) (I)或(2)所述的方法，其中在(d)中，对在含嗜中性粒细胞的集团和含嗜酸性粒细胞的集团之间存在的粒子进行计数。(6) (5)所述的方法，其中在(d)中，当计数的值比指定的值更大时，将粒子检测为活化嗜中性粒细胞。(7) (I)或(2)所述的方法，其中测定样品中的红细胞被表面活性剂溶血。(8) (7)所述的方法，其中表面活性剂是选自下列的至少一种非离子性表面活性剂及阳离子性表面活性剂。(9) (I)或(2)所述的方法，其中散射光强度是侧方散射光强度。
( 10)活化嗜中性粒细胞的检测装置，其包括:将活体样品，用于对核酸进行染色的荧光染料，以及含有用于对红细胞进行溶血，给白细胞的细胞膜可透过荧光染料的程度的损伤的表面活性剂的溶血剂混合而制备测定样品的样品制备部; 向制备的测定样品照射光，测定从该样品中的粒子发生的散射光强度及荧光强度的测定部 '及用于实施操作的控制部，其包含:(a)基于取得的散射光强度及荧光强度，将活体样品中的白细胞分类为至少含嗜中性粒细胞的集团和含嗜酸性粒细胞的集团；及(b)将在含嗜中性粒细胞的集团和含嗜酸性粒细胞的集团之间存在的粒子检测为活化嗜中性粒细胞。由上述的(I)及(10)，使对活体样品中的正常白细胞进行分类计数，并且检测活化嗜中性粒细胞变得可能。另外，由上述的(2)，可更确实地检测活化嗜中性粒细胞。再者，由上述的(5)及(6)，可防活化嗜中性粒细胞的误检测。再者，由上述的(7)及(8)，由于红细胞被确实地溶血，可以更好的精度进行正常白细胞的分类系数及活化嗜中性粒细胞的检测。

图1是将正常的白细胞由流式细胞仪测定之时的散点图。图2是示本发明的测定装置之外观的图。图3是测定部的功能框图。图4是检测部的构成图。图5是示将测定样品用检测部测定的流的图。图6是数据处理部的功能框图。图7是数据处理部的处理的流程图。图8是示由数据处理部表示的结果表示画面之一例的图。图9是示由数据处理部表示的结果表示画面的变形例的图。图10是由实施例1的测定得到的散点图。图11是示参考例I的结果的显微镜照片。图12是示参考例2的结果的电子显微镜照片。图13是由实施例2的测定得到的散点图。发明详述以下参照附图描述本发明的优选的实施方式。在本发明的实施方式中，活体样品只要是含白细胞的体液样品，就不特别限定，可举出例如，从哺乳动物、优选人采集的血液、骨髓液、尿、成分输血等采集的样品等。活体样品为有含活化嗜中性粒细胞的可能性的样品也可。在本说明书中，“活化嗜中性粒细胞”所指的用语是指由刺激活化的嗜中性粒细胞，作为示与正常的白细胞中含的通常的(未刺激的)嗜中性粒细胞可区别的血细胞的词语被使用。
在本发明的实施方式中，作为活化嗜中性粒细胞，可举出例如，产生活性氧种(ROS)的嗜中性粒细胞。在所述技术中，作为由活化嗜中性粒细胞产生的R0S，已知超氧化
物、羟基自由基、过氧化氢、单态氧等。另外，已知在吞食异物的活化嗜中性粒细胞中，异物进入吞食空胞，然后，含分解酶及ROS的颗粒融合到此空胞而形成吞噬溶酶体，在形态学观察中，确认在活化嗜中性粒细胞的细胞质空胞变性。从而，在本发明的实施方式中，在细胞质中发生空胞变性的嗜中性粒细胞也包括在活化嗜中性粒细胞中。活化嗜中性粒细胞的检测方法
接下来，说明本发明的活化嗜中性粒细胞的检测方法(以下，也简单称之为“检测方法”)。在本发明的检测方法中，首先，制备活体样品中的红细胞被溶血，白细胞的核酸被核酸染色性的荧光染料染色的测定样品(制备步骤)。具体而言，将活体样品，用于对核酸进行染色的荧光染料，以及含有用于对红细胞进行溶血，给白细胞的细胞膜可透过荧光染料的程度的损伤的表面活性剂的溶血剂混合而制备测定样品。在此制备步骤中，由上述的溶血剂的作用而导致活体样品中含的红细胞被快速溶血，并且给白细胞的细胞膜可透过荧光染料的程度的损伤。然后，通过上述的荧光染料进入受损伤的白细胞的细胞膜，白细胞的核酸被染色。