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专利名称：一种甲烷氧化菌体外特异性荧光染色的方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质染色的技术领域，特别涉及一种甲烷氧化菌体外特异性荧光染色的方法。
背景技术：
甲烷氧化菌是专性烃氧化菌菌群中的一员，是具有高度专一的、以甲烷为唯一碳源的细菌群体。甲烷氧化菌的存活依赖于持续性的甲烷供给。故表层土壤和/或沉积物中甲烷氧化菌异常的产生往往与深部甲烷的持续微渗漏有关，而甲烷氧化菌异常是微生物油气勘探与微生物油气藏表征的重要指标。甲烷氧化菌异常的确定需要对甲烷氧化菌的数量进行高通量计数；而甲烷氧化菌数量的高通量计数需要以甲烷氧化菌体外特异性荧光染色技术为基础。然而，该技术是前人尚未涉及的领域。甲烷单加氧酶(pMMO)是甲烷氧化菌的特征性酶，是一种跨膜蛋白。本方法利用 PMMO的膜外结构域能与经异硫氰酸荧光素(FITC)标记的pMMO单克隆抗体进行特异性结合的这一特性，实现对甲烷氧化菌在体外的特异性荧光染色。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种能在体外对甲烷氧化菌进行特异性荧光染色的方法，从而为甲烷氧化菌高通量计数做技术准备。本发明研究发现，pMMO作为甲烷氧化菌的跨膜特征酶，可通过膜外结构域与相应的单克隆抗体结合。本发明的甲烷氧化菌体外特异性荧光染色的方法，包括如下步骤
(1)PMMO提取和纯化采用洲(质量/体积，g/mL)n_十二烷基-β，D-麦芽糖苷溶解甲烷氧化菌的膜蛋白组分，然后使用吸附剂BioBeads SM-2将变性剂η_十二烷基-β，D-麦芽糖苷吸附去除，使其浓度降低至0. 2%，最后加入0. 1%的变性剂Brij 58或Tween 20进行柱层析分离和纯化PMMO ；
(2)单克隆抗体的制备将纯化得到的pMMO进行小鼠免疫试验，经3次免疫和1次加强免疫后，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合培养，筛选得到能与PMMO膜外结构域结合的单克隆抗体；
(3)单克隆抗体的FITC荧光标记在碱性溶液中，应用Marsshall法标记FITC荧光抗
体；
(4)甲烷氧化菌体外染色和检测分析将该标记抗体对甲烷氧化菌进行体外染色，最后用荧光显微镜对荧光强度进行分析，评价染色效果。由于η-十二烷基-β，D-麦芽糖苷既是pMMO的最佳溶剂，同时也会抑制pMMO的活性，故不能作为柱层析分离的变性剂。本发明首先使用洲(质量/体积，g/mL)的η-十二烷基-β，D-麦芽糖苷彻底溶解甲烷氧化菌的膜蛋白组分，然后使用吸附剂BioBeads SM_2将变性剂η-十二烷基-β，D-麦芽糖苷吸附去除，使其浓度降低至0. 2%，此时酶活力可达到原始酶活性的88. 2%，最后加入0. 1%的变性剂Brij 58或Tween 20进行柱层析分离、纯化ρΜΜΟ。将纯化得到SDS-PAGE纯的ρΜΜΟ进行小鼠免疫试验，经3次免疫和1次加强免疫后，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合培养，筛选得到能与PMMO膜外结构域结合的单克隆单体。在碱性溶液中，应用Marsshall法标记FITC荧光抗体后，将该标记抗体对甲烷氧化菌进行体外染色，最后用荧光显微镜对荧光强度进行分析，评价染色效果。ρΜΜΟ提取所用菌株是中山大学王江海研究团队从南阳油田分离得到的甲烷氧化菌ΝΥ003菌株。