专利名称：使用两个以上的波长带的光的测量的光学分析方法
技术领域：
本发明涉及一种光学分析方法，该光学分析方法能够通过使用诸如共聚焦显微镜或多光子显微镜等光学系统的、可以检测来自溶液中的微区域的光以获取颗粒的状态(相互作用、结合或解离状态等)的分析中的有用信息的光学系统，检测来自分散或溶解在溶液中的例如原子、分子或分子聚合物的微粒物(以下将其称为“颗粒”)的光，微粒物例如有生物分子或非生物颗粒，其中生物分子例如有蛋白质、肽、核酸、脂肪、糖链、氨基酸以及这些的聚合物、病毒和细胞等，本发明尤其涉及这样一种方法，该方法用于使用上述光学系统进行两个以上的波长带的光的测量，以使得可以进行各种光学分析，其中，在光学分析中，识别颗粒的种类，或者在测量结果中，将来自想要观测的颗粒(待观测颗粒)的信号与其他信号或噪声区分开来。在这方面，在本说明书中，发射光的颗粒(以下称为“发光颗粒”)可以是自身发射光的颗粒或向其附着了任意发光标记物的颗粒，并且从发光颗粒所发射的光可以是荧光、磷光发光、化学发光、生物发光、散射光等。
背景技术：
根据近年来光学测量技术的发展，通过使用共聚焦显微镜的光学系统和能够进行光子计数的超高灵敏度光检测技术(单光子检测)，单光子或单荧光分子水平的微弱光的检测和/或测量已变得可能。因此，提出了用于利用这类微弱光测量技术进行生物分子等的特性、分子间相互作用、结合或解离反应的检测的各种装置或方法。例如，在荧光相关光谱分析(FCS，例如参考专利文献I和2、以及非专利文献I 3)中，利用激光共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术，对出入样品溶液的微区域(使显微镜的激光聚集至的焦点区域，被称为“共聚焦体积”)的荧光分子或荧光标记分子(荧光分子等)的荧光强度进行测量，并且基于根据所测量出的荧光强度的自相关函数值所确定的、微区域中的荧光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)和滞留分子的数量的平均值，实现诸如荧光分子等的运动速度、大小或浓度等的信息的获�。约�/或者诸如分子结构或大小的变化、分子的结合或解离反应或分散和聚合等的各种现象的检测。此外，在荧光互相关光谱分析(FCCS，例如非专利文献4和专利文献5)中，对于包含具有两个不同的发射波长的荧光分子等的样品溶液，使用同一装置作为FCS来测量两个发射波长的光强度，并且基于所测量出的这两个发射波长的光强度的互相关函数的值，估计在发射不同发射波长的荧光的两个颗粒的运动中是否存在相关性，即，这些颗粒是否相互结合或相互作用、或者相互作用物质的数量或速率。此外，在荧光强度分布分析(FIDA，例如专利文献3)或光子计数直方图(PCH，例如专利文献4)中，生成类似于FCS所测量出的出入共聚焦体积的荧光分子等的荧光强度的直方图，并且通过对该直方图的分布进行统计模型公式的拟合，计算荧光分子等的特征亮度的平均值和共聚焦体积中滞留的分子的平均数量，从而使得可以基于其信息来估计分子的结构或大小变化、结合或解离状态、或者分散和聚合状态。另外，在专利文献6和7中，提出了用于基于使用共聚焦显微镜的光学系统所测量出的样品溶液的荧光信号的时间进展来检测荧光物质的方法。专利文献8提出了一种用于利用光子计数技术来测量来自流过流式细胞仪的荧光微小颗粒或被固定在底物上的荧光微小颗粒的微弱光，以检测在流体或底物上存在荧光微小颗粒的信号计算处理技术。特别地，根据利用采用诸如FCS、FCCS和FIDA等的共聚焦显微镜和光子计数技术的光学系统的微区域的荧光的测量技术的方法，测量所需的样品量可以非常小(一次测量中所使用的量至多数十μL)，并且与在先技术相比，其浓度非常低，而且还大幅缩短测量时间(在一次测量中，重复数次数秒时间的测量处理)。因此，与传统生物化学方法相比，尤其在对医学或生物学研究和开发领域通常所使用的稀有或昂贵样品的进行分析、或者在诸如疾病临床诊断或生物活性物质的筛选等的对大量样本进行测试中，预期这些技术是能够以低成本和/或快速建立试验或测试的强大工具。 在先技术文献专利文献
专利文献1:日本特开2005-098876号专利文献2:日本特开2008-292371号专利文献3:日本4023523号专利专利文献4:W02008-080417专利文献5:日本3517241号专利专利文献6:日本特开2007-20565号专利文献7:日本特开2008-116440号专利文献8:日本特开平4-337446号非专利文献非专利文献I:Masataka Kaneshiro; “Protein, Nucleic acid, Enzymelo1.44，Nο.9,pagesl431 - 1438, 1999非专利文献2:F.J.Meyer-Alms; “Fluorescence CorrelationSpectroscopy，，edt.R.Rigler, Springer, Berlin, pages204 - 224, 2000.
非专利文献3:Noriko Kato, et al.“Gene medicine”，Vol.6，N0.2，pages271_27
7.
非专利文献4:Biophysical Journal, Volume72 (1997) 1878-188
发明内容
抟术问是页在诸如FCS、FCCS和FIDA等的、使用共聚焦显微镜和光子计数技术的光学系统的上述光学分析技术中，尽管测量光是从单个或者数个荧光分子所发射的光，但是在光的分析中，进行诸如按照时间序列所测量出的荧光强度数据的自相关函数或互相关函数的计算、或者直方图的拟合等的用于计算荧光强度波动的统计过程，因此不会看见或者分析来自各个荧光分子的光的信号。也就是说，在这些光学分析技术中，通过对来自多个荧光分子等的光的信号的统计处理，检测荧光分子等的统计平均特性。因此，为了在这些光学分析技术中获得统计上的显著结果，作为样品溶液中的观测对象的荧光分子等的浓度或数量密度应该处于这样的水平，在平衡状态下，在数秒时长的一次测量期，能够进行统计处理的该数量的荧光分子等出入微区域，优选使得大约一个荧光分子等始终存在于微区域中。实际上，由于共聚焦体积的体积约为lfL，上述光学分析技术中所使用的样品溶液中的荧光分子等的浓度通常处于InM以上的水平，且在远低于InM的水平处，会产生在共聚焦体积中不存在荧光分子等的时期，因而不会获得统计上的显著分析结果。另一方面，在专利文献6 8所述的荧光分子等的检测方法中，不包括荧光强度的统计计算处理，因而可以检测到样品溶液中甚至小于InM的荧光分子等，但是，仍未实现定量计算在溶液中自由运动的荧光分子等的浓度或数量密度。然后，在日本2010-044714和PCT/JP2011/53481号专利申请中，本申请的申请人提出了一种基于新的原理的光学分析技术，其中，该原理使得可以定量观测下面的样品溶液中的发光颗粒的状态或特性，在该样品溶液中，作为观测对象的发光颗粒的浓度或数量密度低于诸如FCS、FCCS和FIDA等的包括统计过程的光学分析技术所使用的水平。在该新的光学分析技术中，简而言之，类似于FCS、FCCS、FIDA等，使用诸如共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等的、可以检测来自溶液中的微区域的光的光学系统，并且，另外，在样品溶液中移动微区域(即光检测区域)的位置，也就是说，利用微区域扫描样品溶液的内部，并且当分散并在样品溶液中自由运动的发光颗粒穿过微区域内部时，检测从发光颗粒所发射的光，从而分别检测样品溶液中的各发光颗粒，因而使得变得可以进行样品溶液中的发光颗粒的计数、以及获取与发光颗粒的浓度或数量密度有关的信息。根据该新的光学分析技术(以下称为“扫描分子计数方法”)，不仅用于测量所需的样品量可以小(例如，约数十μ L)，并且类似于诸如FCS 、FCCS和FIDA等的光学分析技术，测量时间短，而且与诸如FCS、FCCS和FIDA等的光学分析技术的情况相比，还变得可以在更低浓度或数量密度的情况下检测发光颗粒的存在、以及定量检测诸如浓度或数量密度等的发光颗粒的特性。这样，在上述扫描分子计数方法中，假设一个发光颗粒在进入光检测区域时所发射的光表现出具有冠状或近钟状轮廓的强度变化，即时序光强度数据中的脉冲形式信号，并且每一脉冲形式信号与每个发光颗粒相对应，逐一检测时序光强度数据中的脉冲形式信号，并且计数所检测到的脉冲形式信号的数量，作为通过光检测区域的发光颗粒的数量。然而，在这种情况下，不能相互区分相互不同类型的、具有相同发光波长的发光颗粒，或者，如果在样品溶液中存在不同于要作为观测对象的发光颗粒、并且同样具有与要观测的颗粒相同的发光波长的发光颗粒，则可能将来自除要观测的颗粒以外的发光颗粒的光的光强度变化(脉冲形式信号)错误地检测为要观测的颗粒，结果导致测量结果的精度劣化。另外，在诸如FCS、FCCS和FIDA等的光学测量技术中，类似地，如果存在具有与要观测的颗粒相同的发光波长的、除要观测的颗粒以外的发光颗粒，则除要观测的颗粒以外的成分的贡献可能叠加在所测量出的时序光强度数据上，因而测量结果的精度可能劣化。为了避免如上所述的测量精度的劣化，优选对于所测量出的光强度数据，可以区分来自特定种类的发光颗粒的光的信号和来自具有相同发光波长的其他种类的发光颗粒的光的信号，或者优选可以区分来自要观测的颗粒的光的信号和来自除要观测的颗粒以外的发光颗粒的光的信号，从而使得可选择性地消除来自除要观测的颗粒以外的发光颗粒的光的信号。在这方面，通过与上述扫描分子计数方法有关的说明可知，在将共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统与超高灵敏度光检测技术相联合的该光学测量技术中，可以分别检测在随着时间进展所测量出的时序光强度数据中出现的与各发光颗粒相对应的光强度变化或脉冲形式信号。因此，对于来自特定种类的发光颗粒的光的信号和来自其他种类的发光颗粒的光的信号之间的区分、来自要观测的颗粒的光的信号和来自除要观测的颗粒以外的发光颗粒的光的信号之间的区分、或者时序光强度数据上的来自除要观测的颗粒以外的发光颗粒的光的信号的选择性消除，可以使用用于分别检测各发光颗粒的信号的方法。因此，本发明的目的是提出一种新方法，该方法使得可以利用如上所述将共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统与超高灵敏度光检测技术组合以测量光的方法，分别检测并识别与来自样品溶液中的发光颗粒的光相对应的光强度变化或信号，其中，在该样品溶液中，存在具有相同发光波长的两个以上种类的发光颗粒。