专利名称：固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法
技术领域：
本发明涉及牛奶中香兰素、乙基香兰素和香豆素的检测方法，具体涉及一种固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法。
背景技术：
近年来中国乳品行业发展迅猛，市场上存在品种和规格各式各样的纯牛奶。市场上这些乳品的奶源质量参差不齐，很多乳品企业为平衡季节造成的奶源供应短缺、奶源质量参差不齐、满足消费者口味需求，在纯牛奶产品中添加奶味香精等食品添加剂。而根据我国现行的乳品生产标准GBM08. 2-1999规定纯牛奶，包括巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳，是以生鲜牛乳为原料、不得添加任何辅料、经过高温瞬时灭菌、无菌罐装而制成达到“商业无菌”要求的液态产品。目前，香兰素、乙基香兰素和香豆素是最重要的香料之一，用作粉底香料，几乎用于所有香型。因此牛奶中香兰素、乙基香兰素和香豆素的检测对于评价牛奶中是否添加了食用添加剂是一个重要的指标。目前，香兰素的检测方法有高效液相色谱法、紫外光光度法、电化学法、毛细管电泳法、气相色谱峰、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等，但目前并无牛奶中香兰素、乙基香兰素和香豆素的同时检测。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供了一种固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法，能够对牛奶中香兰素、乙基香兰素和香豆素同时进行测定，该方法具有准确、快速、灵敏度高的优点，为牛奶的快速检测提供了可靠的分析平台。为了实现上述目的，本发明的固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法包括以下步骤
①超声萃取称取牛奶1.7 2. 3g，加入0. 8 1. 5mL13C标记的香兰素和0. 8 1. 5mL 5，6，7，8-D4标记的香豆素，所述"C标记的香兰素的浓度为500 μ g/L，所述5，6，7，8-D4标记的香豆素的浓度为500 μ g/L,再加入17 23mL的甲醇/水混合溶液，在27 33°C下超声处理25 35min，超声频率为36 38kHz，取出静置，取上层清液，定容，得到待净化液；
②固相萃取净化取C18SPE柱，依次用甲醇和水活化SPE柱，取4 6mL待净化液至SPE 柱，再依次用4 6mL水和4 6mL甲醇/水混合溶液淋洗SPE柱，，将SPE柱真空抽干，用 8 12mL的甲醇/水混合溶液对SPE柱进行洗脱，得到洗脱液，将洗脱液过微孔滤膜，备用；
③标准溶液的配置取香兰素，分别配置1.0,2. 0,5. 0,10. 0,20. 0浓度为50 μ g/L的混合标准工作溶液，取乙基香兰素，分别配置1. 0,2. 0,5. OUO. 0、20. 0浓度为50 μ g/L的混合标准工作溶液，取香豆素，分别配置1. 0,2. 0,5. 0,10. 0,20. 0浓度为50 μ g/L的混合标准工作溶液，取13C标记的香兰素，分别配置1. 0,2. 0,5. 0、10. 0,20. 0浓度为10 μ g/L的混合标准工作溶液，取5，6，7，8-D4标记的香豆素，分别配置1. 0,2. 0,5. 0、10. 0,20. 0浓度为 10 μ g/L的混合标准工作溶液；
③标准溶液的配置取香兰素、乙基香兰素、香豆素、1V标记的香兰素和5，6，7，8-D4标记的香豆素，用甲醇/水混合溶液分别配制成质量浓度为100mg/L的单标储备液，进行测定使用时，用甲醇/水混合溶液，甲醇/水混合溶液中甲醇与水的比例为1:1，稀释上述标准储备液，将香兰素、乙基香兰素、香豆素分别配制成1. 0，2. 0，5. 0，10. 0，20. 0，5(^g/L的混合标准工作溶液，同时将"C标记的香兰素和5，6，7，8-D4标记的香豆素配制成1. 0，2. 0，5. 0， 10. 0,20.0,10μ§/1的混合标准工作溶液；
