专利名称：血管紧张素ii酶联免疫吸附测定试剂盒的制作方法
技术领域：
血管紧张素11酶联免疫吸附测定试剂盒技术领域[0001]本实用新型涉及生物技术领域，尤其涉及一种血管紧张素II(AngII)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。
背景技术：
[0002]肾素-血管紧张素系统(RAQ在调节血压、电解质及体液平衡等生理功能中发挥重要作用。血管紧张素原(AGT)主要由肝脏合成并释放入血，在肾素的作用下生成10肽化合物，即血管紧张素I (AngI)，AngI在血管紧张素转换酶(ACE)作用下生成8肽Angll，后者再通过ACE作用产生7肽的AngIII。其中AngII是RAS的主要效应分子，通过作用于血管紧张素II受体1 (ATI)和AT2受体，在调节血压、管球反馈、肾小管对水钠的重吸收、肾脏发育及心血管疾病的发生发展中占有重要地位。病理状态下，AngII在高血压、动脉粥样硬化以及继发性的心室肥厚等进程中发挥重要作用；同时，在糖尿病患者中，AngII可以直接或间接地抑制胰岛素信号途径，加重胰岛素抵抗。同时，该物质也可作为预测糖尿病患者发生心血管事件的危险因素。[0003]噬菌体展示技术是以噬菌体为载体，将完整的抗体可变区片段定向插入噬菌体外壳蛋白基因区，使其产物表达并展示于噬菌体表面，通过吸附-洗脱-扩增的重复过程，筛选获得表达与已知抗原特异性结合的scFv片段的噬菌体，并通过基因改造使其成为完整抗体，改造后的抗体即可作为制备ELISA试剂盒的原料。由于目前商业化的噬菌体抗体库库容可达IOici-IO11,使得筛选成功率大大增加，可应用在制备许多难以通过免疫动物获得的抗体中。[0004]目前评价AngII的直接方法有高效液相色谱法(HPLC)、放射免疫法(RIA)以及酶联免疫吸附法(ELISA)。其中高效液相色谱法检测范围一般在2.5-500pg/ml，样本回收率在90%以上。但是该方法存在的缺陷也是非常明显的，存在检测仪器费用高、操作繁琐、样本需要前处理等缺点。放射免疫法检测灵敏度较高，但是由于应用到放射性物质， 对于实验室的要求较高，且实验废液难处理。相比之下，ELISA法操作简便，不需大型仪器，同时由于亲和素-生物素放大的系统的应用，极大的提高了其灵敏度。制备ELISA和 RIA试剂盒的重要原料就是针对AngII的特异性抗体。传统的抗体制备方法是通过免疫动物，获取能产生抗体的B淋巴细胞，在与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞后，通过筛选得到能产生高亲和力抗体的单克隆B细胞，再免疫动物生成富含抗体的腹水。该方法技术成熟，但操作较繁琐，且对抗原的免疫原性要求高。由于AngII仅含8个氨基酸，其序列为 Asp-Arg-Val-Tyr-11 e-His-Pro-Phe,分子量为1046. 2，免疫原性较弱，不易通过免疫动物获得抗体。[0005]抗体是决定ELISA试剂盒质量的关键因素，其亲和力、特异性直接关系到试剂盒的灵敏度、准确性以及精确性。因此，有必要选用一种简单有效的方法来获得高质量的抗体。该技术要解决的关键问题是从噬菌体库中筛选针对AngII特异性的scFv段。由于AGT 的降解产物有3个，依次为AngI，AngII和Anglll，每种之间只有1_2个氨基酸的差别，因此筛选的抗体要避免与AngII之外的2种片段的交叉反应。为此，在对噬菌体进行常规的正向选择并富集之后，再进行负向选择去除能与AngI和AngIII结合的抗体，此举可保证最后所得抗体与这两个类似物无交叉反应或反应极弱，对保证试剂盒检测准确性至关重要。[0006]其次，噬菌体库表达的仅为抗体的scFv片段，不具备传统抗体的双价结合结构， 抗原结合力较弱。为此，通过将AngII scFv和IgG3上游铰链区/p53四聚功能域的基因融合，利用P53四聚功能域表达产物将AngII scFv抗体装配成四聚体，可同时结合四个抗原表位，且在空间位点上不会相互干扰，由此获得的抗体可用于制备抗AngII的ELISA试剂品.ο实用新型内容[0007]本实用新型的目的是提供一种血管紧张素II酶联免疫吸附测定试剂盒，包括盒盖、内部的酶标板和盒体，其中酶标板包括固相载体和包被层，固相载体为设置有多个微孔的微孔板，包被层附着在所述固相载体的微孔表面，包被层是由AngII和牛血清白蛋白依次涂布在固相载体的微孔表面上形成的复合层。[0008]优选的，上述固相载体为96孔聚苯乙烯试剂板。[0009]优选的，上述固相载体为48孔聚苯乙烯试剂板。[0010]优选的，上述固相载体为60孔聚苯乙烯试剂板。[0011]本实用新型利用噬菌体抗体展示技术来筛选获得高亲和力的AngII抗体，然后将其应用于ELISA试剂盒的制备和生产中。该技术模拟了机体体液免疫系统的选择作用，呈现在噬菌体表面的具有不同可变区的抗体通过固相化抗原进行筛�。檬删宥源蟪Ω司母腥竞偷鞍妆泶锟焖倩袢√匾煨钥固�。[0012]与传统方法相比，该方法能在短期内获得特异性高、亲和力高的抗体，且经筛选获得的噬菌体可以长期保存，在传代中亦可保持基因结构的稳定性。抗体是ELISA试剂盒的重要原料，高质量的抗体可以保证试剂盒的高品质，尤其是试剂盒的特异性、灵敏度等方面会有很大的改善。
[0013]图1是本实用新型酶标板结构示意图；[0014]图2是本实用新型酶标板剖视图；[0015]图3是本实用新型试剂盒结构示意图；[0016]图4是本实用新型AngII的ELISA试剂盒标准曲线图。[0017]图中1-固相载体；2-微孔；3-包被层；4-盒盖；5-酶标板；6_盒体。