另外，在如上所述的用于测量光的方法中，更优选不仅选择性地识别光强度数据上与来自特定种类的发光颗粒的光相对应的信号，而且还使得可以分别判断时序光强度数据上出现的信号对应于哪一种类的发光颗粒，例如，信号是与要观测的颗粒相对应还是与除要观测的颗粒以外的发光颗粒相对应。因此，本发明另一目的是提出一种新方法，其中，该方法使得可以利用如上所述将共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统与超高灵敏度光检测技术组合以测量光的方法，判断所测量出的光强度数据上出现的是两个以上种类的发光颗粒中的哪一种类的信号。用于解决问题的方案根据本发明，通过用于使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统来检测和分析来自包含两个以上种类的自由运动的发光颗粒的样品溶液的光的方法，来实现上述目的，所述方法的特征在于，其包括以下步骤:按照波长带同时测量来自所述样品溶液中的所述光学系统的光检测区域的两个以上波长带的光的强度，以分别对于每一波长带生成时序光强度数据；以及检测在两个以上的时序光强度数据中的至少两个波长带的时序光强度数据上所同时生成的、表示来自发光颗粒的光的信号，以及将同时生成的信号识别为所述两个以上种类的发光颗粒中的至少一个特定种类的发光颗粒的信号。在该结构中，“自由运动的发光颗粒”可以是诸如原子、分子、或者其聚合体等的、分散或溶解在样品溶液中、并且发射光的颗粒，并且这些颗�？梢允窃谖锤阶旁诘孜锏壬系那榭鱿略谌芤褐凶杂山胁祭试硕娜我饪帕Ｎ�。发光颗粒代表性的是荧光颗粒，但是可以是通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等来发射光的颗粒。共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是在这些显微镜中检测光的微区域，该区域对应于在通过物镜给出照明光时照明光被聚集至的区域(特别地，在共聚焦显微镜中，根据物镜和储液孔之间的空间关系确定该区域。对于在无需照明光的情况下发射光的发光颗粒，例如，根据化学发光或生物发光发射光的分子，在显微镜中无需照明光。)。此外，应该注意，在与“同时生成的信号”相对应的“至少一个特定种类的发光颗粒”的含义中，不仅可以包括样品溶液中所包含的种类中的一个种类的发光颗粒，而且还可以包括这些种类中的数个种类的发光颗粒。(此外，在下面的本说明书中，“信号”意为“表示来自发光颗粒的光的信号，除非另有说明。)简而言之，在上述本发明的方法中，在使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统对包含两个以上种类的发光颗粒的样品溶液进行光测量和分析的情况下，首先，按照波长带同时测量两个以上波长带的光强度，并且分别检测在通过该测量所产生的两个以上波长带的时序光强度数据中的至少一个波长带的数据上的每各同时生成的信号，从而在时序光强度数据中识别存在同时生成信号的时期和不存在同时生成信号的时期。认为在存在同时生成信号的时期中，具有在所有至少两个波长带中的发光波长带的发光颗粒进入了光检测区域，因此，可以判断为在该时期，在光检测区域中包含两个以上种类的发光颗粒中的至少一个特定种类的发光颗粒，因而可以将同时生成信号识别为两个以上种类的发光颗粒中的至少一个特定种类的发光颗粒的信号。而且，在预先知道在哪一波长带中，作为观测对象的颗粒发射光的情况下，可以识别同时生成信号是观测颗粒的信号、还是除观测颗粒以外的发光颗粒的信号。也就是说，如果仅在一个波长带中检测观测颗粒的光，则可能将在至少两个波长带的时序数据上同时生成的信号的生成期的数据不识别为观测颗粒的信号，相反，如果在至少两个波长带中检测观测颗粒的光，则可以将同时生成信号的生成期的数据识别为观测颗粒的信号。在本发明的结构中，例如，可以以下面的方式进行在至少两个波长带的时序数据上同时生成的信号的检测:在两个以上波长带中的第一波长带的时序光强度数据中的、表示发光颗粒的光的信号的生成期，与两个以上波长带中的除第一波长带以外的至少一个波长带的时序光强度数据中的、表示发光颗粒的光的信号的生成期重叠的情况下，将第一波长带的时序光强度数据中的信号和除第一波长带以外的至少一个波长带的时序光强度中的信号检测为同时生成信号。例如，在光的测量中，在测量带的数量是2的情况下，当一个波长带的时序光强度数据中的信号的生成期与另一波长带的时序光强度数据中的信号的生成期重叠时，可以将这些信号判断为同时生成信号。此外，在测量波长带的数量是3个以上的情况下，当这三个以上波长带中的一个波长带的时序光强度数据中的信号的生成期，与其余两个以上波长带中的一个波长带的时序光强度数据中的信号的生成期重叠时，可以将这些信号判断为同时生成信号，当一个波长带的时序光强度数据中的信号的生成期，与其余两个以上波长带中的两个以上波长带的时序光强度数据中的信号的所有生成期重叠时，可以将这些信号判断为同时生成信号；或者当所有波长带的时序光强度数据中的信号的生成期相互重叠时，可以将这些信号判断为同时生成信号。也就是说，应该理解，可以任意选择在同时生成信号的判断中所要参考的波长带的组合。而且，应该理解，根据要参考的波长带的组合的数量，确定发光颗粒的可区别种类的数量，并且随着要参考的波长带的组合的数量增大，发光颗粒的可区别种类的数量增大。在一个方式下，可以将上述本发明的结构应用于用于分别检测时序光强度数据上的表示来自发光颗粒的光的信号的光学分析方法。在这种情况下，在本发明的结构中，可以进行下面的步骤:用于分别检测两个以上波长带的各时序光强度数据上的表示来自发光颗粒的光的信号。而且，可以基于是否在两个以上波长带中的至少两个选择的波长带中同时生成了各信号，识别发射通过各所检测到的信号所表示的光的发光颗粒的种类。也就是说，根据该结构，变得可以根据发光颗粒的种类来对时序光强度数据中出现的信号进行分类。如上所述，在可以根据发光颗粒的种类对在时序光强度数据中出现的信号进行分类情况下，可以根据各信号是观测颗粒的信号还是除观测颗粒以外的颗粒的信号识别和分类在时序光强度数据中出现的每一信号。因此，在一个方式下，可以将在至少两个选择的波长带中同时生成的信号，识别为两个以上种类的发光颗粒中的观测颗粒的信号，而将除同时生成的信号以外表示来自发光颗粒的光的信号识别为除观测颗粒以外的发光颗粒的信号，或者，相反，可以将在至少两个选择的波长带中同时生成的信号识别为两个以上种类的发光颗粒中的除观测颗粒以外的发光颗粒的信号，而将除同时生成信号以外的表示来自发光颗粒的光的信号识别为观测颗粒的信号。特别地，在两个波长带的测量的情况下，可以将在两个波长带的时序光强度数据上同时生成的信号识别为观测颗粒的信号，而将仅在两个波长带的时序光强度数据中的一个上所生成的、表示来自发光颗粒的光的信号，识别为除观测颗粒以外的发光颗粒的信号，或者可以将在两个波长带的时序光强度数据上同时生成的信号识别为除观测颗粒以外的发光颗粒的信号，而将仅在两个波长带的时序光强度数据中的一个上所生成的、表示来自发光颗粒的光的信号，识别为观测颗粒的信号。此外，可以将本发明的上述结构应用于如上所述的扫描分子计数方法。也就是说，在本发明的方法的一个方面，可以进行下面的步骤:随着通过改变共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的光路来移动样品溶液中的光检测区域的位置，测量来自光检测区域的两个以上波长带的光强度的，并且分别在所获得的每一时序光强度数据中检测表示来自单个发光颗粒的光的各信号，其中，如上所述，对于每一检测信号，基于是否在两个以上波长带中的至少两个选择的波长带中同时生成各信号，识别发射以该信号所表示的光的发光颗粒的种类。在应用本发明的扫描分子计数方法的基本结构中，首先，在通过任意方法准备包含发光颗粒的样品溶液之后，在样品溶液中移动光检测区域的位置的同时，即在利用光检测区域扫描样品溶液的内部的同时，顺次进行光强度的测量。然后，当移动光检测区域包含自由移动的发光颗粒时，通过光检测区域检测到来自发光颗粒的光，从而检测到存在一个颗粒。而且，在表示顺次所检测到的光的时序光强度数据中，分别检测表示来自发光颗粒的光的信号，因而逐一检测到发光颗粒各自的存在，因此，获取与溶液中的颗粒的状态有关的多种信息。就此而论，在分别检测表示来自单个发光颗粒的光的信号时，可以基于按照时间顺序所检测到的信号的形状，进行时序光强度数据上与一个发光颗粒相对应的信号的检测。代表性地，在一个实施例中，当检测到具有比预定阈值更高强度的脉冲形式信号时，其信号是与一个发光颗粒相对应的信号，因此，可以检测为在该信号的生成期，在光检测区域中存在一个发光颗粒。此外，在本发明的情况下，基于在两个以上波长带中的至少两个选择的波长带中是否同时生成各自的信号，可以识别与各信号相对应的发光颗粒的种类，或者基于其发光波长带，可以对与发光颗粒相对应的各个信号进行分类，因此，可以仅提取特定选择的发光波长带的发光颗粒的信号、或者根据基于发光波长带所分类的信号的组来提取信号。此外，如上所述，由于还可以将在至少两个选择的波长带中同时生成的信号识别为两个以上种类的发光颗粒中的观测颗粒的信号(或除观测颗粒以外的发光颗粒的信号)、并且可以将除同时生成信号以外的信号识别为除观测颗粒以外的发光颗粒的信号(或观测颗粒的信号)，所以在扫描分子计数方法中，可以识别和检测观测颗粒的信号和除观测颗粒以外的发光颗粒的信号，因此，排除除观测颗粒以外的发光颗粒的信号变得可能，因而可以避免测量精度劣化。另外，在两个波长带中的测量的情况下，可以将两个波长带的时序光强度数据上同时生成的信号识别为观测颗粒的信号、而将仅在两个波长带的时序光强度数据中的一个中生成的信号识别为除观测颗粒以外的发光颗粒的信号，或者可以将两个波长带的时序光强度数据上同时生成的信号识别为除观测颗粒以外的发光颗粒的信号、而将仅在两个波长带的时序光强度数据中的一个上生成的信号识别为观测颗粒的信号。在这方面，可以将在两个波长带的时序光强度数据上同时生成的信号、仅在两个波长带的时序光强度数据中的一个中生成的信号和在两个波长带的时序光强度数据中的另一个生成的信号识别为相互不同的观测颗粒(即可以识别三个种类的发光颗粒)。