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专利名称：阳离子对称两亲性自组装多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于自组装多肽领域，具体涉及ー类阳离子对称两亲性自组装多肽及其作为抑制金黄色葡萄球菌新型纳米抗菌药物及检测微环境变化的分子传感器的应用。
背景技术：
肽分子自组装技术是近年来的研究热点，通过分子设计和固相合成等手段可以得到成千上万种结构相异的肽分子，肽分子自组装后形成的纳米尺寸材料具有广泛的潜在用途。国内外已有多肽材料应用于纳米生物医学领域的报道，包括用于3D细胞培养、组织修复、药物运输以及止血等，但目前现有技术公开的能自组装形成纳米尺寸材料用于上述领 域的多肽在结构上多具有全程或半程电荷匹配的特点(唐丽丽，何道航' 广东化工，2011，38(1) :76-79.)。对于阳离子多肽，作为具有抗菌作用的多肽有望克服临床上日益严重的细菌耐药性，国内外报道多用于构建抗菌剂。本发明设计出了一类阳离子对称两亲性自组装多肽，它们的一级结构与上述多肽不同，具有阳离子対称性，具有抗菌作用，还可以应用于检测微环境变化。

发明内容
本发明的目的在于提供一类能够自组装的阳离子对称两亲性多肽。本发明第二目的在于提供阳离子対称的两亲性自组装多肽在制备抑制金黄色葡萄球菌新型纳米抗菌药物中的应用。本发明第三目的在于提供阳离子対称的两亲性自组装多肽在制备检测微环境变化的分子传感器中的应用。本发明的目的通过以下技术方案实现一类阳离子対称的两亲性自组装多肽，其氨基酸序列的通式如下Ac-XfLeu-1le-Xg-Xg-Val-Xg-Xg-1le-Leu-XfNHg，其中 Ac 表不 N 端こ酸化，NH2 表示C端氨基化，X1. X2、X3为极性带正电荷的氨基酸，且正电荷以Val为中心点两边对称，序列中的氨基酸全为L型氨基酸。Xp X2、X3为相同或不同氨基酸均可。所述极性带正电荷的氨基酸为Arg、Lys或His。所述的阳离子对称的两亲性自组装多肽氨基酸序列优选为Ac-RLIRKVKRILR_NH2、Ac-KLIRKVKRILK-NH2、Ac-KLIKKVKKILK-NH2、Ac-HLIKKVKKILH-NH2、Ac-HLIHKVKHILH-NH2、
Ac-hlihrvrhilh-nh2、Ac-hlirrvrrilh-nh2、Ac-klirrvrrilk-nh2、ac-klikrvrkilk-nh2 或
Ac-RLIRRVRRILR-NH2。所述的阳离子对称的两亲性自组装多肽在制备抑制金黄色葡萄球菌新型纳米抗菌药物中的应用。所述的阳离子对称的两亲性自组装多肽在制备检测微环境变化的分子传感器中的应用。相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果
(I)本发明多肽自组装是其分子间通过非共价键相互作用自发组合形成一种结构明确、构造稳定、具有某种理化性能的分子聚集体或超分子结构。(2)实验表明，本发明所述阳离子対称的两亲性自组装多肽在不同的环境条件下会发生不同的结构变化，因此，此种多肽可以在制备检测微环境变化的分子传感器中应用。不同的环境条件主要指为不同肽浓度、温度、NaCl浓度、Na2SO4浓度、SDS浓度及TFE体积分数的溶液。(3)实验表明，本发明所述阳离子対称的两亲性自组装多肽对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌作用，因此，可以用于研制适于临床上使用的新型纳米抗菌药物。(4)本发明提供了ー类新型结构的自组装多肽，增加了自组装多肽的类型。(5)本发明提供了ー类新型的分子传感器、ー类新型的抗菌药物，有利于感染疾病 的预防和治疗。


图1是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的三维分子结构示意图。图2是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的高效液相(HPLC)色谱图，结果显示它的纯度是97. 4%。图3是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的质谱(MS)图，结果显示它的分子量为1491. 9。图4是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽在超纯水溶液中的原子力显微镜纳米形貌图，其中阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5的浓度是0. 4mg/ml。