④测定将过0.45 μ m微孔滤膜厚的洗脱液进入LC-MS/MS，多反应监测模式检测，即 MRM，并采用内标法定量。作为优�。龅牟街琚僦械募尤氲募状�/水混合溶液中甲醇与水的体积比为 1:1。作为优�。龅牟街琚谥械牧芟碨PE柱所用的甲醇/水混合溶液中甲醇与水的体积比为2:8，洗脱所用的甲醇/水混合溶液中甲醇与水的体积比为1:1。作为优�。龅牟街琚谥形⒖茁四の�0. 45 μ m微孔滤膜。作为优�。龅腖C-MS/MS的色谱条件如下
色谱柱:ffaters XBridge C18 反相柱，规格为 2. 1X150 mm, 3. 5 μ m ； 流速300μ L/min ；
流动相A为0. 1%甲酸的水溶液，B为乙腈。A与B的体积比为55:45 ； 等度洗脱时间5min ； 进样量:5μ L ； 色谱柱温度25 35°C。作为优�。龅腖C-MS/MS的质谱条件如下 电喷雾离子源正离子扫描，电喷雾电压为5000V ； 离子源温度540 560°C ；
雾化气压力为47 53psi ； 辅助气流速为38 42 psi ； 气帘气压力为9 11 psi ； 碰撞气压力为18 22 psi。本发明的固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法建立了高效液相色谱-电喷雾串联四级杆质谱法同时测定牛奶中香兰素、乙基香兰素和香豆素的检测方法，样品用甲醇/水混合溶液超声提�。崛∪芤壕瑿18固相萃取柱净化，使用Cw反相柱分离；在等度条件下分析，目标分析物在多反应监测模式下以保留时间和离子对信息比较进行定性分析，内标法定量，本方法分析速度快、灵敏度高、 重现性好，为评价牛奶样品质量提供了新的检测方法。
图1为本发明实施例香兰素的二级质谱图2为本发明实施例13C-标记香兰素的二级质谱图；图3为本发明实施例乙基香兰素的二级质谱图； 图4为本发明实施例香豆素的二级质谱图； 图5为本发明实施例5，6，7，8-D4标记香豆素的二级质谱图； 图6为本发明实施例香兰素、乙基香兰素和香豆素浓度为2 μ g/L的标准品的总离子流图。
具体实施例方式本发明的实施例具体是一种固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法，该方法包括以下步骤
①超声萃取称取牛奶2.Og,加入ImLuC标记的香兰素和ImL 5，6，7，8-D4标记的香豆素，13C标记的香兰素的浓度为500 μ g/L, 5，6，7，8-D4标记的香豆素的浓度为500 μ g/L,再加入20mL的甲醇/水混合溶液，加入的甲醇/水混合溶液中甲醇与水的体积比为1:1。在 30°C下超声处理30min，超声频率为37kHz，取出静置，取上层清液，定容，得到待净化液；
②固相萃取净化取C18SPE柱，依次用甲醇和水活化SPE柱，取5mL待净化液至SPE柱， 再依次用5mL水和5mL甲醇/水混合溶液淋洗SPE柱，淋洗SPE柱所用的甲醇/水混合溶液中甲醇与水的体积比为2:8。再将SPE柱真空抽干，用8 12mL的甲醇/水混合溶液对 SPE柱进行洗脱，洗脱所用的甲醇/水混合溶液中甲醇与水的体积比为1 1，得到洗脱液，将洗脱液过0. 45 μ m微孔滤膜，备用；
③标准溶液的配置取香兰素，分别配置1.0,2. 0,5. 0,10. 0,20. 0浓度为50 μ g/L的混合标准工作溶液，取乙基香兰素，分别配置1. 0,2. 0,5. 0,10. 0,20. 0浓度为50 μ g/L的混合标准工作溶液，取香豆素，分别配置1. 0,2. 0,5. 0、10. 0,20. 0浓度为50 μ g/L的混合标准工作溶液，取13C标记的香兰素，分别配置1. 0,2. 0,5. 0、10. 0,20. 0浓度为10 μ g/L的混合标准工作溶液，取5，6，7，8-D4标记的香豆素，分别配置1. 0,2. 0,5. 0,10. 0,20. 0浓度为 10 μ g/L的混合标准工作溶液；
③标准溶液的配置取香兰素、乙基香兰素、香豆素、1V标记的香兰素和5，6，7，8-D4标记的香豆素，用甲醇/水混合溶液分别配制成质量浓度为100mg/L的单标储备液，进行测定使用时，用甲醇/水混合溶液，甲醇/水混合溶液中甲醇与水的比例为1:1，稀释上述标准储备液，将香兰素、乙基香兰素、香豆素分别配制成1. 0，2. 0，5. 0，10. 0，20. 0，5(^g/L的混合标准工作溶液，同时将"C标记的香兰素和5，6，7，8-D4标记的香豆素配制成1. 0，2. 0，5. 0， 10. 0,20.0,10μ§/1的混合标准工作溶液；