在本发明的扫描分子计数方法的执行中，可以通过对分别检测到的表示来自发光颗粒的光的信号的数量进行计数，来计数在光检测区域的位置的移动期间所检测到的发光颗粒的数量(颗粒计数)。在这种情况下，通过将发光颗粒的数量与光检测区域的位置的移动量相关联，来获取与样品溶液中的发光颗粒的数量密度或浓度有关的信息。特别地，通过利用任意方法确定光检测区域的位置的移动轨迹的总体积，例如，通过以预定速度移动光检测区域的位置，可以具体计算出发光颗粒的数量密度或浓度。当然，代替直接确定绝对数量密度值或浓度值，可以计算数量密度或浓度与多个样品溶液或作为浓度或数量密度的基准的标准样品溶液的相对比。此外，在上述本发明中，由于通过改变光学系统的光路来移动光检测区域的位置，所以在样品溶液中不会实质性发生机械振动和流体动力效应的情况下，快速移动光检测区域，因此，在不存在影响样品溶液中的发光颗粒的动力作用的情况下(没有赝像)，可以在稳定状态下进行光的测量(例如，当在样品中发生流体时，不仅难以使得流速始终均一，而且装置结构也变得复杂，此外，不仅所需样品量大幅增加，而且溶液中的发光颗粒或其他物质还可能由于流体的动力作用而变质或变性)。此外，由于无需用于使样品溶液流动的机构，所以类似于FCS和FIDA等，可以利用小量的样品溶液(I 数十μ L的水平)进行测量和分析 。此外，在移动上述光检测区域的位置时，基于样品溶液中的发光颗粒的特性或者数量密度或浓度，适当改变样品溶液中的光检测区域的位置的移动速度。本技术领域的普通技术人员应该理解，来自发光颗粒的检测光的条件可能根据样品溶液的特性、数量密度或浓度而变化。特别地，当光检测区域的移动速度变快时，从一个发光颗粒所获得的光量将减�。虼耍叛∧芄皇实备谋涔饧觳馇虻囊贫俣龋允沟每梢跃返鼗蜃愎涣槊舻夭饬坷醋砸桓龇⒐饪帕�(尤其是观测颗粒)的光。此外，在用于移动光检测区域的位置的上述步骤中，优选将样品溶液中的光检测区域的位置的移动速度设置成高于发光颗粒的扩散运动速度(由布朗运动所导致的颗粒的平均移动速度)。如上所述，在本发明的方法中，在光检测区域中检测从发光颗粒所发射的光，因而分别检测发光颗粒。然而，当发光颗粒由于布朗运动而自由移动出入光检测区域多次时，将多次检测到来自一个发光颗粒的信号(用于示出其存在)，因此，变得难以将一个发光颗粒的存在与所检测到的信号相关联。那么，如上所述，将光检测区域的移动速度设置得高于发光颗粒的扩散运动速度，因而变得可以使得一个发光颗粒对应于一个信号(表示颗粒的存在)。在这方面，由于扩散运动速度根据发光颗粒而不同，所以优选如上所述，可以根据发光颗粒的特性(尤其扩散系数)适当改变光检测区域的移动速度。可以以任意方法进行用于移动光检测区域的位置的光学系统的光路的改变。例如，可以通过使用激光扫描型光学显微镜中使用的检流镜改变光路，来改变光检测区域的位置。可以任意设置光检测区域的位置的移动轨迹，例如，可以选择圆形、椭圆形、矩形、直线或曲线等。此外，根据本发明，由于检测在两个以上波长带的时序光强度数据上所检测到的、表示来自发光颗粒的光的信号中的同时生成信号，并且进行同时生成信号和其他信号之间的区分，所以对于与同时生成信号相对应的发光颗�：推渌⒐饪帕？梢苑直鸾屑剖�、以及浓度或数量密度的确定，从而可以降低不必要数据的影响、或者忽视或删除它们，因此，有利于进行样品溶液中的特定种类的发光颗粒的观测和分析、以及样品溶液中的发光颗粒的相互作用的观测和分析。这样，上述本发明的方法还可以用于除扫描分子计数方法以外的任意光学分析方法。尤其在无需识别两个以上种类的发光颗粒中的观测颗粒各自的信号的情况下，将在从两个以上波长带中所选择的至少两个波长带中同时生成的信号，识别为除两种以上种类的发光颗粒中的观测颗粒以外的发光颗粒的信号，因而变得可以仅提取除观测颗粒以外的发光颗粒的信号，以在各种分析中忽视或排除它们。此外，根据要进行的光学分析方法的方式，在可以从时序光强度数据删除或消除同时生成信号的生成期的数据，即测量出了除观测颗粒以外的发光颗粒的光的时期的数据，可以消除作为除观测颗粒以外的发光颗粒的信号的、在时序光强度数据中所识别的信号的生成期的数据。这类光学分析方法可以是使用表示来自观测颗粒的光强度的时序光强度数据的光学分析，例如，荧光相关光谱分析(FCS)、荧光强度分布分析方法(FIDA)或荧光互相关光谱分析(FCCS)。根据该结构，可以通过选择性地消除在光检测区域中存在除观测颗粒以外的发光颗粒的时期的数据来进行分析，从而防止结果精度劣化。 本发明的方法通常用于对诸如生物分子、病毒和细胞等的生物微粒物的溶液的状态的分析，其中，生物分子例如有蛋白质、多肽、核酸、脂肪、糖链、氨基酸或者它们的聚合体，但是还可以用于对非生物颗粒(例如，原子、分子、胶束、金属胶体等)的溶液的状态的分析，并且应该理解，这类情况也属于本发明的范围。发明的效果如上所述，在本发明的方法中，通过使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统分别检测在通过两个以上波长带的光测量所获得的时序光强度数据中的至少两个选择的波长带中所同时生成的信号，可以识别时序光强度数据上的、在共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的光检测区域中存在发射所选择的波长带的光的发光颗粒的各个时期，因此，即使对于具有部分共用的发光波长带因而仅通过利用波长的光测量在它们之间不能进行区分的、相互不同的发光颗粒，在时序光强度数据上检测到了来自这类发光颗粒的光时，也变得可以进行区分。而且，根据该结构，由于可以提取特定种类的发光颗粒(发射所选择的波长带的光的发光颗粒)的信号及其生成期，所以可以进行时序光强度数据上的各个数据的选择或者数据的分类。因此，例如，当在测量中将同时生成信号识别为显著信号，或者相反，当在测量中将同时生成信号识别为噪声等时，可以获得高精度的信噪分离。尤其在测量中将同时生成信号识别为噪声等时，可以从时序光强度数据消除噪声，因此，可以有利地使用本发明作为诸如FCS、FIDA、PCH和FCCS等的分析中的用于噪声抑制的一个手段。此外，在将本发明的方法应用于扫描分子计数方法时，可以更加精确地实现发光颗粒的检测和颗粒的计数。对于光检测机构本身，类似于诸如FCS、FCCS和FIDA等的光学分析技术的情况，将扫描分子计数方法设计成检测来自共聚焦显微镜或多光子显微镜的光检测区域的光，因此，样品溶液的量可以一样的�。硗猓捎诓唤兄钊缂扑阌馇慷鹊牟ǘ鹊耐臣乒蹋钥捎τ糜诳帕５氖棵芏然蚺ǘ认灾陀谥钊鏔CS、FCCS和FIDA等的光学分析技术所需水平的样品溶液。当将本发明的方法的结构进一步包含在这类扫描分子计数方法中以使得可以在至少两个选择的波长带中同时生成的信号和其他信号之间进行区分时，预期即使在样品溶液中的发光颗粒的浓度显著低于诸如FCS、FCCS和FIDA等的光学分析技术所需水平、并且特定发光颗�：途哂杏胩囟ǚ⒐饪帕Ｏ嗤姆⒐獠ǔご钠渌⒐饪帕９餐嬖谟谘啡芤褐�、因而在仅利用波长带的光的测量中不能区分它们的情况下，或者在与其他发光颗粒或杂质的数量或浓度相比，作为观测对象的发光颗粒的数量或浓度相对低，因而在连续测量光强度的传统光测量技术中，观测颗粒的光被埋没在光强度数据中的情况下，也可以检测特定的发光颗粒或作为观测对象的颗粒，并且还提高计数精度。例如，可以将本发明应用于用于观测包含导致噪声的许多颗粒的样品溶液(血浆样品等)中的低浓度的发光颗粒的情况。此外，根据用于将本发明的方法包含在扫描分子计数方法中的结构，变得可以在包含具有相互不同的发光波长带的、两个以上种类的发光颗粒的样品溶液中，高精度地检测是否存在这些发光颗粒的相互作用。根据本发明，分别检测在两个以上的波长带的时序光强度数据上同时生成的信号，因此，即使在样品溶液中的两个以上种类的发光颗粒的相互作用微弱、仅形成小量这些发光颗粒的结合体的情况下(例如，FCCS的检测困难的水平)，也可以实现对是否存在结合体的检测及其计数等。通过对以下本发明的优选实施例的说明，本发明的其他目的和优点将显而易见。
图1(A)是用于进行本发明的光学分析装置的内部结构的示意图。图1(B)是共聚焦体积(共聚焦显微镜的光检测区域)的示意图。图1(c)是用于改变镜7的方向以移动样品溶液中的光检测区域的位置的机构的示意图。图2(A)和(B)是分别用于说明应用本发明的方法的扫描分子计数方法中的光检测的原理的示意图和所测量出的光强度随时间的变化的示意图。图3(A)、(C)、⑶和(E)是示意性示出通过检测在以两个以上的波长带中所测量出的光强度数据上同时生成的信号来识别的发光颗粒的组合的例子的图。图3(B)示出在
(A)、(C)和⑶中所测量出的光强度的时间变化(时序光强度数据)的示意图，并且图3 (F)示出在(E)中所测量出的光强度的时间变化(时序光强度数据)的示意图。图4是以流程图示出用于根据本发明的方法进行两个以上波长带的光的测量、以及在两个以上波长带中同时生成的信号的检测和计数的扫描分子计数的过程的图。图5㈧和⑶是下面的情况下的模型的图:要观测的颗粒由于布朗运动而穿过光检测区域的情况和要观测的颗粒通过以比要观测的颗粒的扩散运动速度更快的速度移动样品溶液中的光检测区域的位置而穿过光检测区域的情况。图5(C)示出用于说明在用于在根据扫描分子计数方法从所测量出的时序光强度数据(光子计数的时间变化)检测是否存在发光颗粒的过程中对所检测到的信号的信号处理步骤的例子的图。图6㈧示出所测量出的光子计数数据(条形图)、通过对数据进行平滑化处理所获得的曲线(虚线)、和在脉冲存在区域上拟合的高斯函数(实线)的例子。在该附图中，作为由于噪声或杂质而引起的信号忽视附有“噪声”的信号。图6(B)是用于说明用于判断是否同时生成在不同波长带的时序光强度数据中所生成的信号的处理的图。图7(A)是以流程图示出下面的情况下的过程的图:进行两个以上波长带的光的测量、两个以上的波长带中同时生成的信号的检测和从时序光强度数据对噪声等的生成期的消除，并且然后进行诸如FCS等的分析。图7 (B)是用于说明用于检测在两个以上所测量出的波长带中同时生成的信号来指定噪声等的生成期的处理的图。图8示出利用根据本发明的方法所进行的扫描分子计数方法(实施例1的情况)所获得的两个波长带中的光强度数据(光子计数数据)(上面两个行)、光强度数据的平滑化之后的数据(中间的一行)和钟形函数拟合所识别的脉冲(脉冲形式信号)(下面的一行)的例子。图9分别示出㈧:在根据本发明的方法所进行的实施例1的情况下所获得的、利用两个不同颜色的荧光染料所标记的寡核苷酸的检测实验的结果、以及(B):在FCCS下所获得的、利用两个不同颜色的荧光染料所标记的寡核苷酸的检测实验的结果。各散点图中的误差条示出三次测量中的三倍的SD值的宽度。图10示出利用根据本发明的方法所进行的扫描分子计数方法(实施例2)所获得的、包含两个以上种类的发光颗粒的样品溶液中的一个种类的发光颗粒(荧光染料分子TAMRA)的计数结果。图1l(A)示意性示出应用本发明的方法所进行的FCS(实施例3)的步骤，其中，在从主测量波长带的时序光强度数据删除与被判断为副测量波长带的时序光强度数据中的噪声期的时期相对应的时期的数据之后，重建在时间上连续的数据。图1l(B)和(C)示出在应用本发明的方法所进行的FCS(实施例3)中所获得的发光颗粒(荧光染料分子ΑΤΤ0)的颗粒计数和平移扩散时间的结果。附图中的误差条示出三倍的SD值。图12示出在用于计算荧光强度波动的传统光学分析技术中所获得光子计数(光强度)的时间变化的例子，其中，(A)示出颗粒浓度处于能够提供充分测量精度的水平的情况，并且(B)示出样品中的颗粒浓度显著低于情况(A)的情况。附图标记的i兑明I光学分 析装置(共聚焦显微镜)2 光源3单模光纤4准直透镜5、14a 二向色镜6、7、11 反光镜8 物镜9微平板10储液孔(样品溶液容器)12聚光透镜13 小孔14屏障滤波器15多模光纤16光电检测器17镜面反射器17a台位置改变设备18计算机