图5是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽在0.1M NaCl溶液中的原子力显微镜纳米形貌图，其中阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5的浓度是0. 4mg/ml。图6是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的圆二色(CD)谱图，该图表明肽浓度对阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5结构的影响。图7是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的圆二色(CD)谱图，该图表明温度对阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5结构的影响。图8是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的圆二色(CD)谱图，该图表明不同NaCl浓度对阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5结构的影响。图9是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的圆二色(CD)谱图，该图表明不同Na2S04浓度对阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5结构的影响。图10是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的圆二色(CD)谱图，该图表明不同十二烷基硫酸钠(SDS)浓度对阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5结构的影响。图11是本发明所述阳离子对称两亲性自组装多肽的圆二色(CD)谱图，该图表明不同三氟こ醇(TFE)体积分数对阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5结构的影响。图12是本发明所述不同浓度的阳离子对称两亲性自组装多肽对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小示意图，图中，1、2处的阳离子对称两亲性自组装多肽P5VP5的浓度分别为
0.lmg/ml、lmg/ml,3处是空白对照水溶液。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明作进ー步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。实施例1当X1为Arg，X2为Arg，X3为Lys时，自组装多肽①序列如下CH3CO-Arg-Leu-1Ie-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-1Ie-Leu-Arg-NH2自组装多肽①的合成1、材料Fmoc-Arg(pbf)-OH(N-荷甲氧羰酰基-2,2,4,6,7-五甲基ニ氢苯并呋喃_5_磺酰-精氨酸)、Fmoc-Leu-OH (N-荷甲氧羰酰基-亮氨酸)、Fmoc-1le-OH (N-荷甲氧羰酰基-异亮氨酸)、Fmoc-Lys (Boc)-OH(N-荷甲氧羰酰基-N'-叔丁氧羰酰基-赖氨酸)、Fmoc-Val-OH (N-荷甲氧擬酸基-纟颜氨酸)、Rink Amide-MBHA Resin (树脂)、HBTU (0-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT (1_羟基苯并三氮唑)购自杭州中肽生化有限公司；哌啶、醋酸酐、DMF (N、N-ニ甲基甲酰胺)、TFA (三氟こ酸)、NMM (N-甲基吗啉)、こ醚、甲醇、DCM (ニ氯甲烷)购自天津市富宇精细化工有限公司。2、制备方法采用Fmoc (芴甲氧羰酰基)保护的固相合成法，其エ艺步骤如下(I)称取 20g 0. 5mmol/g 的 Rink Amide-MBHA Resin 于肽合成器皿中，取 200mlDMF溶涨树脂30min，然后抽滤，再取用300mlDMF洗涤树脂，分三次进行，毎次的洗涤时间为2min，抽滤干洗涤液后向肽合成器中加入100ml20%哌啶/DMF (V V)震荡反应30min，反应结束后，再抽滤出反应液，再用400mlDMF分四次洗涤树脂，洗毕后取少量树脂做茚三酮检测试验，树脂呈阳性，向肽合成器皿中加入以下原料
Fmoc-Arg(pbf)-OH25.95g
HBTU15.16g
HOBT5.40g
NMM4.39ml