具体的发酵培养、提取和纯化过程如下先用5L自动发酵罐培养甲烷氧化菌2L，离心收集菌体，超声破碎、提取膜组分；加入pH 7.0,25 mM的MOPS缓冲液将膜组分充分悬浮，向悬浮液持续通入氮气20 min，将溶液中的氧气彻底驱除；加入洲(质量/体积，g/mL) η-十二烷基-β，D-麦芽糖苷，混合反应45 1^11后，143，000 X g离心90 min， 保留上清；加入η-十二烷基-β，D-麦芽糖苷的吸附剂BioBeads SM-2，反应45 min后，离心去除BioBeads ；经0. 22 Mm滤膜过滤后加入0. 1% Brij 58或0. 1% Tween 20后，再采用柱层析进行分离、纯化。柱层析所用层析柱为P0R0S 20 HQ/Mcolumn (1 cm X 10 cm)；使用前经pH 7. 0、含0. 1% Brij 58或0. 1% Tween 20、25 mM的MOPS缓冲液进行平衡处理。
ρΜΜΟ单克隆抗体的制备选用6 8周龄的雌性Balb/c小鼠作为免疫动物，将 SDS-PAGE纯的ρΜΜΟ用生理盐水稀释至蛋白浓度为1 mg/mL，与等量弗氏完全佐剂充分乳化后采用皮下多点注射(100 μ g/只)进行免疫；取小鼠脾细胞和事先制备好的骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选出能分泌PMMO单克隆抗体的细胞株；对筛选得到的杂交瘤细胞株进行克隆化培养，生产纯化出可用于后续试验的大量的PMMO单克隆抗体。FITC标记取适量已知浓度的ρΜΜΟ单克隆抗体溶液于烧杯中，再加入生理盐水和碳酸盐缓冲液，使最后PMMO浓度为20 mg/mL，碳酸盐缓冲液容量为总量的1/10，混勻；将烧瓶置于电磁搅拌器上(控制适当的转速，以不起泡沫为宜)5-10 min;根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克PMMO单克隆抗体蛋白加0.01 0. 03 mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末；边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(约在5 10 min内加完)；避光搅拌6 12 h。结合期间应保持蛋白溶液于4° C左右，故需将烧杯和搅拌器一起移入4° C冰箱中；结合完毕后，将标记的蛋白溶液5000 Xg离心20 min，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋，再置于烧杯中；用pH8.0缓冲盐水透析((Γ4° C)过夜；取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶kphadex G_25或G_50 柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。将甲烷氧化菌标准品固定在滤膜上，加入PBS溶液抽滤3 5次；彻底去除干扰杂质后，加入PBS稀释的经FITC标记的单克隆抗体，染色2 h后，再加入PBS溶液抽滤3 5 次，将尚未结合的经荧光标记的单克隆抗体除去。用荧光显微镜对孔板滤膜上样品的荧光强度进行观察和分析，制作甲烷氧化菌数量与荧光强度之间的标准曲线；研究结果表明，甲烷氧化菌在体外的荧光染色率为99. 6% 99. 9%ο与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
(1)首次制备了经FITC标记的ρΜΜΟ单克隆抗体，为甲烷氧化菌的体外染色提供了高效的染色剂。