具体实施例方式下面详细说明本发明的优选实施例。光学分析装置的结构本发明的方法可结合于诸如扫描分子计数方法或FCS、FCCS, FIDA等的光学分析方法之中来进行。在这方面，尤其在本发明的方法中，进行两个以上相互不同的波长带的光的测量和分析，因此，可以利用通过组合如图1(A)示意性所示的共聚焦显微镜和光电检测器的光学系统所构成的光学分析装置I来实现本发明的方法，其中，利用光学分析装置1，可以实现诸如扫描分子计数方法或FCS、FCCS和FIDA等的光学分析方法，并且可以进行相互不同的波长带的光的测量。具体地，参考图1(A)，光学分析装置I由光学系统2-17和计算机18构成，其中，计算机18用于获取和分析数据、以及控制该光学系统的各部的操作。光学分析装置I的光学系统可以与普通共聚焦显微镜的光学系统相同，其中，从光源2发射的、并且穿过单模光纤3内部的激光(Ex)在光纤的发射端，形成以根据固有NA所确定的角度辐射的光发散，并且在利用准直器4形成平行束之后，光经由二向色镜5、以及反光镜6和7反射而入射进物镜
8。在这方面，为了可以根据用于激发发光颗粒的光的波长适当选择激发光的波长，如该附图所示，在光源2中可以准备两个以上的发光源(激光器)。当用于要同时观测的发光颗粒的激发光的波长相互不同时，从两个以上的发光源同时发射光，并且将其引导进物镜8。通常，在物镜8上方，设置样品容器或其上配置有储液孔10的微平板9，其中，向该样品容器或储液孔10分配I 数十μ L的样品溶液，并且使从物镜8所发射的激光将焦点对准样品容器或储液孔10中的样品溶液，从而形成具有强光强度的区域(激发区域)。作为观测对象的发光颗粒分散或溶解在样品溶液中，并且当发光颗粒进入激发区域时，在滞留在激发区域期间，发光颗粒被激发、并且发射光，其中，作为观测对象的发光颗粒通常是附着有诸如荧光染料等的发光标记物的分子。发射光(Em)在穿过物镜8和二向色镜5之后，被镜11反射、并且通过聚光透镜12被聚光，然后该光穿过小孔13。在这方面，本技术领域的技术人员众所周知，小孔3位于物镜8的焦点位置的共轭位置，因而仅从如图1(B)示意性所示的激光的焦点区域，即激发区域所发射的光穿过小孔13，而阻断来自除焦平面以外的区域的光。图1(B)所示的激光的焦点区域是光检测区域，其中，在该光学分析装置中，光检测区域的有效体积通常约I 10fL，其被称为“共聚焦体积”。通常，在共聚焦体积中，光强度根据在该区域的中心处具有峰值的高斯分布或洛伦兹分布来分布，并且有效体积是以光强度减小至峰值强度的Ι/e2的面为界的近似椭圆形的体积。然后，以一部分波长带的光被二向色镜14a反射、并且其余波长带的光穿过二向色镜14a的方式，根据波长带分割穿过小孔13的光，并且分割光的各成分穿过相应屏障滤波器14(其中，仅选择特定波长带的光成分)，并且被引导进多模光纤15，从而到达相应光电检测器16，并且在向时序电信号的转换之后，将信号输入给计算机18，在计算机18中，以稍后说明的方式执行用于光学分析的处理。对于光电检测器16，优选使用可用于光子计数的超高灵敏度光电检测器，从而使得可以检测来自发一个光颗粒的光，例如，来自一个或数个荧光染料分子的微弱光。 尤其在以上述结构进行扫描分子计数方法的情况下，在上述光学分析装置的光学系统中还设置这样一种机构，该机构用于改变光学系统的光路，以利用光检测区域来扫描样品溶液的内部，即移动样品溶液内的焦点区域，即光检测区域的位置。对于用于移动光检测区域的位置的该机构，例如，可以采用如图1(C)示意性所示的、改变反光镜7的方向的镜面反射器17。镜面反射器17可以与普通激光扫描型显微镜上所装配的检流镜装置的镜面反射器相同。另外，为了获得光检测区域的位置的想要的移动模式，在计算机18的控制下，与光电检测器16的光检测协调一致地驱动镜面反射器17。可以从圆形、椭圆形、矩形、直线和曲线形轨迹、或者它们的组合中任意选择光检测区域的位置的移动轨迹(可以设计计算机18中的程序，从而使得可以选择各种移动模式)。在这方面，尽管未示出，但是通过上下移动物镜8，可以在垂直方向上移动光检测区域的位置。注意，根据用于改变光学系统的光路来移动光检测区域的位置、而不是移动样品溶液的结构，在样品溶液中实质上不会发生机械振动和流体动力作用，因而变得可以消除动力作用对要观测的对象的影响，从而实现稳定测量。就此而论，在仅进行诸如FCS、FCCS、FIDA等的光学分析方法的情况下，不必设置用于改变反光镜7的方向的机构。另外，对于附加结构，在显微镜的台(未示出)上，可以设置用于移动微平板9的水平位置的台位置改变设备17a，以改变要观测的储液孔10。可以通过计算机18控制台位置改变设备17a的操作。在发光颗粒通过多光子吸收来发射光的情况下，将上述光学系统用作多光子显微镜。在这种情况下，由于仅从激发光的焦点区域(光检测区域)发射光，因此可以去除小孔
13。此外，在发光颗粒由于化学发光或生物发光现象而在无需激发光的情况下发射光的情况下，可以省略用于生成激发光的光学系统2-5。在发光颗粒由于磷光或散射光而发射光时，可以直接使用上述共聚焦显微镜的光学系统。A.扫描分子计数方法的本发明实施例如在“发明内容”中所述，在一个方面，有利地与扫描分子计数方法相结合来实现本发明的方法。换句话说，可以认为本发明的一个实施例是扫描分子计数方法的改进。下面说明根据扫描分子计数方法的本发明的实施例。1.扫描分子计数方法的原理诸如FCS、FCCS, FIDA等的光谱分析技术的优点在于，与传统生物化学分析技术相t匕，所需样品量十分�。⑶铱梢钥焖俳胁馐�。然而，在诸如FCS、FCCS、FIDA等的这些光谱分析技术中，主要基于荧光强度波动来计算要观测的颗粒的浓度和特性，因此，为了获得精确的测量结果，样品溶液中要观测的颗粒的浓度或数量密度应处于下面的水平:使得如图12(A)示意性所绘制的一样，在荧光强度测量期间，在光检测区域CV中始终存在约一个要观测的颗粒，从而使得如该附图右侧所示，可以在测量期始终检测到明显的光强度(光子计数)。当要观测的颗粒的浓度或数量密度低于该水平，例如处于如图12(B)所示的要观测的颗粒很少进入光检测区域CV中的水平时，如该附图右侧所示，在测量期的一部分中可能不会出现明显的光强度信号(光子计数)，因而光强度波动的精确计算将变得困难。另夕卜，当要观测的颗粒的浓度明显低于在测量期间在光检测区域内部始终存在约一个要观测颗粒的水平时，光强度波动的计算将会受到背景的影响，并且测量期将变长，以获得足以用于计算的大量的光强度数据(光子计数)。然后，在日本2010-044714号专利申请和日本PCT/JP2011/53481号专利申请中，本申请的申请人提出了基于新原理的“扫描分子计数方法”，其中，即使在要观测的颗粒的浓度低于诸如FCS和FIDA等的上述光谱分析技术所要求的水平的情况下，该新原理也使得能够检测诸如数量密度或浓度等的要观测颗粒的特性。在该扫描分子计数方法中，简而言之，作为要进行的处理，如图2示意性所示，通过驱动用于移动光检测区域的位置来改变光路的机构(镜面反射器17)，在移动样品溶液中的光检测区域CV的位置(也就是说，利用光检测区域CV扫描样品溶液的内部)的同时进行光检测。然后，例如，如图2(A)所示，在移动光检测区域CV期间(该附图中直到t2的时间)，当光检测区域CV经过存在一个发光颗粒的区域时(tl)，从发光颗粒发射光，并且如图2(B)所示，出现具有明显光强度的脉冲形式信号(Em)。因此，在如上所述执行光检测区域CV的位置的移动和光检测期间，通过逐一检测如图2(B)所示出现的各脉冲形式信号(明显的光强度)，分别地检测到发光颗粒，并且通过对其数量进行计数，可以获取与存在于测量区域中的发光颗粒的数量、浓度或数量密度有关的信息。在本发明的光学分析技术的原理中，不进行诸如荧光强度波动的计算等的统计计算处理，并且逐一检测发光颗粒，因此，即使在具有处于在FCS、FCCS、FIDA等中不可进行足够精确的分析的水平的低颗粒浓度的样品溶液中，也可获取与颗粒的浓度或数量密度有关的信息。2.根据本发明的两个以上种类的发光颗粒的区分的方式在进行结合本发明的方法的扫描分子计数方法时，首先，根据上述原理，对于包含两个以上种类的发光颗粒的样品溶液，随着时间进展，分别同时进行两个以上波长带的光强度(光子计数)的测量，并且在各所测量出的波长带的时序光强度数据(光子计数数据)中逐一检测与发光颗粒相对应的脉冲形式信号，此后，在所检测到的脉冲形式信号中，检测在至少两个所选择的波长带的时序光强度数据上所同时生成的脉冲形式信号。认为这些同时生成的脉冲形式信号与在所有所选择的波长带中具有发光波长的一个发光颗粒相对应(在所选择的波长带中具有不同发光波长的发光颗粒同时进入共聚焦体积(CV)，这非�：奔�)，因此，可以将同时生成的脉冲形式信号识别为样品溶液中所包含的发光颗粒中的一个种类的发光颗粒的信号，而可以将除同时生成的脉冲形式信号以外的脉冲形式信号识别为其他种类的发光颗粒的信号。