DMF160ml上述原料加完后，震荡反应30min，反应结束后，用300mlDMF分四次洗涤树脂，每次洗涤时间2分钟，取少许树脂做茚三酮试验检测，树脂呈阴性。(2)向肽合成器皿中加入5ml 20%哌啶/DMF (V V)震荡反应30min，反应结束后抽滤出反应液，再用40ml DMF分四次洗涤树脂，洗毕取少许树脂做茚三酮试验检测，结果树脂呈阳性，向反应器皿中加入以下原料(a) Fmoc-Leu-OH14. 14g(b)HBTU15. 16g(c)HOBT5. 40g(d) NMM4.39ml(e)DMF160ml上述原料加完后，震荡反应40min，反应结束后，用40mlDMF分四次洗涤树脂，每次洗涤时间为2min，取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性。(3)变换步骤(2)中的(a)原料，(b) (c) (d) (e)原料及加入量不变，重复步骤
(2)的操作；(a)原料依次替换为 Fmoc-1le-OH (14. 14g)、Fmoc_Arg (pbf) -OH (25. 95g)>Fmoc-Lys(Boc)-OH (18. 74g)> Fmoc-Val-OH (13. 58g)> Fmoc-Lys(Boc)-OH (18.74g)>Fmoc-Arg (pbf) -OH (25. 95g)、Fmoc-1le_0H (14. 14g)、Fmoc-Leu_0H (14. 14g)、Fmoc_Arg(pbf)-OH (25. 95g)。即每重复一次步骤(2)的操作，变换ー种(a)原料，直至将上述原料都使用一次为止；(4)再重复一次(I) (2) (3)步骤的操作，各步骤的原料及所用原料的量均不变；最后ー个Arg合成结束后，脱出Fmoc-保护基，加入20%哌啶/DMF (V V)反应30min，洗净树脂，加入160ml 50%醋酸酐/DMF (V V)反应30min，用40ml DMF洗净树脂，再用甲醇洗涤树脂8次，除去DMF。氮气吹干后，用TFA (三氟こ酸)/DCM强酸裂解液，裂解3小吋，将合成多肽从树脂上裂解下来，同时脱去所有保护基团，收集溶有合成肽的裂解液，然后减压过滤，收集滤液，用冷こ醚沉淀溶解在滤液中的多肽，再抽滤得到白色固体，即得合成肽的粗品。合成肽粗品经HPLC (高效液相色谱)纯化，收集主峰，经过冷冻干燥后，即得到目标合成肽。3、本发明所述其他的阳离子对称两亲性自组装多肽可以通过替换上述I中的氨基酸，按照上述2所述制备方法合成纯化得到。在此过程中不同的合成实验參数如下表I所示表I本发明所述部分阳离子对称两亲性自组装多肽的不同合成实验參数
权利要求
1.一类阳离子对称的两亲性自组装多肽，其特征在于，其氨基酸序列的通式如下 Ac-X1-Leu-1le_X2_X3_Val_X3_X2_IIe-Leu-X1HMH2,其中 Ac 表不 N 端乙酸化，NH2 表不 C端氨基化，XpX2、X3为相同或者不同的极性带正电荷的氨基酸，且正电荷以Val为中心点两边对称，序列中的氨基酸全为L型氨基酸。
2.根据权利要求1所述的阳离子对称的两亲性自组装多肽，其特征在于，所述极性带正电荷的氨基酸为Arg、Lys或His。
3.根据权利要求1所述的阳离子对称的两亲性自组装多肽，其特征在于，其氨基酸序列优选为 Ac-RLIRKVKRILR-NH2、Ac-KLIRKVKRILK-NH2、Ac-KLIKKVKKILK-NH2、Ac-hlikkvkkilh-nh2、Ac-hlihkvkhilh-nh2、Ac-hlihrvrhilh-nh2、Ac-hlirrvrrilh-nh2、Ac-KLIRRVRRILK-NH2、Ac-KLIKRVRKILK-NH2 或 Ac-RLIRRVRRILR-NH2。
4.权利要求1中所述的阳离子对称的两亲性自组装多肽在制备抑制金黄色葡萄球菌新型纳米抗菌药物中的应用。
5.权利要求1中所述的阳离子对称的两亲性自组装多肽在制备检测微环境变化的分子传感器中的应用。
全文摘要
本发明公开了阳离子对称两亲性自组装多肽及其应用，其氨基酸序列的通式如下Ac-X1-Leu-Ile-X2-X3-Val-X3-X2-Ile-Leu-X1-NH2，其中X1、X2、X3为极性带正电荷的氨基酸，且正电荷以Val为中心点两边对称，序列中的氨基酸全为L型氨基酸。本发明阳离子对称的两亲性自组装多肽对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌作用，可用于研制新型纳米抗菌药物。此外，本发明所述的阳离子对称两亲性自组装多肽可作为分子传感器用于检测微环境的变化。
文档编号G01N33/68GK103012558SQ20121021967
公开日2013年4月3日 申请日期2012年6月28日 优先权日2012年6月28日
发明者何道航, 观富宜 申请人:华南理工大学