(2)首次制作了甲烷氧化菌数量与荧光强度之间的标准曲线，验证了采用甲烷氧化菌体外荧光染色技术来实现对甲烷氧化菌进行高通量计数的可行性。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。实施例1
1、用5L发酵罐培养甲烷氧化菌NY003溶液2 L至光密度(OD)值为0. 6，5000 Xff离心5 min后收集菌体，超声破碎后提取膜组分。2、采用现有技术从膜组分中得到含0. (质量/体积，g/mL) n_十二烷基-β， -麦芽糖苷的膜蛋白溶液；向该溶液加入0.1% Brij 58后进行柱层析分离，提取 pMMOo3、委托专业厂家制备pMMO单克隆抗体。4、按每毫克pMMO单克隆抗体蛋白添加0. 01 0. 02 mg FITC荧光色素；避光搅拌 12-14 h经FITC标记的抗体蛋白；标记产物用pH 8. 0的缓冲盐水透析过夜后，通过葡聚糖
G-25柱，分离出游离的荧光素，收集经标记的荧光抗体。5、将5个不同数量级(103、105、107、IO9UO11个)的甲烷氧化菌抽滤产物固定于孔径为0.2 ym、96孔的滤膜孔上；加入PBS溶液抽滤清洗3次，然后分别加入用PBS稀释、终浓度为10 mg/mL、经FITC标记的单克隆抗体100 yL，染色2 h ；加入PBS溶液抽滤5次后， 将尚未结合的经FITC标记的单克隆抗体除去。6、用荧光显微镜对孔板滤膜上样品的荧光强度进行分析，制作甲烷氧化菌数量与荧光强度之间关系的标准曲线；研究结果表明，甲烷氧化菌在体外的荧光染色率为99. 8%。实施例2
1、用5 L发酵罐培养甲烷氧化菌NY003溶液2 L至OD值为0. 6，5000 X g离心5 min
后收集菌体，超声破碎后提取膜组分。2、采用现有技术从膜组分中得到含0. (质量/体积，g/mL) n_十二烷基-β， -麦芽糖苷的膜蛋白溶液；向该溶液加入0.1% Tween 20后进行柱层析分离，提取 pMMOo3、委托专业厂家制备pMMO单克隆抗体。4、按每毫克pMMO单克隆抗体蛋白加0.01 0.02 mg FITC荧光色素；避光搅拌12 14 h经FITC标记的抗体蛋白；标记产物用pH8.0的缓冲盐水透析过夜后，通过葡聚糖凝
G-50柱，分离出游离的荧光素，收集经标记的荧光抗体。5、将5个不同数量级(103、105、107、IO9UO11个)的甲烷氧化菌抽滤产物固定于孔径为0.2 ym、96孔的滤膜孔上；加入PBS溶液抽滤清洗3次，然后分别加入用PBS稀释、终浓度为10 mg/mL、经FITC标记的单克隆抗体100 yL，染色2 h ；加入PBS溶液抽滤5次后， 将尚未结合的经FITC标记的单克隆抗体除去。6、用荧光显微镜对孔板滤膜上样品的荧光强度进行分析，制作甲烷氧化菌数量与荧光强度之间关系的标准曲线；研究结果表明，甲烷氧化菌在体外的荧光染色率为99. 9%。实施例3
1、用5 L发酵罐培养甲烷氧化菌NY003溶液2 L至OD值为0. 6，5000 X g离心5 min后收集菌体，超声破碎后提取膜组分。2、采用现有技术从膜组分中得到含0. (质量/体积，g/mL) n_十二烷基-β， -麦芽糖苷的膜蛋白溶液；向该溶液加入0.1% Brij 58后进行柱层析分离，提取 pMMOo3、委托专业厂家制备pMMO单克隆抗体。4、按每毫克pMMO单克隆抗体蛋白加0. 02 0. 03 mg FITC荧光色素；避光搅拌6 10 h经FITC标记的抗体蛋白；标记产物用PH8.0的缓冲盐水透析过夜后，通过葡聚糖凝
G-25柱，分离出游离的荧光素，收集经标记的荧光抗体。5、将5个不同数量级(103、105、107、IO9UO11个)的甲烷氧化菌抽滤产物固定于孔径为0.2 ym、96孔的滤膜孔上；加入PBS溶液抽滤清洗3次，然后分别加入用PBS稀释、终浓度为10 mg/mL、经FITC标记的单克隆抗体100 yL，染色2 h ；加入PBS溶液抽滤5次后， 将尚未结合的经FITC标记的单克隆抗体除去。6、用荧光显微镜对孔板滤膜上样品的荧光强度进行分析，制作甲烷氧化菌数量与荧光强度之间关系的标准曲线；研究结果表明，甲烷氧化菌在体外的荧光染色率为99. 7%。实施例4