作为一种方式，在获取两个以上种类的颗粒的诸如各自是否存在及各自的数量密度或浓度等的信息时，有利地，可以使用根据上述本发明的检测在所选择的波长带中同时生成的脉冲形式信号以识别发光颗粒的方法。具体地，例如，在如图3(A)所示包含发射波长I的光的颗粒a、发射波长II的光的颗粒b、以及发射波长I和波长II的光的颗粒c的样品溶液的情况下，如图3(B)所示，当颗粒a穿过CV时(tl)，仅在波长I的时序光强度数据上出现脉冲形式信号；当颗粒b穿过CV时(t2)，仅在波长II的时序光强度数据上出现脉冲形式信号；并且当颗粒c穿过CV时(t3)，在波长I和波长II两者的时序光强度数据上出现脉冲形式信号。因此，通过检测在波长I和波长II两者的时序光强度数据上同时生成的脉冲形式信号，可以基于时序光强度数据识别颗粒a C。而且，通过分别计数颗粒a c的脉冲形式信号的数量，变得可以分别获取该颗粒的数量密度或浓度、或者其他信息。在分子的结合反应或分子的解离反应的检测中，可以有利地使用时序光强度数据中的信号的上述识别方法。例如，在测试特定颗粒a和另一颗粒b的结合反应是否存在和/或程度的情况下，利用发射波长I的光的发光物(代表性的为荧光染料，以下相同)标记颗粒a，而利用发射波长II的光的发光物标记颗粒b。在这种情况下，如图3 (C)所示，当颗粒a或颗粒b自身穿过CV时(tI或t2)，仅分别在波长I或波长II中出现信号，但是，当颗粒a和颗粒b形成结合体(a+ b)、并且该结合体穿过CV时(t3)，在波长I和波长II中同时生成信号，因此，通过检测或计数同时生成的信号，可以识别颗粒a和颗粒b的结合反应、或者估计结合反应的强度。可以利用这类方式来测试的结合反应的例子有，两个蛋白质之间的相互作用、靶核酸的杂交。此外，在测试特定颗粒的分解反应是否存在以及程度时，在分解之前准备颗粒C，其中，颗粒c附着有发射波长I的光的标记物和发射波长II的光的标记物这两者，然后进行要测试的分解反应。这里，如果通过分解反应分解了颗粒C，因而产生了附着有发射波长I的光的标记物的颗粒a和附着有发射波长II的光的标记物的颗粒b，然后，当如图3(D)所示，颗粒a或b穿过CV时(tl或t2)，仅在波长I或波长II中出现信号；但是，当未分解的颗粒c穿过CV时(t3)，在波长I和波长II两者中同时生成信号。因此，通过将同时生成的信号的频率与仅在波长I和II中的一个中所生成的信号的频率进行比较，可以识别颗粒c的分解反应、或者估计该分解反应的强度。可以利用这一方式来测试的分解反应的例子有:利用特别分解核酸的限制酶或聚合酶的分解反应、或者利用蛋白酶的分解反应。此外，作为可选方式，当在样品溶液中包含作为观测对象的发光颗粒、以及具有与要观测的颗粒相同的发光波长的杂质时，在仅选择来自要观测的颗粒的信号、或者排除来自除要观测的颗粒以外的颗粒的信号的情况下，有利地使用根据上述本发明的用于检测在所选择的波长带中所同时生成的脉冲形式信号、并且识别发光颗粒的方法。例如，如图3(E)示意性所示，在检测样品溶液中的发射波长I的光的颗粒a的情况下，即在颗粒a是要观测颗粒的情况下，如果存在同样发射波长I的光、并且还发射波长II的光的杂质X(杂质X是一个发光颗粒。)，则当颗粒a穿过CV时(tl),仅在波长I中出现信号,而当杂质X穿过CV时(t2)时，在波长I和II两者中出现信号，如图3(F)所示。因此，通过将在对该样品溶液的光测量中所获得的波长I和波长II的时序光强度数据上所同时生成的信号识别为杂质X、并且参考仅在波长I的时序光强度数据上所生成的信号，可以识别是否存在颗粒a、以及获取与颗粒a的数量密度或浓度有关的信息。例如，在检测作为诸如血样等的包含各种杂质的生物材料中的低浓度观测对象的颗粒的情况下，有利地使用该方式。此外，尽管未示出，但是与上述方式相反，当要观测颗粒是发射波长I和II的光的发光颗粒、并且杂质仅发射波长I或II的光时，通过仅参考在波长I和II的时序光强度数据上所同时生成的信号，可以识别是否存在要观测颗粒、以及获取与要观测颗粒的数量密度或浓度有关的信息。在这方面，尽管图3的例子示出在两个波长带中来测量光，但是可以在三个以上的波长带中进行光的测量，然后，在所获得的各个波长带的时序光强度数据中，可以进行在所选择的波长带中同时生成的信号的检测和发光颗粒的种类的识别，并且应该理解，这一情况属于本发明的范围。3.扫描分子计数方法的操作处理具体地，在利用如图1㈧所示的光学分析装置I的结合本发明的结构的扫描分子计数方法的实施例中，进行(I)用于准备包含发光颗粒的样品溶液的处理、(2)用于测量样品溶液的光强度的处理、以及(3)用于分析所测量出的光强度的处理。图4以流程图形式示出本实施例中的操作处理。(I)样品溶液的准备
本发明的方法中的要观测颗�？梢允侨我饪帕＃灰淇稍谘啡芤褐蟹稚⒑妥杂稍硕纯桑钊绫蝗芙獾姆肿拥龋⑶腋每帕？梢允抢缟锓肿樱吹鞍字�、多肽、核酸、脂肪、糖链、氨基酸等及其聚合体，还可以是病毒、细胞、金属胶体或其他非生物分子(通常，样品溶液是水溶液，但是不局限于此，并且可以是有机溶剂或其他任意液体)。另外，要观测颗�？梢允亲陨矸⑸涔獾目帕＃蛘呖梢允且匀我夥绞礁阶庞蟹⒐獗昙俏�(荧光分子、磷光分子、化学发光或生物发光分子)的颗粒。例如，在测试两个颗粒的结合反应中，注意，样品溶液可以是以下面的方式所准备的溶液:在将发射特定波长带的光的发光标记物附着至颗粒中的一个、并且将发射不同波长带的光的不同发光标记物附着至颗粒中的另一个之后，适当混合这两个颗粒，并且使该混合物暴露于导致该结合反应的条件下。另夕卜，在测试一个颗粒的分解反应时，样品溶液可以是以下面的方式所准备的溶液:使附着有发射相互不同的波长带的光的不同发光标记物的颗粒，暴露于导致该分解反应的条件下。此外，在检测包含杂质的溶液中的某个特定颗粒时，可以向该特定颗粒附着一个发光标记物或者发光波长相互不同的两个发光标记物。而且，可以基于样品中的发光颗粒的发光波长带，适当选择要检测的波长带。实验操作者可以适当选择如何选择作为样品溶液中的观测对象的颗粒、如何将发光标记物附着至作为观测对象的颗粒、或者如何选择所检测的波长，并且应该理解，本技术领域的技术人员可以选择要观测颗粒或发光标记物和所检测波长带的各种组合来实现本发明的方法，并且任一情况都属于本发明的范围，只要根据本发明进行发光颗粒的识别即可。(2)样品溶液的光强度的测暈除在测量期间驱动镜面反射器17以在样品溶液内移动光检测区域的位置(来在样品溶液中进行扫描)(图4的步骤100)以外，在测量两个以上的波长带的光强度时，可以以与FCCS中的光强度的测量处理相同的方式，进行根据本实施例的扫描分子计数方法的光学分析中的光强度的测量。在该操作处理中，通常，在将样品溶液分配入微平板9的储液孔10中、并且将其置于显微镜的台上之后，当用户向计算机18输入测量开始的命令时，计算机18执行存储在存储装置(未示出)中的程序(用于改变光路以移动样品溶液中的光检测区域的位置的处理和用于在移动光检测区域的位置过程中检测来自光检测区域的光的处理)，然后开始利用激发光照射样品溶液中的光检测区域、并且测量光强度。当开始测量时，根据程序，在计算机18的操作处理的控制下，从光源2发射样品溶液中的发光颗粒的激发波长的光。在本实施例中，特别地，由于检测两个上述波长带的光，所以选择从光源2所发射的激发光的波长，以使得从发光颗粒发射要检测的两个以上波长带的光。因此，尤其在发光颗粒利用一个波长带的激发光仅发射一个波长带的荧光时，同时发射两个以上波长带的激光。另一方面，镜面反射器17根据程序，在计算机18的操作处理的控制下驱动镜7 (检流镜)来移动储液孔10中的光检测区域的位置，并且与此同时，光电检测器16将所检测到的光顺次转换成电信号，并且将其传送给计算机18，计算机18根据所传送的信号生成时序光强度数据，并且以任意方式存储该数据。在这方面，在本实施例中，两个以上的光电检测器16各自检测相互不同波长带的光，因而针对每一所检测到的相互不同的波长带生成时序光强度数据。另外，光电检测器16通常是可以检测单个光子的到达的超高灵敏度光电检测器，因此，光的检测可以是以下面的方式所进行的光子计数:在预定时间期间，每隔预定单位时间(BIN ΜΕ)，例如每隔10μ s，顺次测量到达光电检测器处的光子的数量，因而时序光强度数据是时序光子计数数据。光强度的测量期间的光检测区域的位置的移动速度，可以是例如实验性的或者符合分析目的所任意设置的预定速度。在基于所检测到的发光颗粒(或者这里的要观测的颗粒，以下相同)的数量来获取与数量密度或浓度有关的信息的情况下，需要光检测区域穿过的区域大小或体积，因此，优选以使得能够把握移动距离的方式来进行光检测区域的位置的移动。在这方面，由于如果所经过的时间与光检测区域的位置的移动距离大体成正比则测量结果的解释会变得容易，所以尽管不限于此，但是基本上优选恒定移动速度。这样，对于光检测区域的位置的移动速度，为了根据所测量出的时序光强度数据或发光颗粒的数量的计数来对要观测的发光颗粒进行定量精确单独检测，优选将该移动速度设置成比发光颗粒的自由运动，即布朗运动的移动速度更快的值。由于本实施例中作为观测对象的发光颗粒是分散或溶解在溶液中、并且自由随机运动的颗粒，所以其位置由于布朗运动而随着时间移动。因此，当光检测区域的位置的移动速度慢于颗粒由布朗运动所引起的移动时，颗粒在 如图5(A)示意性所示的区域中自由移动，因而光强度随机变化(光检测区域中的激发光强度从该区域中心的峰值其外侧而减小)，从而变得难以确定与各发光颗粒相对应的明显光强度变化(表示来自发光颗粒的光的信号)。然后，如图5(B)所示，优选将光检测区域的位置的移动速度设置成快于颗粒的布朗运动的平均运动速度(扩散运动速度)，从而使得颗粒以近似直线跨过光检测区域，因而如图5(C)的上面的行所示，在时序光强度数据中，与各颗粒相对应的光强度的变化曲线变得几乎一致(当发光颗粒以近似直线穿过光检测区域时，光强度变化的曲线类似于激发光强度分布。)，并且可以容易地确定各发光颗�：凸馇慷戎涞亩杂叵�。具体地，通过均方位移的关系的公式给出具有扩散系数D的发光颗粒通过布朗运动穿过半径为Wo (共聚焦体积)的光检测区域(共聚焦体积)所需的时间Λ t:(2ffo) 2=6D.Δ t —(I)因而Δ t= (2ffo) 2/6D —(2),因此，通过布朗运动移动的发光颗粒的速度(扩散运动速度)Vdif近似为:Vdif=2ffo/At=3D/ffo —(3)然后，参考以上，可以将光检测区域的位置的移动速度设置成远快于Vdif的值。例如，在预期发光颗粒的扩散系数约为D=2.0x 1K Vdif为j ] 0'，rn/s的情