活体样品中存在活化嗜中性粒细胞时，活化嗜中性粒细胞的核酸也被染色。荧光染料本发明的检测方法中使用的荧`光染料只要是可染色核酸的荧光染料，就不特别限定，可根据从光源照射来的光的波长而适宜选择。作为那样的荧光染料，可举出例如，碘化丙锭、溴化乙锭、乙锭-吖啶异源二聚体、二叠氮化乙锭、乙锭同源二聚体-1、乙锭同源二聚体-2、单叠氮化乙锭、三亚甲基双[[3-[[4-[[(3_甲基苯并噻唑-3-鎗)-2-基]亚甲基]-1，4-二氢喹啉]-1-基]丙基]二甲基铵].四碘化物(Τ0Τ0-1)、4-[(3-甲基苯并噻唑-2 (3Η)-亚基)甲基]-1-[3-(三甲基铵基)丙基]氢喹啉鎗.二碘化物(T0-PR0-1),N, N，N’，Ν’ -四甲基-Ν，Ν’ -双[3-[4-[3-[(3-甲基苯并噻唑_3_鎗)_2_基]-2-亚丙基]-1，4-二氢喹啉-1-基]丙基]-1，3-丙烷二铵一四碘化物(Τ0Τ0-3)、或者2-[3-[[1-[3-(三甲基铵基)丙基]-1，4- 二氢喹啉]-4-亚基]-1-丙烯基]-3-甲基苯并噻唑-3-鎗.二碘化物(T0-PR0-3)及以下的式(I)所表示的荧光染料。在它们之中，也优选式(I)所表示的荧光染料。化I
K2 -
f^TfZ\_/=\
(I)
K f上述的式(I)中，R1及R4相同或不同，是氢原子、烷基、有羟基的烷基链、有醚基的烷基链、有酯基的烷基链、或者有取代基也可的苄基；R2及R3相同或不同，是氢原子、羟基、齒素、烧基、稀基、块基、烧氧基、烧基横酸基或苯基；z是硫原子、氧原子、或者有甲基的碳原子；11是0、1、2或3 ;X_是阴离子。在本发明的实施方式中，烷基是直链状或支链状之任何也可。在本发明的实施方式中，上述的式(I)中，R1及R4之任何一方是碳原子数6 18的烷基之时，另一方面是氢原子或碳原子数不足6的烷基是优选的。在碳原子数6 18的烷基之中，碳原子数是6、8或10的烷基是优选的。在本发明的实施方式中，上述的式(I)中，作为R1及R4的苄基的取代基，可举出例如，碳原子数I 20的烷基、碳原子数2 20的烯基或碳原子数2 20的炔基。在它们之中，甲基或乙基是特别优选的。在本发明的实施方式中，上述的式(I)中，作为R2及R3的烯基，可举出例如碳原子数2 20的烯基。另外，作为R2及R3的烷氧基，可举出碳原子数I 20的烷氧基。在它们之中，特别是甲氧基或乙氧基是优选的。在本发明的实施方式中，上述的式(I)中，作为阴离子Γ，可举出如F' Cl' 及
I一样的齒素尚子、CF3SO3、BF4等。在本发明的实施方式中，制备步骤中使用的荧光染料是I种也可，2种以上也可。在本发明的实施方式中，用于对核酸进行染色的荧光染料为溶液的形态也可。用于溶解荧光染料的溶剂不特别限定，但可举出例如，水、有机溶剂及这些的混合物。作为有机溶剂，可举出例如醇、乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)等。荧光染料有在水溶液中的保存稳定性差的情况，因此溶解在有机溶剂中是优选的。在制备步骤中，在使用荧光染料的溶液之时，荧光染料的浓度可适宜设定，但通常是0.01 lOOyg/L、优选是0.1 lOyg/L。例如，作为荧光染料使用上述的式(I)所表示的荧光染料之时，在该溶液中荧光染料的浓度优选是0.2 0.6 μ g/L，更优选是0.3
0.5 μ g/L。在本发明的实施方 式中，作为荧光染料，使用市售的白细胞测定用的染色试剂也可。作为那样的染色试剂，可举出例如^卜■^卜9 4吁一 4DS (Sysmex株式会社)。^卜^卜9 4〒一 4DS是含上述的式(I)所示的荧光染料的染色试剂。溶血剂本发明的检测方法中使用的溶血剂含用于对红细胞进行溶血，给白细胞的细胞膜可透过上述的荧光染料的程度的损伤的表面活性剂。作为那样的表面活性剂，可举出阳离子性表面活性剂及非离子性表面活性剂。在本发明的实施方式中，作为阳离子性表面活性剂，可举出季铵盐型表面活性剂及吡啶鎗盐型表面活性剂。作为季铵盐型表面活性剂，例如以下的式(II)所表示的，全碳原子数是9 30的表面活性剂被适宜地使用。化2