④测定将过0.45 μ m微孔滤膜厚的洗脱液进入LC-MS/MS，多反应监测MRM模式检测， 内标法定量。LC-MS/MS的色谱条件如下
色谱柱采用Waters XBridge C18反相柱，规格为2. 1 X 150 mm, 3. 5 μ m。流动相为=A 为0. 1%甲酸的水溶液，B为乙腈。A与B的体积比为55:45。等度洗脱时间为5 min。流速为300 yL/min;进样量为5 yL，柱温30°C。LC-MS/MS的质谱条件如下
电喷雾离子源正离子扫描；离子源温度为550°C。电喷雾电压为5000V ；雾化气(GSl) 压力50psi ；辅助气流速(GS2) 40 psi ；气帘气压力IOpsi ；碰撞气CAD20psi。
6
本发明在进行色谱柱的选择时，选用了不同厂家的C8和C18色谱柱，选用了 ZORBAX Eclipse Plus C18 2.1X 150 mm, 3. 5 μ m ； ZORBAX Eclipse Plus C8 2. 1X 150 mm, 3. 5 ym ； Waters Symmetry column C18 2. 1X 150 mm, 3. 5 μ m ；Waters X BridgeTM C18 2. 1X 150 mm, 3.5 μ m进行实验。结果表明，Waters XBridgeTM Cw反相柱能够保证香兰素、乙基香兰素和香豆素良好的分离，且峰形尖锐，分析时间较短。进行流动相的选择时，考察了甲醇/水、乙腈/水混合溶剂体系以及添加了 0. 1% 甲酸、0. 1%乙酸、5 mmoL/L乙酸铵、lOmmoL/L乙酸铵等溶液为流动相对香兰素、乙基香兰素和香豆素的色谱行为和离子化程度的影响。发现采用0. 1%甲酸的水溶液/乙腈为流动相等度洗脱时，体积比为55 45，在;3min内即可完成香兰素、乙基香兰素和香豆素的分离，获得了最优的色谱分离效果和质谱信号响应，见图6。提取溶剂的优化本实验选用了甲醇/水混合溶液、乙醇/水混合溶液、乙醇和甲醇作为提取溶剂进行提�。渲屑状�/水中甲醇和水的比例为1 1，乙醇/水混合溶液中乙醇与水的比例为1:1，比较了各提取剂的提取效率。结果发现，以体积比为1:1的甲醇/水为提取溶剂的提取效果较好，能够同时保证香兰素、乙基香兰素和香豆素的回收率较高。固相萃取吸附剂的选择，本发明采用不同厂家的C18 SPE柱，VARIAN BOND ELUT PLEXA C18, Supelclean Envi-18、Supelclean LC-18作为吸附剂的固相萃取净化处理效果，比较了各固相萃取吸附剂的萃取效率。结果发现，对香兰素、乙基香兰素和香豆素而言， VARIAN BOND ELUT PLEXA C18 SPE柱的净化处理效果较好，其加标回收率结果基本都能满足要求。本发明实施例中，香兰素和乙基香兰素购自ChromaDex公司，纯度彡97%，13C-标记的香兰素即 HOC6H3 (OCH3) *CH0 购自 Cambridge Isotope Laboratories, he 公司，纯度彡97%,香豆素和5，6，7，8-D4标记的香豆素购自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，纯度彡98%。 使用时，用甲醇/水混合溶液配制成质量浓度为100mg/L的储备液；实用的甲醇/水混合溶液的体积比为1:1。⑤结果及分析 (1)质谱分析参数见表1
表1香兰素、乙基香兰素、香豆素、香兰素内标和香豆素内标的质谱分析参数
权利要求