况下，假定Wo约为0.62 μ m,因此，可以将光检测区域的位置的移动速度设置成Vdif的10倍以上，例如，15mm/s。在这方面，当发光颗粒的扩散系数未知时，可以通过设置光检测区域的位置的各种移动速度来重复执行预先实验，以找到光强度变化的曲线变成预期的曲线(通常，类似于激发光强度分布)的条件，来确定光检测区域的位置的适当移动速度。(3)光强度的分析当通过上述处理获得了样品溶液的时序光强度数据时，可以通过根据存储在存储装置中的程序的处理，在计算机18中进行下述光强度的分析。(I) 一个观测颗粒的检测当如图5(B)所示，穿过光检测区域的一个观测颗粒的轨迹近似直线时，时序光强度数据中与该观测颗粒相对应的信号的光强度变化具有反映光检测区域中的光强度分布(通过光学系统所确定的)的钟形曲线。因此，当超过适当设置的阈值1的光强度持续的时间宽度△ τ在预定范围内时，可以将具有该光强度曲线的信号判断为是与穿过了光检测区域的一个颗粒相对应，从而检测到一个发光颗粒。此外，当可以将光检测区域中的光强度分布假定为高斯分布时:I=A.exp (_2t2/a2) ---(4)，并且当通过对显著光强度的曲线(可被明确判断为不是背景的曲线)拟合公式
(4)所计算出的强度A和宽度a在各自的预定范围内时，可以将该光强度的曲线判断为是与穿过了光检测区域的一个颗粒相对应，从而做出一个发光颗粒的检测(在该分析中，可以作为噪声或杂质而忽略具有预定范围外的强度A和宽度a的曲线。)。(ii)发光颗粒的计数作为操作方法的例子，在根据时序光强度进行发光颗粒的集中检测和计数时，对时序光信号数据(图5 (C)的上面的行“检测结果(未处理)”)进行平滑化处理(图4的步骤110，图5(C)的中间的行“平滑化”)。尽管由发光颗粒所发射的光是随机的，因而在数据值中会生成微小时间的间隙，但是通过平滑化处理可以忽视数据值中的这类间隙。可以通过例如移动平均方法(例如,邻域平均方法和Savinsky-Golay算法)、百分位数滤波方法或FFT滤波方法来进行平滑化处理。在这方面，可以根据光强度数据获取中的光检测区域的位置的移动速度(扫描速度)和/或BIN ΜΕ来适当设置进行平滑化处理时的参数，例如，移动平均方法中的一次平均化中的数据点的数量、移动的平均次数等。接着，在平滑化处理之后的时序光强度数据上，为了检测存在明显脉冲形式信号(以下称为“脉冲信号”)的时间区域(脉冲存在区域)，计算平滑化处理之后的时序光强度数据对时间的第一微分值(步骤120)。在如图5(C)所示，中间下面的行“时间微分”中的时序光信号数据的时间微分值中，值的变化在该信号值变化时增大，因而有利地可以通过参考时间微分值确定 显著信号的起点和终点。此后，在时序光强度数据上顺次检测显著脉冲信号，并且判断所检测到的脉冲信号是否是与发光颗粒相对应的信号。具体地，首先，在时序光强度数据的时序时间微分值数据上，通过顺次参考时间微分值，搜索和确定一个脉冲信号的起点和终点，从而指定脉冲存在区域(步骤130)。当指定了一个脉冲存在区域时，对脉冲存在区域中的平滑化后的时序光强度数据进行钟形函数的拟合(图5(C)中下面的行“钟形函数拟合”)，然后，计算诸如峰值强度、Imax、脉冲宽度(半峰全宽)、w、(最小二乘法的)拟合中的相关系数等的钟形函数的脉冲的参数(步骤140)。在这方面，尽管拟合所使用的钟形函数通常是高斯型函数，但是可以是Lorentz型函数。而且判断所计算出的钟形函数的参数，是否在针对根据在一个发光颗粒穿过光检测区域时所检测到的脉冲信号所绘制出的钟形曲线的参数所假定的各自的范围内，即脉冲的峰值强度、脉冲宽度和相关系数中的每一个是否都在相应的预定范围内(步骤150)。然后，将如图6(A)左侧所示的、所计算出的钟形函数的参数被判断为在与一个发光颗粒相对应的光信号所假定的范围内的信号，判断为与一个发光颗粒相对应的信号，从而检测到一个发光颗粒，并且对一个颗粒进行计数(合计颗粒的数量。步骤160)。另一方面，作为噪声忽视如图6(A)右侧所示的、所计算出的钟形函数的参数不在假定范围内的脉冲信号。在时序光信号数据的整个区域中重复进行上述步骤130 160的处理中的脉冲信号的搜索和判断，并且无论何时检测到一个发光颗粒，都将其计数作为一个颗粒。而且，当完成了时序光信号数据的整个区域中的脉冲信号的搜索时(步骤170)，将至此为止所获得的颗粒的计数值当作为在时序光强度数据中所检测到的发光颗粒的数量。特别地，在本实施例中，可以在相互不同波长带的各时序光强度数据中进行上述步骤110 170，并且可以在各波长带中计数与发光颗粒相对应的脉冲信号的数量。在这方面，可以通过除上述方法以外的任意方法来进行用于从时序光强度数据分别检测并计数发光颗粒的信号的处理。(iii)同时生成的信号的检测和计数当如上所述完成两个以上波长带的时序光强度数据中的与发光颗粒相对应的信号(脉冲信号)的检测时，在所检测到的信号中，检测在所选择的波长带的时序光强度数据上所同时生成的信号。根据各个信号的生成期是否相互重叠，可以判断是否同时出现特定时序光强度数据中的信号和其他时序光强度数据中的信号。例如，可以以下面的方式具体进行该判断:当在其他波长带(第一波长带:波长I)的时序光强度数据中与发光颗粒相对应的脉冲信号的起点txs和终点txe之间，存在特定波长带(波长II)的时序光强度数据的脉冲信号的起点tys和终点tye中的至少一个时,也就是说，当以下公式中的至少一个成立时，txs<tys<txe —(5a)txs<tye<txe —(5b)判断为生成了在波长I和波长II中同时生成的脉冲信号。而且，通过对时序光强度数据连续重复该判断，可以检测在所选择的波长带的时序光强度数据上所同时生成的所有脉冲信号，并且对脉冲信号的数量进行计数。在这方面，在存在三个以上所选择的波长带的情况下，当存在生成期在所有所选择的波长带中重叠的脉冲信号时，将该脉冲信号判断为同时生成的信号。此外，作为可选方式，当第一波长带中的脉冲信号的峰值时间和其他波长带中的脉冲信号的峰值时间之间的差在预定时间内时，可以判断为这些脉冲信号是同时生成的脉冲信号。(iV)发光颗粒的数暈密度或浓度的分析和判断根据实验的方式，如上所述所检测到的同时生成的信号及其计数值用于各种分析。例如，在如图3(C)所示的用于测试两个颗粒的结合反应的实验中，同时生成的信号是来自两个颗粒的结合体的信号，因此，当检测到同时生成的信号时，这一情况证明发生了两个颗粒的结合反应。而且，由于认为除同时生成的信号以外的信号是与没有进行结合反应的颗粒相对应的信号，所以通过将同时生成的信号的计数值与其他信号的计数值进行比较，变得可以估计两个颗粒的结合反应的强度。例如，在各种环境条件下进行上述光的测量和信号的检测的情况下，同时生成的信号的计数值在特定条件下的相对增大(减小)，意为结合反应的强度或进度的增大(减小)。此外，在如图3(D)所示的用于测试一个颗粒的分解反应的实验中，认为除同时生成的信号以外的信号是在一个颗粒分解时生成的，因而产生仅具有一个发光标记物的颗粒，因此，当检测到除同时生成的信号以外的信号时，这一情况可以可以证明发生了该分解反应(参考下面的注释)。而且，通过将同时生成的信号的计数值与其他信号的计数值进行比较，变得可以估计该分解反应的强度、进度等。例如，在各种环境条件下进行上述光的测量和信号的检测的情况下，同时生成的信号的计数值在特定条件下的相对减�。馕欧纸夥从Φ那慷然蚪鹊脑龃�。[(注释)然而，如稍后所述的实施例所示，在实际实验中，难以使相互不同波长的激发光的CV在空间上完全一致，因此，在光检测区域中可能产生仅照射一个波长的激发光的区域。在这种情况下，在除同时生成的信号以外的信号中，包括如果相互不同波长的激发光的照射区域一致则应为同时生成的信号的信号。也就是说，在除同时生成的信号以外的信号中，在图3(c)的结合反应的测试的情况下，可能包括两个颗粒的结合体的信号，而且在图3(D)的分解反应的测试的情况下，可能包括分解之前的颗粒的信号。因此，在图3(C)的结合反应的测试中，不能将除同时生成的信号以外的信号的数量本身判断为结合体的绝对数量，并且在图3(D)的分解反应的测试中，不能仅根据是否存在除同时生成的信号以外的信号来判断是否存在分解反应。然而，通过将同时生成的信号的计数值与其他信号的计数值进行比较，可以估计结合反应或分解反应的强度和进度的相对变化。]此外，在包含两个以上种类的发光颗粒的样品溶液中，在与同时生成的信号相对应的发光颗粒是观测颗粒的情况下，通过检测同时生成的信号，可以确认是否存在观测颗粒，并且由于认为同时生成的信号的计数值与观测颗粒的数量密度或浓度成正比，所以通过参考计数值，变得可以获取与观测颗粒的数量密度或浓度有关的信息。此外，相反地，在同时生成的信号是除观测颗粒以外的颗�：�/或杂质的信号的情况下，根据是否存在除同时生成的信号以外的信号，确认是否存在观测颗粒，并且通过从观测颗粒的发光波长的时序光强度数据的信号的计数值中排除同时生成的信号的计数值，可以更精确地获取观测颗粒的数量密度或浓度的信息。[注意，在实际实验中，难以使相互不同波长的激发光的CV在空间上完全一致以在光检测区域中产生仅照射一个波长的激发光的区域，因此，仅根据是否存在除同时生成的信号以外的信号，不能证明是否存在观测颗粒。然而，除同时生成的信号以外的信号的增多或减少 ，与观测颗粒的增多或减少相对应，因此，可以根据除同时生成的信号以外的信号的计数值的变化，检测样品溶液中的观测颗粒的增多或减少。]可以使用各个发光颗粒的计数值和在时序光强度数据的获取期间的光检测区域穿过的整个区域的体积，确定时序光强度数据中的发光颗粒的数量密度或浓度。然而，光检测区域的有效体积根据激发光或检测光的波长、镜头的数值光圈和光学系统的调节状态而变化，因此，通常难以根据设计参数值来计算光检测区域的有效体积，而且计算光检测区域穿过的总体积也不容易。因此，通常在与要测试的样品溶液的测量相同的条件下，利用具有已知发光颗粒浓度的溶液(基准溶液)如上所述进行光强度测量、颗粒的检测及其计数，然后，根据所检测到的发光颗粒的数量和基准溶液中的发光颗粒的浓度，可以确定光检测区域穿过的整个区域的体积，即所检测到的数量和发光颗粒的浓度之间的关系。优选地，基准溶液的发光颗�？梢允蔷哂杏胂嘤Ψ⒐饪帕Ｏ嗤牟ǔぬ匦缘姆⒐獗昙俏�(荧光染料等)。具体地，例如，假定在颗粒浓度(数量密度)C的基准溶液中，所检测到的发光颗粒的数量是N，如下给出光检测区域穿过的整个区域的体积Vt:Vt=N/C(6).