权利要求
1.活化嗜中性粒细胞的检测方法，其包括:Ca)制备活体样品中的红细胞被溶血，白细胞的核酸被核酸染色性的荧光染料染色的测定样品，(b)向制备的测定样品照射光，测定从该样品中的粒子发生的散射光强度及荧光强度，(C)基于取得的散射光强度及荧光强度，将上述活体样品中的白细胞分类为至少含嗜中性粒细胞的集团和含嗜酸性粒细胞的集团，(d)将在上述含嗜中性粒细胞的集团和上述含嗜酸性粒细胞的集团之间存在的粒子检测为活化嗜中性粒细胞。
2.权利要求1所 述的方法，其中在上述(d)中，将荧光强度在上述含嗜中性粒细胞的集团以下、并且散射光强度在上述含嗜中性粒细胞的集团和上述含嗜酸性粒细胞的集团之间的粒子检测为上述活化嗜中性粒细胞。
3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中上述含嗜中性粒细胞的集团再含嗜碱性粒细胞。
4.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中上述活化嗜中性粒细胞在细胞质中发生空胞变性。
5.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在上述(d)中，对在上述含嗜中性粒细胞的集团和上述含嗜酸性粒细胞的集团之间存在的粒子进行计数。
6.权利要求5所述的方法，其中在上述(d)中，当上述计数的值比指定的值更大时，将上述粒子检测为活化嗜中性粒细胞。
7.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中上述测定样品中的红细胞被表面活性剂溶血。
8.权利要求7所述的方法，其中上述表面活性剂是选自下列的至少一种:非离子性表面活性剂及阳离子性表面活性剂。
9.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中上述散射光强度是侧方散射光强度。
10.活化嗜中性粒细胞的检测装置，其包括:将下列物质混合而制备测定样品的样品制备部:活体样品，用于对核酸进行染色的荧光染料，以及含有用于对红细胞进行溶血，给白细胞的细胞膜可透过上述荧光染料的程度的损伤的表面活性剂的溶血剂；向制备的测定样品照射光，测定从该样品中的粒子发生的散射光强度及荧光强度的测定部；及用于实施操作的控制部，其包含:(a)基于取得的散射光强度及荧光强度，将上述活体样品中的白细胞分类为至少含嗜中性粒细胞的集团和含嗜酸性粒细胞的集团；及(b)将在上述含嗜中性粒细胞的集团和上述含嗜酸性粒细胞的集团之间存在的粒子检测为活化嗜中性粒 细胞。
全文摘要
活化嗜中性粒细胞的检测方法及装置为了提供使正常白细胞的分类及活化嗜中性粒细胞的检测成为可能的活化嗜中性粒细胞的检测方法，制备活体样品中的红细胞被溶血，白细胞的核酸被核酸染色性的荧光染料染色的测定样品，向此样品照射光，基于测定从该样品中的粒子发生的散射光强度及荧光强度而得到的散射光强度及荧光强度，将上述活体样品中的白细胞分类为至少含嗜中性粒细胞的集团和含嗜酸性粒细胞的集团，将在含嗜中性粒细胞的集团和含嗜酸性粒细胞的集团之间存在的粒子检测为活化嗜中性粒细胞。
文档编号G01N21/47GK103076311SQ201210411029
公开日2013年5月1日 申请日期2012年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者河野麻理, 高木由里 申请人:希森美康株式会社