1.一种固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法，其特征在于该方法包括以下步骤①超声萃取称取牛奶1.7 2. 3g，加入0. 8 1. 5mL13C标记的香兰素和0. 8 1. 5mL 5，6，7，8-D4标记的香豆素，所述"C标记的香兰素的浓度为500 μ g/L，所述5，6，7，8-D4标记的香豆素的浓度为500 μ g/L,再加入17 23mL的甲醇/水混合溶液，在27 33°C下超声处理25 35min，超声频率为36 38kHz，取出静置，取上层清液，定容，得到待净化液；②固相萃取净化取VARIANBOND ELUT PLEXA C18SPE柱，依次用甲醇和水活化SPE柱， 取4 6mL待净化液至SPE柱，再依次用4 6mL水和4 6mL甲醇/水混合溶液淋洗SPE 柱，，将SPE柱真空抽干，用8 12mL的甲醇/水混合溶液对SPE柱进行洗脱，得到洗脱液， 将洗脱液过微孔滤膜，备用；③标准溶液的配置取香兰素、乙基香兰素、香豆素、1V标记的香兰素和5，6，7，8-D4标记的香豆素，用甲醇/水混合溶液分别配制成质量浓度为100mg/L的单标储备液，进行测定使用时，用甲醇/水混合溶液，甲醇/水混合溶液中甲醇与水的比例为1:1，稀释上述标准储备液，将香兰素、乙基香兰素、香豆素分别配制成1. 0，2. 0，5. 0，10. 0，20. 0，5(^g/L的混合标准工作溶液，同时将"C标记的香兰素和5，6，7，8-D4标记的香豆素配制成1. 0，2. 0，5. 0， 10. 0,20.0,10μ§/1的混合标准工作溶液；④测定将过0.45 μ m微孔滤膜厚的洗脱液进入LC-MS/MS，采用多反应监测(MRM)模式检测，内标法定量。
2.根据权利要求1所述的固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法，其特征在于所述的步骤①中的加入的甲醇/水混合溶液中甲醇与水的体积比为1:1。
3.根据权利要求1所述的固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法，其特征在于所述的步骤②中的淋洗SPE柱所用的甲醇/水混合溶液中甲醇与水的体积比为2:8，洗脱所用的甲醇/水混合溶液中甲醇与水的体积比为 1:1。
4.根据权利要求1所述的固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法，其特征在于所述的步骤②中微孔滤膜为0. 45 μ m微孔滤膜。
5.根据权利要求1所述的固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法，其特征在于所述的LC-MS/MS的色谱条件如下色谱柱=Waters XBridge C18反相柱，色谱柱规格为2. 1X150 mm, 3. 5 μ m ；流速300μ L/min ；流动相A为0. 1%甲酸的水溶液，B为乙腈，A与B的体积比为55:45 ；等度洗脱时间5min ；进样量:5μ L ；色谱柱温度25 35°C。
6.根据权利要求1所述的固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法，其特征在于所述的LC-MS/MS的质谱条件如下电喷雾离子源正离子扫描，电喷雾电压为5000V ；离子源温度540 --560 0C ；雾化气压力为47〃 53psi ；辅助气流速为38广 42 psi ；气帘气压力为9 ‘11 psi ；碰撞气压力为18- 22 psi。
全文摘要
本发明公开了一种固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法，建立了高效液相色谱-电喷雾串联四级杆质谱法同时测定牛奶中香兰素、乙基香兰素和香豆素的检测方法。本发明的方法能够同时测定牛奶中香兰素、乙基香兰素和香豆素，样品用甲醇/水混合溶液超声提�。崛∪芤壕瑿18固相萃取柱净化，使用C18反相柱分离；在等度条件下分析，目标分析物在多反应监测模式下以保留时间和离子对信息比较进行定性分析，内标法定量，本方法分析速度快、灵敏度高、重现性好，为评价牛奶样品质量提供了新的检测方法。
文档编号G01N30/89GK102507833SQ201110350198
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者刘滨, 刘翠平, 朱振瓯, 陈祥准, 韩超 申请人:韩超
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