可选地，准备多个不同浓度的溶液作为基准溶液，而且对每一溶液都进行测量，然后，将所计算出的Vt的平均值确定为光检测区域穿过的整个区域的体积vt。因此，当给出Vt时，如下给出颗粒的计数结果为η的样品溶液的发光颗粒的浓度(数量密度)C:c=n/Vt ---(7)在这方面，代替上述方法，可以通过使用例如FCS和FIDA的任意方法给出光检测区域的体积和光检测区域穿过的整个区域的体积。此外，在本实施例的光学分析装置中，可以将与用于光检测区域的假定运动模式的各种标准颗粒的浓度C和颗粒数量N之间的关系(公式￠))有关的信息，预先存储在计算机18的存储设备中，从而使得装置的用户可以在进行光学分析时适当使用所存储的与该关系有关的信息。特别地，在计算与同时生成的信号相对应的发光颗粒的数量密度或浓度时，可以准备已知浓度的、在所有选择的波长带中都具有发光波长的发光颗粒的溶液，作为基准溶液，并且可以对通过利用该溶液的光强度的测量所获得的时序光强度数据，进行同时生成的信号的检测和计数，然后，根据计数值和浓度，可以确定光检测区域穿过的区域的总体积Vt0在计算包含两个以上种类的发光颗粒的样品溶液中的各发光颗粒的浓度时，对于与同时生成信号相对应的发光颗粒，可以使用同时生成的信号的计数值，而且对于与除同时生成的信号以外的信号相对应的发光颗粒，可以使用通过根据该发光颗粒的发光波长的波长带的时序光强度数据中的所有信号的计数值减去同时生成的信号的计数值所获得的值。因此，根据在扫 描分子计数方法中联合上述本发明的方法的光学分析方法，与利用一个波长带的光测量的扫描分子计数方法相比，可以获取更多不同信息，另外，在针对包含两个以上种类的发光颗粒的样品溶液根据扫描分子计数方法进行光学分析时，可以获得降低或消除了不必要数据的影响的精确结果。就此而论，应该理解，根据利用上述本发明的方法的扫描分子计数方法，类似于FCS、FCCS、FIDA等，即使利用小量的样品溶液，对于比在诸如FCS、FCCS和FIDA等的、在分析处理中包括统计过程的光学分析技术中可以进行良好测量的水平(通常约InM)更低浓度(数PM的水平)的发光颗粒，也可以获取多种信息。B.FCS等中的本发明的实施例在另一方面，有利地，本发明用于从利用诸如FCS、FCCS和FIDA等的、使用共聚焦显微镜的光学分析技术所测量出的时序光强度数据中消除来自除观测颗粒以外的颗粒的光的信号。具体地，在根据FCS、FCCS, FIDA等的测量中，在在特定种类的发光颗粒是观测颗粒、并且测量覆盖该颗粒的发光波长的波长带(将其当作为“主测量波长带”)的光来生成时序光强度数据的情况下，如果在样品溶液中存在具有在“主测量波长带”中的发光波长的其他发光颗粒或其他杂质(称为“杂质等”)，则对于除“主测量波长带”以外的、覆盖“杂质等”的发光波长的波长带(称为“副测量波长带”)，进行光的测量和时序光强度数据的生成(选择副测量波长带，以使得不会覆盖观测颗粒的发光波长)。根据该结构，当生成“副测量波长带”中的显著信号时，也就是说，当在主测量波长带和副测量波长带中同时生成显著信号时，假定在信号的生成期期间光检测区域中存在“杂质等”。然后，通过从FCS、FCCS、FIDA等所要分析的主测量波长带的时序光强度数据中消除或删除在主测量波长带和副测量波长带中同时生成的信号的生成期期间的数据，将基于降低或消除了杂质等的影响的时序光强度数据，获得FCS、FCCS、FIDA等的更精确的或改善了的计算结果。图7 (A)以流程图形式示出如上所述将本发明的方法应用于FCS等的实施例的处理。参考该附图，首先，以FCS等的常用方式进行光的测量和时序光强度数据的生成(步骤200)。然而，在这种情况下，不仅在主测量波长带中，而且还在副测量波长带中进行光的测量和时序光强度数据的生成(在这方面，在FCCS中，通常选择两个种类的颗粒作为观测颗粒，并且在各颗粒的发光波长中进行光测量，然而，在应用本发明的方法时，任选不同于观测颗粒的两个发光波长的波长带，作为副测量波长带。)。图7(B)示出实际所获得的主测量波长带的时序光强度数据(上面的行)和副测量波长带的时序光强度数据(下面的行)的例子。在该例子中，已知通过将主测量波长带设置成650nm 690nm、并且将副测量波长带设置成565nm 595nm，利用633nm的激发光激发观测颗粒，并且在主测量波长带中进行检测，而利用543nm的激发光激发杂质等，并且在主测量波长带和副测量波长带中进行检测。然后，当杂质等进入光检测区域中时，如该附图所示，在副测量波长带中出现显著信号(与此相对应，在主测量波长带中还观察到光强度(光子计数)增大。)，因此，在脉冲形式信号的生成期，可以判断为在主测量波长带和副测量波长带中出现了同时生成的信号。因此，通过在副测量波长带的时序光强度数据中逐一检测显著脉冲形式信号的生成，来检测同时生成的信号(步骤210)，并且由于假定这些同时生成的信号的生成期(同时生成期)是在光检测区域中存在杂质等的时期，所以将其指定为在稍后要进行的分析处理中将被忽视的“噪声期”。另一方面，将除噪声期以外的时期指定为在光检测区域中存在观测颗粒的时期，即“信号期”(步骤220)。而且，如果在下一分析处理中，可以从分析处理所使用的时序光强度数据中删除“噪声期”(步骤230)，并且使用删除了噪声期的时序光强度数据，以常用方式进行FCS、FCCS、FIDA等的分析运算处理(自相关函数或互相关函数的运算、或者直方图的生成、以及拟合处理)(步骤240)。根据上述结构，由于可以在消除在主测量波长带和副测量波长带中同时生成的信号的生成期(即样品溶液中的杂质等存在于光检测区域中的时期)的数据的同时执行FCS、FCCS和FIDA等的分析运算处理，所以预期能够提高通过该分析运算处理所获得的结果的精度。为了验证上述本发明的有效性，进行了下述实验。在这方面，应该理解，下面的实施例仅示出本发明的有效性，并非想要限制本发明的范围。实施例1用于检测利用两个不同颜色的荧光染料所标记的寡核苷酸的实验根据结合本发明的方法的扫描分子计数方法，利用包含不不同比例的、利用两个不同颜色的荧光染料所标记的寡核苷酸(双标记寡核苷酸)和利用单个颜色的荧光染料所标记的寡核苷酸(单标记寡核苷酸)的样品溶液，在两个波长带中进行光测量，并且在所获得的时序光强度数据中进行同时生成的信号(同时生成脉冲)的检测和计数，从而验证利用本发明的方法可测量的双标记寡核苷酸(与同时生成脉冲相对应的发光颗粒)的浓度范围。作为对照实验，还验证利用FCCS可测量的双标记寡核苷酸的浓度范围。对于样品，如下准备双标记寡核苷酸和单标记寡核苷酸:(双标记寡核苷酸)-488pA647:Alexa488_aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa_Alexa647[利用荧光染料Alexa488修饰了5’端、并且利用荧光染料Alexa647修饰了 3’端的寡核苷酸](单标记寡核苷酸)-488pA:Alexa488_aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa[利用Alexa488修饰5’端的寡核苷酸]-pA647:aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-Alexa647[利用Alexa647修饰了3’端的寡核苷酸]
如下准备样品溶液:将上述各寡核苷酸溶解成每IOmMTris-HCL (pH8.0)中100 μ Mo随后，使用包含0.05%(w/w)的吐温20的磷酸缓冲液稀释各个溶液,从而准备包含均为IOpM的488pA和pA647的溶液α、以及包含IOpM的488ρΑ647的溶液β。然后以体积比100:0、50:50、10:90、5:95和0:100混合溶液α和溶液β，从而准备针对各个荧光染料，双标记寡核苷酸488ρΑ647与单标记寡核苷酸(488ρ�。薛�647)的比为100%、50%、10%、5%和0%的溶液。就此而论，当利用488nm的激发光激发Alexa488时，在波长带510 560nm中检测到其的荧光。另一方面，当利用633nm的激发光激发Alexa647时，在波长带650 690nm中检测到其的荧光。在光测量和分析中，使用装配有共聚焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测量设备MF-20(奥林巴斯公司)作为光学分析装置，并且根据上述“A.(2)样品溶液的光强度的测量”中所述的方式，获取针对上述各个样品溶液的时序光强度数据(光子计数数据)。此时，使用488nm的激光(200 μ W)和633nm的激光(1000 μ W)作为激发光，，并且使用带通滤波器，针对488nm和633nm的激发光分别同时分开测量510 560nm和650 690nm这两个波长带的光,而且针对488nm的激发光和633nm的激发光各自生成时序光强度数据。将样品溶液中的光检测区域的位置的移动速度设置成15mm/秒，将ΒΙΝ ΜΕ设置成10 μ sec，并且对于各个样品溶液，分别进行2秒的测量3次。在光强度测量之后，根据上述“A.(3) (ii)发光颗粒的计数”所述的过程，对利用各样品溶液所获取的每一波长带的时序光强度数据进行平滑化处理，并且在确定平滑化后的数据中的脉冲信号的起点和终点之后，通过最小二乘法进行各脉冲信号的高斯函数的拟合，并且确定峰值强度、脉冲宽度(半峰全宽度)和相关系数(高斯函数中的)。然后，仅将满足以下条件的脉冲信号判断为与发光颗粒(双标记寡核苷酸和单标记寡核苷酸)相对应的信号:20 μ sec.< 脉冲宽度〈400 μ sec.
峰值强度>1 (光子 / 1() sec.) —(A)相关系数>0.95并且作为噪声忽视不满足上述条件的脉冲信号，然后，计数被判断为与发光颗粒相对应的信号的信号的数量，作为“脉冲的数量”。随后，在对633nm的激发光和488nm的激发光的数据上的被判断为与发光颗粒相对应的脉冲信号进行比较时，当脉冲信号之间的峰值(最大值)的时间的差在30微秒内时，将这些脉冲信号判断为同时生成的脉冲信号(同时生成脉冲信号)，并且计数它们的数量。而且，使用同时生成脉冲的数量Nab、488nm的激发光的数据上的脉冲的数量Na和633nm的激发光的数据上的脉冲的数量Nb，通过下面的公式计算同时生成脉冲信号比:(同时生成脉冲信号比)=Nab/(Na+Nb-Nab) — (8) 在对照实验的FCCS中，利用与上述相同的样品溶液，在与上述激发波长和检测波长相同的条件下，以常用FCCS方式分别测量由488nm的激发光所导致的荧光和由633nm的激发光所导致的荧光，生成各自的时序光强度数据，并且计算由488nm的激发光所导致的荧光的自相关函数和由633nm的激发光所导致的荧光的自相关函数、以及由488nm的激发光所导致的荧光和由633nm的激发光所导致的荧光的互相关函数、并且通过拟合确定平均颗粒数量。对于每一样品溶液，重复3次每一次20秒的测量。此外，为了与上述同时生成脉冲信号比进行比较，通过下面的公式计算DCC(互相关度)。
DCC=nab/ (na+nb-nab) —(9)其中，nab是根据互相关函数所计算出的平均颗粒数量，na是根据由488nm的激发光所导致的荧光的自相关函数所计算出的平均颗粒数量，并且nb是根据由633nm的激发光所导致的荧光的自相关函数所计算出的平均颗粒数量。图8示出通过进行根据本发明的方法的扫描分子计数方法所获得的、488nm的激发光的光子计数数据(a)、633nm的激发光的光子计数数据(b)、对这些数据进行平滑化处理之后的数据(C)、以及通过拟合的被判断为发光颗粒的信号的脉冲信号(d)的部分。特别地，通过参考图8(d)可知，在488nm的激发光的数据上的脉冲信号(长短交替的虚线)和633nm的激发光的数据上的脉冲信号(实线)中观察同时生成的信号(在该附图中，以同时生成的信号所表示的信号)。将这些同时生成的脉冲信号认为是从双标记寡核苷酸所发射的光的信号，因此，示出通过本发明的方法进行与其他的颗粒的区分，可以检测利用两个不同颜色的荧光染料所标记的颗粒。图9是用于针对样品溶液中的双标记寡核苷酸的比例(混合双标记寡核苷酸百分比)，分别绘制通过根据本发明的方法的扫描分子计数方法的处理所计算出的、包含以各种比例混合的双标记寡核苷酸的样品溶液中的同时生成脉冲信号比(A)、以及根据FCCS所计算出的、包含以各种比例混合的双标记寡核苷酸的样品溶液中DCC(B)。参考这些附图，在通过本发明的方法的扫描分子计数方法所获得的结果(A)中，同时生成脉冲信号比与整个测试区域中的混合双标记寡核苷酸百分比成正比，其中，三个测量的离差也非常小。由于在混合双标记寡核苷酸百分比=100%时，双标记寡核苷酸浓度为ΙΟρΜ，并且在混合双标记寡核苷酸百分比=5%时，双标记寡核苷酸的浓度为0.5pM，所以图9(A)的结果说明，根据本发明，可以检测到约0.5pM的双标记发光颗粒，并且还可以确定其浓度(参考下面的(注释))。另一方面，在FCCS的结果(图9(B))中，当混合双标记寡核苷酸百分比小于50%时，混合双标记寡核苷酸百分比和DCC之间的比例关系丧失，并且离差也变大。因此示出: 根据本发明，在显著低于通过FCCS可确定的范围的浓度范围内，可以实现双标记发光颗粒的检测及其浓度的确定(也就是说，示出:在将同时生成脉冲信号识别为观测颗粒、并且将其他信号识别为除观测颗粒以外的颗粒的情况下，在比以往更低的浓度范围内，也可以检测观测颗粒、并且可以确定其浓度)。此外，上述结果示出，根据本发明，在两个以上种类的发光颗粒的相互作用(结合反应或分解反应)的测试中，即使在样品溶液中的发光颗粒的浓度显著低于FCCS可使用的范围的情况下、或者在相互作用微弱因而可能仅产生FCCS难以检测到的相对少量的化合产物或分解产物的情况下，也可以检测是否存在发光颗粒的相互作用和/或估计该相互作用的强度。[(注释)在实际实验中，由于共聚焦显微镜的光学系统的色差，通常难以使得利用两个以上波长的激发光所照射的区域(CV)完全一致。因此，在光检测区域中，生成仅照射两个以上的波长中的任一个波长的光的区域，因此，当双标记发光颗粒进入这样的区域中时，在这两个以上的波长带的时序光强度数据上不会同时生成信号。因此，如图9(A)可见，同时生成脉冲信号比可能小于在理论上预期形成样品溶液中的双标记发光颗粒的比例的值。然而，通过该附图可知，双标记发光颗粒的量和同时生成脉冲信号的量之间的关系成正比或一一对应关系，因此，可以基于同时生成脉冲信号的量，估计样品溶液中的双标记发光颗粒的增多或减少、或者浓度。]实施例2