1、用5 L发酵罐培养甲烷氧化菌NY003溶液2 L至OD值为0. 6，5000 X g离心5 min
后收集菌体，超声破碎后提取膜组分。2、采用现有技术从膜组分中得到含0. (质量/体积，g/mL) n_十二烷基-β， -麦芽糖苷的膜蛋白溶液；向该溶液加入0.1% Tween 20后进行柱层析分离，提取 pMMOo3、委托专业厂家制备pMMO单克隆抗体。4、按每毫克pMMO单克隆抗体蛋白加0. 02 0. 03 mg FITC荧光色素；避光搅拌6 10 h经FITC标记的抗体蛋白；标记产物用PH8.0的缓冲盐水透析过夜后，通过葡聚糖凝
G-50柱，分离出游离的荧光素，收集经标记的荧光抗体。5、将5个不同数量级(103、105、107、IO9UO11个)的甲烷氧化菌抽滤产物固定于孔径为0.2 ym、96孔的滤膜孔上；加入PBS溶液抽滤清洗3次，然后分别加入用PBS稀释、终浓度为10 mg/mL、经FITC标记的单克隆抗体100 yL，染色2 h ；加入PBS溶液抽滤5次后， 将尚未结合的经FITC标记的单克隆抗体除去。6、用荧光显微镜对孔板滤膜上样品的荧光强度进行分析，制作甲烷氧化菌数量与荧光强度之间关系的标准曲线；研究结果表明，甲烷氧化菌在体外的荧光染色率为99. 6%。
权利要求
1. 一种甲烷氧化菌体外特异性荧光染色的方法，其特征在于包括如下步骤(1)PMMO提取和纯化采用洲(质量/体积，g/mL)n_十二烷基-β，D-麦芽糖苷溶解甲烷氧化菌的膜蛋白组分，然后使用吸附剂BioBeads SM-2将变性剂η_十二烷基-β，D-麦芽糖苷吸附去除，使其浓度降低至0. 2%，最后加入0. 1%的变性剂Brij 58或Tween 20进行柱层析分离和纯化PMMO ；(2)单克隆抗体的制备将纯化得到的ρΜΜΟ进行小鼠免疫试验，经3次免疫和1次加强免疫后，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合培养，筛选得到能与PMMO膜外结构域结合的单克隆单体；(3)单克隆抗体的FITC荧光标记在碱性溶液中，应用Marsshall法标记FITC荧光抗体；(4)甲烷氧化菌体外染色和检测分析将该标记抗体对甲烷氧化菌进行体外染色，最后用荧光显微镜对荧光强度进行分析，评价染色效果。
全文摘要
本发明涉及蛋白质染色技术领域，公开了一种甲烷氧化菌体外特异性荧光染色的方法。本发明利用甲烷氧化菌特征性跨膜蛋白“甲烷单加氧酶(pMMO)”与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的pMMO单抗的特异性结合，进行甲烷氧化菌体外特异性荧光染色的方法；包括pMMO提取和纯化；pMMO单克隆抗体的制备；pMMO单克隆抗体的FITC荧光标记；甲烷氧化菌的体外染色。荧光强度分析和标准曲线制作验证了本发明能实现对甲烷氧化菌在体外进行特异性高效(99.6%~99.9%)荧光染色的目的，为土壤和沉积物样品中甲烷氧化菌的高通量定量检测提供技术支持。
文档编号G01N1/30GK102183398SQ20111004458
公开日2011年9月14日 申请日期2011年2月24日 优先权日2011年2月24日
发明者刘权, 吕宝凤, 吴酬飞, 彭娟, 徐小明, 徐小燕, 燕腾鹏, 王江海, 袁建平, 许红, 郑新宁, 郑贵洲 申请人:中山大学, 广州安能特化学科技有限公司