具体实施方式
[0018]
以下结合附图对本实用新型作进一步描述。[0019]本实用新型提供的血管紧张素II酶联免疫吸附测定试剂盒制备的主要的技术路线如下[0020]1.抗AngII特异性抗体的正向筛选[0021]购买商业化构建好的噬菌体抗体库，并进行菌液培养进行噬菌体表面呈现。以目的抗原，即AngII对抗体库进行筛�。冉固蹇庥階ngII相互作用，使其充分结合，接着洗涤除去非特异结合噬菌体，最后将特异性结合噬菌体洗脱下来扩增，然后再进入下一轮的淘选。一般需要重复2-3轮淘选-洗脱-扩增的过程，最终淘选出亲和力高的特异结合 AngII的噬菌体抗体。[0022]2.抗AngII特异性抗体的负向筛选[0023]具体操作与正向筛选相似，不同的是分别在固相载体上包被AngI和Anglll，然后将上一步收获的表达AngII抗体的噬菌体与固相抗原孵育，洗脱后收集洗脱液，即未与 AngI和AngII结合的噬菌体，再次扩增获得与AngI和III无交叉反应的抗体展示噬菌体。[0024]3.抗AngII抗体scFv的改造[0025]由于选用的抗体库为scFv库，筛选所得抗体只有一个抗原结合区，抗原结合力较弱，需要进一步改造。通过AngII scFv和IgG3上游铰链区/p53四聚功能域的基因融合由于该基因表达产物能自动组装成四聚体，相应的成为四价抗体，可明显的提高对抗原的结合力。将含融合基因的质粒转染至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，扩增培养后采用亲和层析法纯化目的抗体，并通过Western-Blot和ELISA等方法对其亲和性和特异性进行鉴定。[0026]4. ELISA试剂盒的研制[0027]本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定血清或血浆样本中AngII的水平。制备过程如下使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的AngII，4°C过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。检测时，依次加入待测标本及生物素化的AngII 抗体，形成酶标板上包被的AngII和标本中的AngII竞争结合抗AngII抗体的局面，再通过亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)放大信号，以3，3' ,5,5'-四甲基联苯胺(Tiffi)及硫酸分别作为底物及终止液，完成血管紧张素II酶联免疫吸附测定试剂盒的制备。[0028]ELISA试剂盒较RIA试剂盒有诸多优点，通过与Phoenix Pharmaceuticals, Inc. 生产的RIA试剂盒进行比较，可见其操作更简单、无需特殊的实验条件且对环境和操作人员影响�。视糜谄胀ㄊ笛槭业挠τ�。[0029]ELISA试剂盒与RIA试剂盒比较结果如表1所示。[0030]ELISA试剂盒RIA试剂盒样本前处理不需抽提样本中多肽所需样本量50ulIml[0031]
权利要求1.一种血管紧张素II酶联免疫吸附测定试剂盒，包括盒盖G)、内部的酶标板(5)和盒体(6)，其中酶标板( 包括固相载体(1)和包被层(3)，其特征在于所述固相载体(1) 为设置有多个微孔的微孔板O)，所述包被层(3)附着在所述固相载体(1)的微孔表面，所述包被层C3)是由AngII和牛血清白蛋白依次涂布在固相载体(1)的微孔表面上形成的复I=I te ο
2.根据权利要求1所述的血管紧张素II酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征是，所述固相载体(1)为96孔聚苯乙烯试剂板。
3.根据权利要求1所述的血管紧张素II酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征是，所述固相载体(1)为48孔聚苯乙烯试剂板。
4.根据权利要求1所述的血管紧张素II酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征是，所述固相载体(1)为60孔聚苯乙烯试剂板。
专利摘要本实用新型提供了一种血管紧张素II酶联免疫吸附测定试剂盒，包括盒盖(4)、内部的酶标板(5)和盒体(6)，其中酶标板(5)包括固相载体(1)和包被层(3)，固相载体(1)为设置有多个微孔的微孔板(2)，包被层(3)附着在所述固相载体(1)的微孔表面，包被层(3)是由AngII和牛血清白蛋白依次涂布在固相载体(1)的微孔表面上形成的复合层。固相载体(1)为96孔聚苯乙烯试剂板。本实用新型通过噬菌体抗体展示的方法筛选得到与AngII结合的抗体片段，并通过负向筛选去除与AngI和AngIII交叉结合的抗体，由此进一步提高了抗体的特异性。
文档编号G01N33/535GK202305538SQ20112042700
公开日2012年7月4日 申请日期2011年10月18日 优先权日2011年10月18日
发明者何峰容, 李华渊, 杨娟, 汪景, 章秀波 申请人:武汉优尔生科技股份有限公司
专业数控铣床产品供应商
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