包含杂质的样品溶液中的观测颗粒的浓度的检测已经验证，在通过扫描分子计数方法来检测包含具有与观测颗粒相同的发光波长的杂质的样品溶液中的观测颗粒的浓度时，本发明的方法提高了精度。对于样品，使用荧光染料TAMRA作为观测颗粒，并且使用荧光染料ATT0590作为杂质的模型。当利用543nm的激发光激发TAMRA时，在波长带565 595nm中检测到其荧光。另外，当利用543nm的激发光激发ATT0590时，在波长带565 595nm和波长带650 690nm中检测到荧光。此外，对于样品溶液，准备在包括0.05%吐温20的磷酸缓冲液中包含IOOpM的ATT0590和OpM、IpM和IOpM的TAMRA的溶液。另外,对于对照溶液,准备没有ΑΤΤ0590 的、包含 OpM、IpM 和 IOpM 的 TAMRA 的溶液。类似于激发光为543nm激光(500 μ W)、并且将检测波长带设置成565 595nm和650 690nm的实施例1， 使用上述样品溶液分别进行光测量和分析，并且获得各检测波长带的时序光强度数据上的与发光颗粒相对应的脉冲信号的数量和同时生成脉冲信号的数量。在这方面，在检测同时生成的脉冲信号时，当脉冲信号的峰值之间的时间在100微秒内时，将该组脉冲信号判断为同时生成脉冲信号。图10是针对样品溶液中的TAMRA的浓度，绘制根据上述处理利用各样品溶液所获得的脉冲的数量的附图。参考该附图，不包含ATT0590的样品溶液的脉冲的数量(Λ)在整个观测浓度范围内差不多与浓度成正比，并且获得根据最小二乘法的近似直线的高线性度(y截矩=0.27，均方误差R2=0.9998)。相反，在包含ATT0590的样品溶液的脉冲的数量(O)中，在低浓度范围观察不到对浓度的比例关系，并且根据最小二乘法的近似直线的线性度低(y截矩=30.92，均方误差R2=0.9898)。然而，在整个观测浓度范围内，通过从包含ATT0590的样品溶液的脉冲的数量减去同时生成脉冲信号的数量所获得的值(口)差不多与浓度成正比，并且与包含ATT0590的样品溶液的情况相比，提高了根据最小二乘法的近似直线的线性度(y截矩=10.80，均方误差R2=0.9997)。在这种情况下，认为同时生成的脉冲信号是来自ATT0590，即杂质的模型的光。因此，上述结果示出，通过从包含ATT0590的样品溶液的脉冲信号消除与ATT0590相对应的同时生成的脉冲信号，可以提高观测颗粒的TAMRA的浓度和脉冲信号之间的比例关系。也就是说，上述结果表示，在通过扫描分子计数方法检测包含杂质的样品溶液中的观测颗粒、并且测量观测颗粒的浓度的情况下，通过根据本发明的方法将同时生成脉冲信号识别为除观测对象以外的颗粒的信号、并且从数据消除这些同时生成脉冲信号，可以提高观测颗粒的检测精度及其浓度的测量精度。实施例3利用FCS对包含杂质的样品溶液中的观测颗粒的测暈已经验证，在利用FCS对包含具有与观测颗粒相同的发光波长的杂质的样品溶液中的观测颗粒进行光学分析时，通过本发明的方法提高分析结果的精度。对于样品，使用荧光染料ATT0633作为观测颗粒，并且使用利用荧光染料SYTOXOrange(Invitrogen Corp., Cat.N0.S-11368)突光标记的 DNA(质粒 pbr322, TakaraBio, Inc.，Cat.N0.3035)(荧光标记DNA)作为杂质的模型。当利用633nm的激发光激发ATT0633时，在波长带650 690nm中检测到其荧光。而且，当利用543nm的激发光激发与DNA结合的SYTOX Orange时，在波长带565 595nm和波长带650 690nm中检测到其荧光。对于样品溶液，准备在包含IOmMTris-HCl (pH8.0)的水溶液中包含IOOpM ATT0633、lpMDNA和9nM SYTOX Orange的溶液(在准备该溶液时，在室温下将混合的SYTOX Orange和DNA孵育30分钟，从而使得SYTOX Orange可以与DNA完全结合)。另外，对于对照溶液，准备没有荧光标记的DNA的包含IOOpM ATT0633的溶液。对于光测量和分析，使用单分子荧光测量设备MF_20(奥林巴斯公司)作为光学分析装置。在光测量中，使用543nm激光(300 μ W)和633nm激光(IOOyW)作为激发光，并且使用带通滤波器，对于543nm和633nm的激发光，分别同时分开测量565 596nm和650 690nm这两个波长带的光强度,从而生成543nm的激发光和633nm的激发光各自的时序光强度数据。对于每一样品溶液，进行20秒的测量2次。在这种情况下，由于在波长带650 690nm中检测到ATT0633，即观测颗粒的荧光，所以检测波长650 690nm是主测量波长带，并且检测波长565 595nm是副测量波长带。在时序光强度数据的分析中，以FCS的常用方式计算主测量波长带(检测波长650 690nm)的时序光强度数据的自相关函数，并且对自相关函数拟合下面的公式:[公式I]
权利要求
1.一种用于使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统来检测和分析来自样品溶液的光的方法，其中，所述样品溶液包含自由运动的两个以上种类的发光颗粒，所述方法的特征在于包括以下步骤: 按照波长带同时测量来自所述样品溶液中的所述光学系统的光检测区域的两个以上波长带的光的强度，以分别针对每一所述波长带生成时序光强度数据；以及 检测在两个以上的所述时序光强度数据中的至少两个波长带的时序光强度数据上同时生成的、表不来自发光颗粒的光的信号，以及 将上述同时生成的信号识别为所述两个以上种类的发光颗粒中的至少一个特定种类的发光颗粒的信号。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述两个以上波长带中的第一波长带的时序光强度数据中的表示发光颗粒的光的信号的生成期，与所述两个以上波长带中的除所述第一波长带以外的至少一个波长带的时序光强度数据中的表示发光颗粒的光的信号的生成期重叠的情况下，将所述第一波长带的时序光强度数据中的信号和除所述第一波长带以外的所述至少一个波长带的时序光强度数据中的信号检测为所述同时生成的信号。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，还包括下面的步骤:分别检测每一所述时序光强度数据中的表示来自发光颗粒的光的各信号，并且基于在所述两个以上波长带中的至少两个所选择的波长带中是否同时生成了信号，来识别发射由相应信号表示的光的每一发光颗粒的种类。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将在所述至少两个所选择的波长带中同时生成的信号，识别为所述两个以上种类的发光颗粒中的观测颗粒的信号，并且将除所述同时生成的信号以外的、表示来自 发光颗粒的光的信号，识别为除所述观测颗粒以外的发光颗粒的信号。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述两个以上波长带是两个波长带，其中，将在所述两个波长带的时序光强度数据上同时生成的信号，识别为所述观测颗粒的信号，并且将仅在所述两个波长带的时序光强度数据中的一个上所生成的、表示来自所述发光颗粒的光的信号，识别为除所述观测颗粒以外的发光颗粒的信号。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将在所述至少两个所选择的波长带中同时生成的信号，识别为所述两个以上种类的发光颗粒中的、除观测颗粒以外的发光颗粒的信号，并且将除所述同时生成的信号以外的、表示来自发光颗粒的光的信号，识别为所述观测颗粒的信号。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述两个以上波长带是两个波长带，其中，将在所述两个波长带的时序光强度数据上同时生成的信号，识别为除所述观测颗粒以外的发光颗粒的信号，并且将仅在所述两个波长带的时序光强度数据中的一个上所生成的、表示来自发光颗粒的光的信号，识别为所述观测颗粒的信号。
8.根据权利要求3 7中任一项所述的方法，其特征在于，随着通过改变所述光学系统的光路移动所述样品溶液中的所述光学系统的光检测区域的位置，进行来自所述光检测区域的两个以上波长带的光的强度的测量，并且分别在每一所述时序光强度数据中检测表示来自单个发光颗粒的光的各信号。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括下面的步骤:对分别检测到的表示来自所述单个发光颗粒的光的信号的数量进行计数。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，以预定速度移动所述光检测区域的位置。
11.根据权利要求8 10中任一项所述的方法，其特征在于，以比所述样品溶液中的发光颗粒的扩散运动速度快的速度，移动所述光检测区域的位置。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，还包括下面的步骤:基于表示来自所述样品溶液中的发光颗粒的光的信号的数量，确定所述发光颗粒的数量密度或浓度。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将在所述两个以上波长带中的至少两个所选择的波长带中同时生成的信号，识别为所述两个以上种类的发光颗粒中的除观测颗粒以外的发光颗粒的信号。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，从所述时序光强度数据中消除被识别为除所述观测颗粒以外的发光颗粒的信号的信号的生成期的数据。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，通过使用所述两个以上波长带的时序光强度数据中的、示出来自所述观测颗粒的光强度的时序光强度数据，利用荧光相关光谱分析、荧光强度分布分析方 法或荧光互相关光谱分析来进行光学分析。
全文摘要
提供一种光学分析技术，该光学分析技术使得能够使用共聚焦显微镜或多光子显微镜，通过光学测量识别与时序光强度数据上的信号相对应的发光颗粒的种类、或者识别与除观测颗粒以外的发光颗粒相对应的信号。本发明的光学分析技术同时分别测量来自包含两个以上种类的发光颗粒的样品溶液中的光检测区域的、两个以上波长带的光的强度，以生成各个波长带的时序光强度数据，检测在至少两个波长带的时序光强度数据上同时生成的信号，并且将同时生成的信号识别为至少一个特定种类的发光颗粒的信号。
文档编号G01N21/64GK103221806SQ20118004373
公开日2013年7月24日 申请日期2011年8月29日 优先权日2010年9月10日
发明者叶梨拓哉, 田边哲也, 山口光城, 中田秀孝 申请人:奥林巴斯株式会社
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